全血與單采血漿經病毒滅活后制備的冷沉淀質量比較

白璐，刁榮華，阮潛瑛，王世春，劉奇，王澤蓉，易中梅，任章銀

(陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院 a.檢驗科;b.輸血科，重慶 400038)

冷沉淀凝血因子是指將保存期內的新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma，F(xiàn)FP)在1～6 ℃融化后，分離出大部分的血漿，并將剩余的不溶解物質在1 h內速凍成固態(tài)的成分血[1]，其主要含有豐富的血漿凝固蛋白，包括凝血因子Ⅷ(FⅧ)、凝血因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)、纖維結合蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)和血小板微粒(platelet microparticle，PMP)等[2]。冷沉淀作為一種重要的血液制劑，主要用于凝血因子缺乏及大出血患者。冷沉淀凝血因子的輸注，目前尚未實現(xiàn)“零風險”，有必要進行嚴格的檢測及病毒滅活，大量文獻報道對血漿進行病毒滅活處理后可大大降低因輸血引起的病毒傳播風險[3-4]，但是病毒滅活過程會導致血漿中部分凝血因子損失[5]。國家標準及操作規(guī)范中未明確說明制備冷沉淀凝血因子的原料血漿是否需進行病毒滅活。為提高臨床用血安全性，探討采用病毒滅活后的FFP制備冷沉淀凝血因子是否符合國家標準，本研究選取兩種不同來源的病毒滅活FFP制備冷沉淀凝血因子，比較其制備效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑血漿采集機(XJC2000，四川南格爾生物醫(yī)學股份有限公司)及配套的一次性耗材(批號180822)，一次性使用去白采血六聯(lián)袋(400 mL，批號180424，四川南格爾生物醫(yī)學股份有限公司)，大容量低溫離心機(J6-MC，美國貝克曼)，血漿速凍箱(天津市正源制冷設備有限公司)，醫(yī)用血漿病毒滅活柜(山東中?？?及配套的一次性輸血過濾器(批號01180819)，泰爾茂無菌接駁機(TSCD-Ⅱ)，一次性轉移空袋(200 mL，批號180809，四川南格爾生物醫(yī)學股份有限公司)，電子天平(ES-1100s，長沙湘平科技發(fā)展有限公司)，潔凈工作臺(SW-CJ-2FI，蘇州安泰空氣技術有限公司)，冰凍血漿解凍箱(KJX-Ⅲ，蘇州市醫(yī)用儀器廠)，Ⅷ因子試劑盒(批號547669，希森美康醫(yī)用電子有限公司)，纖維蛋白原試劑盒(批號547544，希森美康醫(yī)用電子有限公司)。

1.2 病毒滅活FFP的制備(1)全血組：選取2019年7—8月獻血者無償捐獻的全血15袋(每袋400 mL)分離制備新鮮血漿。全血及多聯(lián)袋先采用高速冷凍離心機以3 397 g、4 ℃條件離心10 min，分離血漿，同條件對血漿二次離心8 min，分離殘留紅細胞待病毒滅活，每袋容量為200 mL，對懸浮紅細胞再做濾除白細胞處理。(2)單采組：選取2019年8—9月獻血者無償捐獻的單采血漿15袋(每袋200 mL)。兩組血漿在無菌室百級超凈工作臺內連接一次性使用病毒滅活裝置配套用輸血過濾器，把加入亞甲藍的血漿袋放入病毒滅活柜中進行光照處理，光照后的血漿通過配套過濾耗材濾除亞甲藍后，立即放入-50 ℃血漿速凍箱速凍，待成固態(tài)后置入-18 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｋ胁僮骶凑铡堆炯夹g操作規(guī)程(2019版)》的要求進行，整個制備過程<6 h。

