miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

呂喆，蔣曉剛，廉民學(xué)

1.西安大興醫(yī)院外科，陜西 西安 710082；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，陜西 西安 710061；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710061

阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)是一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，目前尚未有完全治愈的方法，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是其主要病理特征之一[1]。因此，尋找可抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的藥物及治療方式對AD的及早預(yù)防和治療具有重要意義。研究AD的發(fā)病機(jī)制，以相應(yīng)的病理因素為靶點(diǎn)，開發(fā)具有新藥理活性的藥物是目前治療AD的研究熱點(diǎn)[2]。MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，其可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)參與細(xì)胞的凋亡過程，且在AD的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-369可以靶向下調(diào)SOX4抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。miR-369-3p通過干擾血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGFC)基因的表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的凋亡[5]。miR-369-3p在過氧化氫刺激的海馬神經(jīng)元細(xì)胞中顯著上調(diào)表達(dá)[6]。酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT)是一種由脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，一個(gè)重要的神經(jīng)保護(hù)因子，可能參與腦疾病的發(fā)生[7]。NAMPT還是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)合成的限速酶，其可能通過控制細(xì)胞和機(jī)體的NAD水平，從而影響細(xì)胞中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生以及抗氧化酶的表達(dá)，進(jìn)而影響衰老進(jìn)程或促進(jìn)AD形成[8]。然而miR-369-3p、NAMPT對缺氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)用缺氧處理海馬神經(jīng)元細(xì)胞建立缺氧損傷模型，研究miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制是否與NAMPT有關(guān)，以期為AD的病理研究提供一定的理論依據(jù)和為AD的治療提供靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibico公司；神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)多克隆抗體和SP免疫組化試劑盒(即用型)購自北京中山生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自上海莼試生物技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；二辛可寧酸(BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自北京百奧萊博科技有限公司；Bax、Bcl-2、Cyclin D1、P21、NAMPT、GAPDH多克隆抗體和山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)購自北京博奧森生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經(jīng)元細(xì)胞Hhn分離培養(yǎng)與鑒定 參考趙秀鶴等[9]研究方法，取12～20周齡引產(chǎn)的胎兒，常規(guī)消毒后開顱，分離雙側(cè)海馬，置于DMEM培養(yǎng)液中，剔除血管和腦膜組織，剪碎，加入0.125%的胰酶，消化完全，800 r/min離心5 min，去上清，加入DMEM培養(yǎng)液再次離心去上清，再加入DMEM培養(yǎng)液重懸，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液一次，每天在顯微鏡下觀察神經(jīng)元生長情況，培養(yǎng)7～14 d時(shí)海馬神經(jīng)元胞體飽滿，呈橢圓形或多邊形，樹突發(fā)達(dá)，相互交錯(cuò)；培養(yǎng)10 d后用NSE多克隆抗體進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，神經(jīng)元細(xì)胞會(huì)被染成棕色，此時(shí)期大部分細(xì)胞均被染色，說明多為神經(jīng)元細(xì)胞，取這一時(shí)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞缺氧處理與分組 將Hhn細(xì)胞用無血清低糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于持續(xù)充入95%N2+5%CO2的密閉培養(yǎng)箱中進(jìn)行缺氧處理48 h，作為缺氧組，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組。取對數(shù)生長期細(xì)胞Hhn，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，將miR-NC、miR-369-3p、anti-miR-NC、anti-miR-369-3p分別轉(zhuǎn)染至Hhn細(xì)胞中，分別記為miR-NC組、miR-369-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-369-3p組；將anti-miR-NC、anti-miR-369-3p、pcDNA3.1、pcDNA3.1-NAMPT 分別轉(zhuǎn)染至Hhn細(xì)胞中再進(jìn)行缺氧處理，分別記為缺氧+anti-miR-NC組、缺氧+anti-miR-369-3p組、缺氧+pcDNA3.1組、缺氧+pcDNA3.1-NAMPT組；將anti-miR-369-3p質(zhì)粒分別與si-NC、si-NAMPT共轉(zhuǎn)染至Hhn細(xì)胞中再進(jìn)行缺氧處理，分別記為缺氧+anti-miR-369-3p+si-NC組、缺氧+anti-miR-369-3p+si-NAMPT組。轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測miR-369-3p表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，miR-369-3p以U6為內(nèi)參，miR-369-3p正向引物序列：5'-CTCCTGGTACCTGAAGGGAGA-3'，反向引物序列：5'-CTCCAAGGTGAGATTTGATACTGA-3'；U6正向引物序列為：5'-CGCTTCGGCACATATAC-3'，反向引物序列為：5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反應(yīng)條件：95℃變性 30 s，60℃退火 30 s；72℃延伸 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，漂洗后用結(jié)合緩沖液重懸，加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測CyclinD1、P21、Bcl-2、Bax和NAMPT蛋白表達(dá)水平 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行定量，電泳、轉(zhuǎn)膜至PVDF，封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜；加入二抗室溫孵育2 h，顯影，定影，Quantity One軟件測各條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.6 MTT檢測細(xì)胞增殖活性 取分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h的細(xì)胞，加入20μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸去培養(yǎng)液后加150μL的DMSO，振蕩10 min，檢測490 nm處吸光度(OD)值。細(xì)胞增殖活性(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對照組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.7 SOD和MDA試劑盒分別檢測SOD活性和MDA含量 收集細(xì)胞磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，消化，吹打，800 r/min離心10 min得細(xì)胞沉淀；PBS再洗3遍，加0.5 mL PBS吹打均勻，超聲10 min使細(xì)胞裂解，40 r/min離心10 min取上清液，用于SOD活性和MDA含量檢測，具體步驟分別按照SOD和MDA試劑盒進(jìn)行。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告 實(shí)驗(yàn)檢測miRR-369R-3p對NAMPT的靶向調(diào)控TargetScan預(yù)測顯示NAMPT 3'UTR區(qū)域有miR-369-3p的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建含miR-369-3p的結(jié)合位點(diǎn)的NAMPT 3'UTR野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-NAMPT和MUT-NAMPT，將其分別與miR-NC和miR-369-3p共轉(zhuǎn)染至Hhn細(xì)胞中。按照說明書操作進(jìn)行，檢測熒光活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.00統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-369-3p、NAMPT在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn中的表達(dá) 與對照組相比，缺氧組Hhn細(xì)胞中miR-369-3p表達(dá)水平顯著升高，NAMPT表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1和表1。

