富鍺溫泉水改善4T1乳腺癌荷瘤小鼠免疫抑制狀態(tài)的作用研究

駱啟晗 潘珍珍 石榮珍 高建莉

溫泉是一種由地殼深處受地熱作用而從地下自然涌出來的泉水[1]，泉水溫度超過25 ℃，富含多種礦物質元素，如鉀、鈣、鈉等，以及氡、鐳等放射性元素，且溫泉水中的二氧化碳、硫化氫等氣體也具有醫(yī)療價值[2]。溫泉水浴對多種疾病都有明顯的療效。相關研究認為溫泉水浴可降低個體血壓及血糖、血脂水平，輔助治療糖尿病并發(fā)癥，還可治療呼吸道疾病、頑固性皮膚病，緩解類風濕性關節(jié)炎癥狀等[3]。

鍺(Ge)是一種具有多種生物活性的微量元素，對人體具有廣泛的防病治病等功效，被科學家稱為“21世紀的救命鍺”“生命的奇效元素”[4]。鍺對于免疫調節(jié)、癌癥預防、慢性肝炎治療等都具有積極作用。五沒食子酰葡萄糖鍺(PGG-Ge)對人乳腺癌細胞MCF7等6種腫瘤細胞的增生均具有明顯的抑制作用[5]；Ge-132能夠有效抑制3LL肺癌細胞的遷移和生長；合成抗壞血酸有機鍺倍半氧化物能夠抑制S-180肉瘤的生長, 其能效可以達到與廣譜抗癌藥物環(huán)磷酰胺相當?shù)乃?；合成多酚鍺也能夠有效地抑制HepG2腫瘤細胞的生長[6]。鍺元素在自然界分布廣泛，在許多地區(qū)的礦泉水及地下水都發(fā)現(xiàn)含鍺。本實驗所使用的溫泉水樣本取自福建省清流縣天芳悅潭，經ICP-MS檢測，鍺含量為0.01 mg/L，通過研究富鍺溫泉水對4T1乳腺癌荷瘤小鼠的腫瘤生長、轉移的抑制作用及機體免疫功能的影響，明確其對乳腺癌荷瘤機體的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株 4T1 小鼠乳腺癌細胞株，由中國科學院細胞庫提供。采用DMEM培養(yǎng)基(添加NaHCO31.5 g/L，青霉素1×105U/L、鏈霉素100 mg/L)90%，優(yōu)質胎牛血清 (批號：A66E00F，Gemini，美國)10%在37 ℃、飽和濕度及5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.2 藥物、試劑及儀器 注射用環(huán)磷酰胺(CTX)(江蘇盛迪醫(yī)藥公司，批號14120525，規(guī)格200 mg/瓶，Milli-Q水配成0.67 mg/mL，-20 ℃保存)；黃芪購于浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院(浙江省中醫(yī)院)中藥房，70%乙醇回流提取，冷凍干燥后，制備成浸膏。臨用前生理鹽水稀釋灌胃給藥。溫泉水樣本取自福建省清流縣天芳悅潭，經ICP-MS檢測，鍺含量為0.01 mg/L，水樣采用0.22 μm微孔濾膜過濾后-20 ℃保存，臨用前解凍。細胞培養(yǎng)瓶T75(Nunc，批號：7133428)；DMEM高糖培養(yǎng)液[賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司，批號：8117065]；0.25%Trypsin & 0.25%胰酶溶液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司，批號：2017052601)；胎牛血清(GEMINI， 批 號：A66E00F)；0.4% 臺 盼 藍 溶 液(Solarbio，上海索萊寶科技有限公司，批號：20120906)；異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號：204141201)；甲醛溶液(上海凌峰化學試劑有限公司，批號：20170109)；PBS緩沖液 (索萊寶，批號：113I0227)；碳酸氫鈉NaHCO3(SIGMA，批號：SLBK6477V)；ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號：)生理鹽水(江蘇蘇中藥業(yè)集團股份有限公司，批號：15012406)。熒光倒置顯微鏡(尼康)；血球計數(shù)板(玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠)；小動物吸入式麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；超凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo scientific)；低速大容量多管離心機(上海安亭科學儀器廠)；全自動血液分析儀(希森美康株式會社)。小鼠手術器械包購自世界精密儀器有限公司(美國，批號03-D)；0.1 mL滅菌注射器，由上海奧爾科特生物科技有限公司提供；游標卡尺購自上海美耐特實業(yè)有限公司。