1.3 冷沉淀凝血因子的制備將保存48 h后的兩種病毒滅活FFP取出放入水溫恒定在4 ℃的冰凍血漿解凍箱內緩慢融化，剩少許冰渣取出用無菌接駁機連接一次性使用轉移空袋，血漿連同空袋一起離心(2 496 g，4 ℃，15 min)，全程冷鏈控制。離心后用分漿夾分出上層血漿，每袋剩下(30±5)mL的血漿及白色絮狀物稱量斷開，微機處理貼簽后立即放入速凍冰箱速凍，待成固態(tài)后置入-18 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 標本留取及檢測在全血組血漿經二次離心后及單采組采集完成后留取新鮮血漿標本，標記好后立即冰凍保存。于37 ℃水浴箱快速融化兩組冷沉淀凝血因子及新鮮血漿標本，搖勻融化后的冷沉淀并及時留取標本，立即送檢。標本按照儀器操作說明書和試劑使用說明書進行檢測，整個檢測過程<1 h。

2 結果

2.1 Fib兩組FFP中Fib量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。全血組冷沉淀中Fib量和回收率均高于單采組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組病毒滅活FFP及制備的冷沉淀中Fib情況比較

2.2 FⅧ兩組FFP中FⅧ量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。全血組冷沉淀中FⅧ量和回收率均高于單采組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組病毒滅活FFP及制備的冷沉淀中FⅧ情況比較

3 討論

冷沉淀凝血因子作為一種血液制劑，在臨床應用較廣泛，對各種凝血因子缺乏的患者可以快速補充并減少出血風險，保證外科手術的順利實施。輸注未經病毒滅活的冷沉淀凝血因子存在通過血液傳播相關疾病的風險，可通過制備病毒滅活冷沉淀凝血因子的原料血漿來解決[7]。目前國內外運用最為普遍的一種血漿病毒滅活方法為亞甲藍光化學法，亞甲藍是一種表面攜帶正電荷的光敏劑，經最大吸收波長(661±2)nm、光照強度25 000～40 000 lx的可見光照射35 min，亞甲藍與血漿中的病毒核酸及脂質包膜結合，使病毒的核酸鏈斷裂，從而抑制其復制，達到其滅活效果[8]。

雖然病毒滅活過程在一定程度上影響血漿各凝血因子活性，但是對提高臨床輸注安全有重大意義[9]。本研究結果顯示，兩組新鮮冰凍血漿中Fib、FⅧ含量差異無統(tǒng)計學意義，全血組冷沉淀中Fib和FⅧ含量和回收率均高于單采組，說明在整個病毒滅活過程中，凝血因子損失較大。冷沉淀凝血因子活性除受獻血者自身凝血因子水平影響外，還跟血液采集過程、制備時間、溫度和制備工藝有一定關系。全血組采集時間在5～10 min完成，由于全部來自站內獻血，采集后立即放入2～6 ℃血液冷藏箱保存，無血液運輸等外在溫度及時間影響。單采組采集時間為(50±13)min，整個采集過程暴露在室溫的時間約為全血組的5倍，這將造成滅活后單采組凝血因子含量低于全血組。如果同一時間段制備量較大(一批次>30袋)，也將增加冷沉淀制劑在室溫暴露時間，影響FⅧ因子回收率。兩組的Fib回收率均偏低，在低溫情況下Fib容易聚集，形成包裹后經病毒滅活濾除亞甲藍過濾器丟失較明顯，完全融化后的血漿Fib會混入上清液，很難經過離心再次分離，從而造成部分Fib的丟失，回收率低于FⅧ。因此，在同一時間段減少制備量、縮短制備時間及全程冷鏈質量控制非常有必要。本站在制備方法及流程上與其他血站有一定不同，因此本研究病毒滅活FFP制備的冷沉淀中FⅧ、Fib含量及回收率比相關文獻報道要低[10]。

總之，全血組病毒滅活FFP制備的冷沉淀凝血因子質量高于單采組，建議采用全血來源的病毒滅活FFP作為制備冷沉淀凝血因子的原料血漿。本研究樣本量小，待優(yōu)化制備流程后可進一步多留樣本來跟蹤檢測冷沉淀凝血因子質量。如果能篩查出自身凝血因子較好的獻血者，可將其作為固定單采血漿獻血者，通過進一步控制好原料血漿質量、冷鏈條件及制備工藝等，冷沉淀FⅧ、Fib含量將會更高，冷沉淀凝血因子質量更加有保障。