圖1 NAMPT在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn中的表達(dá)

表1 miR-369-3p、NAMPT在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn中的表達(dá)(±s，n=9)

表1 miR-369-3p、NAMPT在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn中的表達(dá)(±s，n=9)

對照組缺氧組t值P值0.36±0.03 0.87±0.09 16.128＜0.05 0.59±0.06 0.20±0.02 18.499＜0.05

2.2 抑制miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn增殖、凋亡及SOD、MDA的影響 與對照組相比，缺氧組Hhn細(xì)胞中miR-369-3p、P21、Bax表達(dá)水平明顯升高，Cyclin D1、Bcl-2表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與缺氧+anti-miR-NC組相比，缺氧+anti-miR-369-3p組Hhn細(xì)胞中miR-369-3p、P21、Bax表達(dá)水平明顯降低，Cyclin D1、Bcl-2表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞活性明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2、表2和表3。

圖2 抑制miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn增殖、凋亡的影響

表2 抑制miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn增殖的影響(±s，n=9)

表2 抑制miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn增殖的影響(±s，n=9)

注：與對照組比較，a P＜0.05；與缺氧+anti-miR-NC組比較，b P＜0.05。

組別miR-369-3p Cyclin D1 P21細(xì)胞活性(490 nm)對照組缺氧組缺氧+anti-miR-NC組缺氧+anti-miR-369-3p組F值P值0.34±0.03 0.86±0.09a 0.83±0.08 0.45±0.04b 147.529＜0.05 0.85±0.08 0.20±0.02a 0.22±0.02 0.70±0.07b 327.942＜0.05 0.31±0.03 0.82±0.08a 0.84±0.08 0.38±0.03b 195.514＜0.05 24 h 0.56±0.05 0.23±0.02a 0.22±0.02 0.44±0.04b 202.959＜0.05 48 h 0.98±0.09 0.35±0.03a 0.34±0.03 0.79±0.08b 228.000＜0.05 72 h 1.63±0.16 0.54±0.05a 0.55±0.05 1.23±0.12b 230.207＜0.05