1.3 BALB/c小鼠乳腺癌模型的建立 BALB/c小鼠購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，許可證號碼：SCXK(滬)2013-0016，4～6周齡雌性小鼠，體質量(18±2)g，SPF級，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，自由飲食，維持12 h/12 h明暗周期。適應性喂養(yǎng)一周后，選取健康BALB/c小鼠36只，氣麻機2%的異氟烷麻醉小鼠后，除空白對照組外的小鼠均于右側倒數(shù)第二對乳腺脂肪墊下接種1×107/只4T1細胞懸液，每只注射100 μL細胞懸液，制備小鼠4T1乳腺癌荷瘤模型。

1.4 動物分組及給藥方法 造模成功后，采用完全隨機分組法將雌性BALB/c小鼠分為模型組、CTX組、溫泉水組、黃芪對照組，每組8只，另設未造模小鼠8只為正常組。造模48 h后，模型組皮下注射給予質量濃度為0.009 g/mL的生理鹽水200 μL/次/只，CTX組腹腔注射給予CTX 100 mg/kg，黃芪對照組灌胃給予30 mg/kg的黃芪提取物，溫泉水組皮下注射給予200 μL/次/只。每3 d給藥一次，連續(xù)給藥28 d。實驗期間小鼠自由采食飲水。

1.5 腫瘤體積、瘤重及腫瘤生長曲線檢測 荷瘤小鼠造模第5天用游標卡尺第一次測量瘤體長徑L(mm)和短徑W(mm)，之后每5 d檢測一次，根據(jù)公式：V＝(L＋W)(L)(W)(0.261 8)，計算瘤體積V(mm3)，繪制腫瘤生長曲線。給藥28 d后，小鼠脫頸椎處死。剖取移植瘤，并計算腫瘤指數(shù)(腫瘤指數(shù)＝單個瘤重/小鼠體質量)；抑瘤率(%)＝(1－治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。

1.6 胸腺、淋巴結、脾臟、肺重量及指數(shù)檢測 解剖小鼠取肺、胸腺、脾、腋下淋巴結。稱重拍照、分別計算各個臟器系數(shù)。臟器指數(shù)＝臟器重量/小鼠體質量。

1.7 血常規(guī)及ELISA法 末次給藥2 h后，取血，血常規(guī)檢測各組小鼠血液內的紅細胞數(shù)量(RBC)、白細胞數(shù)量(WBC)、血紅蛋白(HGB)等16項血液學指標。采用ELISA試劑盒測定小鼠血清中血清白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)水平。

1.8 血涂片 取3 μL左右的血置于載玻片上，將推玻片與載玻片保持30°角，置于血滴正前方，稍微后移，血液沿推玻片散開后，勻速向前推玻片，至血液鋪完血膜為止。待血膜干透后，將載玻片置于染色架上，滴加瑞氏染液試劑一3～5滴，使其覆蓋血膜，染色1 min固定血片。接著滴加瑞氏染液試劑二6～10滴，用洗耳球吹氣使載玻片上染液充分混合，染色8 min。之后水洗30 s，待干后拍照觀察血細胞分布情況及形態(tài)變化。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，實驗數(shù)據(jù)結果均用(±s)表示，每組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)性分布的多個樣本均數(shù)比較采用單因素ANOVA分析，若方差齊則采用LSD檢驗，若方差不齊就采用Games-Howell(A)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體質量及去瘤體質量的變化 荷瘤小鼠在腫瘤接種9 d后，體質量增加趨勢明顯，且體質量顯著大于正常組小鼠(P＜0.05)；CTX組體質量明顯低于模型組(P＜0.05)；而比較其他各時段各組小鼠體質量數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，溫泉水組小鼠的體質量差異無統(tǒng)計學意義。CTX組去瘤體質量明顯低于模型組(P＜0.05)，其余各組小鼠去瘤體質量差異無統(tǒng)計學意義(見表1)。

2.2 小鼠胸腺、脾臟、肺指數(shù) 模型組胸腺重量和指數(shù)明顯小于正常組(P＜0.05，P＜0.01)，溫泉水組胸腺重量和指數(shù)明顯大于模型組(P＜0.05，P＜0.05)，表現(xiàn)與中藥黃芪組類似。模型組的肺指數(shù)明顯高于正常組(P＜0.05)，溫泉水組的肺指數(shù)明顯高于模型組(P＜0.05)。CTX顯著抑制荷瘤小鼠胸腺重量(P＜0.05)和脾臟重量(P＜0.01)，降低小鼠胸腺指數(shù)(P＜0.01)和脾臟指數(shù)(P＜0.05)，抑制脾臟壞死發(fā)生率(降低至40%)。溫泉水對小鼠的脾臟重量和指數(shù)影響與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義(見表2，見圖1)。

表1 溫泉水樣本對4T1荷瘤小鼠體質量的影響[(±s)，n＝8] 單位：g

表1 溫泉水樣本對4T1荷瘤小鼠體質量的影響[(±s)，n＝8] 單位：g

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；溫泉水組、黃芪組、CTX組劑量每3 d一次。

?組別 劑量 動物體質量 去瘤體質量接種前 Day 3 Day 9 Day 15 Day 21 Day 27正常組 NS 15.30±1.19 15.74±1.17 17.76±1.05 17.73±1.07 18.53±1.09 18.85±1.18 18.85±1.18模型組 NS 16.30±0.89 16.35±1.23 18.34±1.35 19.15±1.27 20.26±1.53△ 20.19±1.79△ 19.54±1.72溫泉水組 200 μL/只 16.38±1.08 16.46±0.94 18.03±1.79 19.06±1.98 20.06±1.76 20.04±1.02 19.13±2.08黃芪組 30 mg/kg 15.69±0.67 15.85±0.8 17.73±1.25 18.56±1.25 19.58±1.43 19.30±1.20 18.45±1.17 CTX組 43 mg/kg 15.74±0.99 16.21±0.79 16.59±0.91* 16.83±0.97* 17.64±0.95* 17.70±0.85* 17.50±0.84*

表2 溫泉水樣本對4T1荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響[(±s)，n＝8]

表2 溫泉水樣本對4T1荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響[(±s)，n＝8]

注：與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；CTX組、溫泉水組、黃芪組劑量每3 d一次。

?組別 劑量 胸腺重量 胸腺指數(shù) 脾臟重量 脾臟指數(shù) 肺重量 肺指數(shù)正常組 NS 53.63±10.92 0.29±0.06 86.04±6.67 0.45±0.04 153.55±13.43 0.82±0.08模型組 NS 36.98±8.00△ 0.18±0.04△△ 1 070.00±148.83△△ 5.26±0.65△△ 195.10±27.43 0.96±0.10△CTX組 43 mg/kg 18.16±7.48* 0.10±0.04** 407.96±62.86** 2.32±0.42** 189.26±12.79 1.02±0.09溫泉水組 200 μL/只 47.30±13.83* 0.24±0.07* 1 104.56±112.47 5.53±0.53 215.64±25.15 1.09±0.17*黃芪組 10 mg/kg 50.56±12.64* 0.26±0.06** 978.29±127.51 5.08±0.64 197.25±25.78 1.02±0.09

2.3 小鼠腫瘤體積和瘤重、轉移率和轉移灶數(shù)在整個腫瘤生長期，溫泉水組的腫瘤體積均低于模型組，但未見差異有統(tǒng)計學意義。腫瘤接種28 d后，溫泉水組腫瘤的瘤重與模型組和中藥黃芪組相比，差異無統(tǒng)計學意義。值得注意的是，與模型組相比溫泉水組小鼠的肺轉移灶數(shù)量相對較少，轉移灶較小，肺轉移發(fā)生率降低(見表3)。

2.4 荷瘤小鼠外周血常規(guī)和血清IL-10水平 標準曲線y＝0.003 3x+ 0.018 8，R2＝0.998 4，計算得到實際濃度，血清IL-10水平從(221.52±72.90)降低到(151.44±34.67)(P＜0.05)，提示富鍺溫泉水對荷瘤小鼠血清IL-10的水平有顯著抑制作用。此外，溫泉水皮下注射顯著降低荷瘤小鼠增加的嗜堿性粒細胞數(shù)(P＜0.05)和血紅蛋白分布寬度(P＜0.05，見表4)。

表3 溫泉水樣本對4T1小鼠腫瘤體積、重量及轉移率的影響[(±s)，n＝8]

表3 溫泉水樣本對4T1小鼠腫瘤體積、重量及轉移率的影響[(±s)，n＝8]