表3 抑制miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn凋亡及SOD、MDA的影響(±s，n=9)

表3 抑制miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn凋亡及SOD、MDA的影響(±s，n=9)

注：與對照組比較，a P＜0.05；與缺氧+anti-miR-NC組比較，b P＜0.05。

組別對照組缺氧組缺氧+anti-miR-NC組缺氧+anti-miR-369-3p組F值P值凋亡率(%)7.11±0.75 25.61±2.63a 24.58±2.51 12.39±1.36b 191.903＜0.05 SOD活性101±10.27 38.56±3.92a 37.22±3.81 70.29±7.36b 174.309＜0.05 MDA含量100.21±10.34 296±22.98a 288±22.51 165±12.37b 255.191＜0.05 Bax 0.14±0.01 0.85±0.08a 0.82±0.08 0.31±0.03b 336.522＜0.05 Bcl-2 0.94±0.09 0.23±0.02a 0.24±0.02 0.76±0.07b 343.022＜0.05

2.3 miR-369-3p靶向、調(diào)控NAMPT的表達(dá) TargetScan在線軟件預(yù)測顯示NAMPT與miR-369-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)顯示，相較于miR-NC組，miR-369-3p組轉(zhuǎn)染野生型NAMPT載體的細(xì)胞Hhn熒光素酶活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而轉(zhuǎn)染突變型NAMPT載體的細(xì)胞Hhn熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。相較于miR-NC組，miR-369-3p組NAMPT表達(dá)水平明顯降低；相較于anti-miR-NC組，anti-miR-369-3p組NAMPT表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3B和表5。

2.4 過表達(dá)NAMPT對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn增殖、凋亡及SOD、MDA表達(dá)的影響 與缺氧+pcDNA3.1組相比，缺氧+pcDNA3.1-NAMPT組Hhn細(xì)胞中P21、Bax表達(dá)水平明顯降低，NAMPT、Cyclin D1、Bcl-2表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞活性明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4、表6和表7。

圖3 miR-369-3p靶向、調(diào)控NAMPT

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(±s，n=9)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(±s，n=9)

組別miR-NC組miR-369-3p組t值P值WT-NAMPT 1.06±0.10 0.41±0.04 18.105＜0.05 MUT-NAMPT 1.02±0.10 0.98±0.10 0.849 0.409

表5 miR-369-3p調(diào)控NAMPT的表達(dá)(±s，n=9)

表5 miR-369-3p調(diào)控NAMPT的表達(dá)(±s，n=9)

注：與miR-NC組比較，a P＜0.05；與anti-miR-NC組比較，b P＜0.05。

組別miR-NC組miR-369-3p組anti-miR-NC組anti-miR-369-3p組F值P值NAMPT 0.53±0.05 0.21±0.02a 0.54±0.05 0.82±0.08b 189.661＜0.05

2.5 抑制NAMPT表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn增殖、凋亡及SOD、MDA表達(dá)的影響 與缺氧+anti-miR-NC組相比，缺氧+anti-miR-369-3p組Hhn細(xì)胞中P21、Bax表達(dá)水平明顯降低，NAMPT、Cyclin D1、Bcl-2表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞活性明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與缺氧+anti-miR-369-3p+si-NC組相比，缺氧+anti-miR-369-3p+si-NAMPT組Hhn細(xì)胞中p21、Bax表達(dá)水平明顯升高，NAMPT、Cyclin D1、Bcl-2表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5、表8和表9。

圖4 過表達(dá)NAMPT對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表6 過表達(dá)NAMPT對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn增殖的影響(±s，n=9)

表6 過表達(dá)NAMPT對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn增殖的影響(±s，n=9)

組別NAMPT Cyclin D1 P21細(xì)胞活性(490 nm)缺氧+pcDNA3.1組缺氧+pcDNA3.1-NAMPT組t值P值0.21±0.02 0.48±0.05 15.041＜0.05 0.22±0.02 0.62±0.06 18.974＜0.05 0.84±0.08 0.45±0.04 13.081＜0.05 24 h 0.22±0.02 0.41±0.04 12.746＜0.05 48 h 0.34±0.03 0.66±0.06 14.311＜0.05 72 h 0.55±0.05 1.14±0.12 13.615＜0.05