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 腫瘤體積/mm3瘤重/g 腫瘤指數(shù)/% 抑瘤率/%給藥6 d 給藥12 d 給藥18 d 給藥24 d模型組 56.15±17.25 197.03±83.01 437.53±165.61 741.11±331.24 0.85±0.19 4.18±0.83 CTX組 24.86±11.86* 34.73±13.59** 71.82±22.30** 128.87±45.73** 0.20±0.09** 1.16±0.52** 76.47溫泉水組 46.99±20.29 186.12±81.01 411.55±141.17 732.07±210.80 0.91±0.13 4.62±1.00 -7.06黃芪組 61.24±14.38 197.14±66.26 454.19±104.56 757.12±253.02 0.85±0.11 4.41±0.56 0組別 肺轉移灶數(shù)目/個 轉移率總轉移灶數(shù) ＜2 mm ＞2 mm 平均轉移灶數(shù)模型組 45 35 10 5.6 8/8 CTX組 0 0 0 0 0/8溫泉水組 19 16 3 2.71 7/8黃芪組 22 18 4 2.75 7/8

表4 溫泉水樣本對4T1荷瘤小鼠血常規(guī)的影響[(±s)，n＝8]

表4 溫泉水樣本對4T1荷瘤小鼠血常規(guī)的影響[(±s)，n＝8]

注：與正常組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

?組別 白細胞、單核、淋巴細胞相關指數(shù)WBC/(109·L-1) LYMPH/(109·L-1) MONO/% LYMPH/(109·L-1) MONO/%正常組 3.50±0.10 2.30±0.77 0.03±0.01 65.10±9.45 0.95±0.26模型組 219.28±47.21△△ 11.87±3.97△△ 2.88±2.00△△ 5.45±1.49△△ 1.40±1.22 CTX組 13.32±7.24** 1.08±0.60** 0.08±0.02** 9.40±5.08 0.78±0.55溫泉水組 205.68±28.78 13.76±2.56 1.77±0.64 6.75±1.39 0.88±0.38黃芪組 223.30±46.51 12.14±1.09 2.66±0.53 5.63±1.24* 1.23±0.33組別 粒細胞相關指數(shù)NEUT/(109·L-1) NEUT/% EO/(109·L-1) EO/% BASO/(109·L-1) BASO/%正常組 0.75±0.43 20.13±5.75 0.41±0.27 13.23±10.35 0.00±0.00 0.18±0.17模型組 197.23±46.52△△ 89.65±3.24△△ 2.80±0.49△△ 1.30±0.22△△ 5.95±4.29△ 2.53±1.18△△CTX組 11.49±6.60** 83.2±9.64 0.51±0.08* 5.28±4.1 0.09±0.07* 0.60±0.16**溫泉水組 183.58±27.45 89.17±1.35 2.27±0.44 1.13±0.31 2.60±0.92 1.23±0..25*黃芪組 201.95±45.42 90.25±1.74 2.35±0.66 1.05±0.30 2.87±1.27 1.23±0.31*組別 紅細胞相關指數(shù)RBC(1012·L-1) HGB/(g·L-1) HDW/(g·L-1) MCH/pg正常組 9.81±1.00 159.00±17.53 18.30±1.22 16.15±0.19模型組 9.14±0.24 140.75±5.19 21.80±1.88△△ 15.38±0.31△CTX組 7.51±0.86* 126.75±13.74 25.08±1.70** 16.88±0.36**溫泉水組 9.01±0.59 135.50±9.04 19.65±1.24* 15.05±0.19黃芪組 9.01±0.55 133.75±7.89 19.88±0.43* 14.88±0.50*

2.5 溫泉水對乳腺癌小鼠外周血細胞形態(tài)的影響 血涂片結果顯示，乳腺癌荷瘤小鼠的中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞增多，且中性粒細胞胞核分葉少，這種現(xiàn)象可能是由于乳腺癌晚期，腫瘤組織炎性細胞及炎性因子浸潤，外周血內炎癥細胞增多。溫泉水給藥小鼠的中性粒細胞數(shù)量減少且胞核分葉多，改善腫瘤誘發(fā)的慢性炎癥狀態(tài)。但未出現(xiàn)黃芪組所示，增加嗜酸性粒細胞數(shù)量的功效，說明溫泉水可能具有改善腫瘤免疫抑制相關免疫細胞數(shù)量的作用，但不能增加機體免疫正調控相關的免疫細胞的數(shù)量(見圖2)。

圖2 各組有代表性的小鼠血涂片(200倍)

3 討論

溫泉在預防保健、疾病治療、促進康復等方面都有顯著的效果[3]。有研究指出，溫泉水療對高血壓、哮喘、糖尿病等疾病均有一定的療效，還有助于減輕焦慮、急躁等負面情緒，提高睡眠質量，其可以通過自身的物理效應和化學效應給人體健康帶來積極影響[7]。溫泉水中的化學物質或微量元素，能刺激人體自主神經，調節(jié)內分泌及免疫系統(tǒng)，從而起到治療作用[1]。在本研究中，富鍺溫泉水表現(xiàn)出較好的乳腺癌輔助治療作用。黃芪為臨床腫瘤輔助治療的常用中藥，能廣泛調節(jié)機體免疫系統(tǒng)[8]，改善術后身體狀態(tài)，抑制腫瘤標志物水平，降低腫瘤的復發(fā)和轉移[9]，且黃芪多糖對乳腺癌化療患者具有增效減毒作用[10]。為了更精確地觀察溫泉水對荷瘤機體的作用，本實驗采用荷瘤小鼠皮下注射含鍺溫泉水的方法，并設置陽性藥CTX和中藥黃芪為對照組，以進一步明確其對荷瘤機體免疫功能的影響。

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的腫瘤類型，傳統(tǒng)化療藥物對機體損傷較大，并且會破壞機體自身的免疫功能。本研究結果顯示，CTX顯著抑制小鼠體質量增長，而溫泉水和黃芪對小鼠體質量均無明顯影響，提示含鍺溫泉水基本上無毒，無副作用。肺轉移是乳腺癌最常見的內臟轉移之一[11]，溫泉水組小鼠的肺轉移灶數(shù)量明顯減少，且轉移灶較小，肺轉移發(fā)生率降低，說明溫泉水有抑制乳腺癌肺轉移的作用。胸腺是維持外周免疫的重要器官，為T細胞前體發(fā)育為成熟的T淋巴細胞提供了重要微環(huán)境[12]，其皮質分泌多種胸腺素，參與生物體的免疫功能，特別是細胞免疫功能。實驗結果顯示，溫泉水組的胸腺質量和指數(shù)顯著高于模型組，接近于正常組，提示富鍺溫泉水能對抗腫瘤引起的胸腺萎縮，保護胸腺的免疫功能；但對脾臟無明顯影響，不能抑制脾臟的腫大。鑒于溫泉水對小鼠腫瘤體積、重量無顯著作用，表明富鍺溫泉水主要通過免疫調節(jié)作用對抗乳腺癌轉移，而非直接抑制腫瘤的生長。

IL-10是一種抗炎細胞因子，在維持免疫穩(wěn)態(tài)、預防免疫介導的炎癥性疾病和增強對病原體的免疫應答等方面起著至關重要的作用[13]。IL-10最初被稱為“細胞因子抑制因子”，因其對T輔助細胞產生的細胞因子具有抑制作用，幾乎由所有的白細胞以及乳腺、腎臟、結腸、胰腺、惡性黑色素瘤和神經母細胞瘤等人類腫瘤細胞產生[14]，并且在多種惡性腫瘤中呈高表達。IL-10 能通過抑制抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)的活化作用產生對T 細胞的抑制效應來形成免疫抑制環(huán)境，從而誘導腫瘤免疫逃逸，促進腫瘤生長和轉移[15]。溫泉水對荷瘤小鼠血清IL-10的水平有顯著抑制作用，提示其改善荷瘤小鼠的免疫抑制狀態(tài)。

綜上所述，富鍺溫泉水能夠保護荷瘤小鼠胸腺免疫功能，抑制4T1腫瘤的肺轉移，并能改善機體的免疫抑制狀態(tài)。此外，其多項實驗結果均與黃芪對照組相似。在實際應用過程中，溫泉還起到腫瘤熱療的效益，熱療作為一種療效明確的腫瘤治療手段，正在得到越來越多的醫(yī)生和患者關注和承認。腫瘤細胞對熱更加敏感，且腫瘤區(qū)域散熱較慢，所以可通過熱療改變腫瘤區(qū)域的溫度致使腫瘤細胞死亡[16]。因此采用42～45 ℃富鍺溫泉水溫浴的最終綜合抗腫瘤效果可能優(yōu)于單獨皮下給藥模擬的表皮吸收效果。本實驗僅初步研究了富鍺溫泉水對荷瘤機體的免疫調節(jié)作用，尚未開展全面的抗腫瘤藥效學評價和相關機制研究，且未能結合溫泉的熱療作用驗證富鍺溫泉水浴療的綜合效果。在后續(xù)研究中，將基于本研究結果，開展多劑量、多時間點的藥效學觀測，并采用富鍺溫泉水制備細胞培養(yǎng)基，從細胞水平驗證其對腫瘤相關的免疫細胞功能抑制的作用及機制。