表7 過表達(dá)NAMPT對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn凋亡及SOD、MDA的影響(±s，n=9)

表7 過表達(dá)NAMPT對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn凋亡及SOD、MDA的影響(±s，n=9)

組別缺氧+pcDNA3.1組缺氧+pcDNA3.1-NAMPT組t值P值SOD活性37.22±3.81 63.25±6.36 10.533＜0.05 MDA含量288±22.51 184±15.47 11.423＜0.05 Bax 0.82±0.08 0.46±0.04 12.085＜0.05 Bcl-2 0.24±0.02 0.60±0.06 17.076＜0.05凋亡率(%)24.58±2.51 14.12±1.51 10.713＜0.05

表8 抑制NAMPT表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn增殖的影響(±s，n=9)

表8 抑制NAMPT表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn增殖的影響(±s，n=9)

注：與缺氧+anti-miR-NC組比較，a P＜0.05；與缺氧+anti-miR-369-3p+si-NC組比較，b P＜0.05。

組別NAMPT Cyclin D1 P21細(xì)胞活性(490 nm)缺氧+anti-miR-NC組缺氧+anti-miR-369-3p組缺氧+anti-miR-369-3p+si-NC組缺氧+anti-miR-369-3p+si-NAMPT組F值P值0.23±0.02 0.52±0.05a 0.51±0.05 0.30±0.03b 123.810＜0.05 0.22±0.02 0.70±0.07a 0.72±0.07 0.28±0.03b 230.919＜0.05 0.84±0.08 0.38±0.03a 0.36±0.03 0.68±0.07b 151.237＜0.05 24 h 0.22±0.02 0.44±0.04a 0.45±0.04 0.26±0.02b 128.625＜0.05 48 h 0.34±0.03 0.79±0.08a 0.81±0.08 0.42±0.04b 141.020＜0.05 72 h 0.55±0.05 1.23±0.12a 1.26±0.12 0.73±0.07b 126.854＜0.05

表9 抑制NAMPT表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn凋亡及SOD、MDA的影響(±s，n=9)

表9 抑制NAMPT表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn凋亡及SOD、MDA的影響(±s，n=9)

注：與缺氧+anti-miR-NC組比較，a P＜0.05；與缺氧+anti-miR-369-3p+si-NC組比較，b P＜0.05。

組別缺氧+anti-miR-NC組缺氧+anti-miR-369-3p組缺氧+anti-miR-369-3p+si-NC組缺氧+anti-miR-369-3p+si-NAMPT組F值P值凋亡率(%)24.58±2.51 12.39±1.36a 12.20±1.31 18.68±1.88b 93.639＜0.05 SOD活性37.22±3.81 70.29±7.36a 71.25±7.40 45.67±4.73b 73.745＜0.05 MDA含量288±22.51 165±12.37a 162±13.01 225±19.63b 105.126＜0.05 Bax 0.82±0.08 0.31±0.03a 0.30±0.03 0.66±0.06b 205.500＜0.05 Bcl-2 0.24±0.02 0.76±0.07a 0.78±0.07 0.33±0.03b 258.892＜0.05

圖5 抑制NAMPT表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

3 討論

AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，氧化應(yīng)激是其發(fā)生的重要因素之一[10]。有研究發(fā)現(xiàn)AD患者的海馬組織中神經(jīng)元凋亡率明顯較高[11]；說明海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與AD的發(fā)生有關(guān)。而缺氧可誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)缺氧處理細(xì)胞Hhn建立AD細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞活性降低，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性降低，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量升高；說明缺氧可誘導(dǎo)Hhn細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致Hhn細(xì)胞損傷；AD細(xì)胞模型成功建立。

研究表明miRNA與AD的進(jìn)展密切相關(guān)，藥物的靶向治療策略是AD的新治療策略，miRNA可作為AD新型藥物研發(fā)的靶點(diǎn)[13]。有研究報(bào)道AD患者中miR-369-3p表達(dá)水平增加，miR-369-3p可能與AD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[14]。研究報(bào)道抑制miR-369-3p表達(dá)可抑制細(xì)胞活力，促進(jìn)放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在缺氧處理的細(xì)胞Hhn中miR-369-3p高表達(dá)，抑制miR-369-3p表達(dá)可提高CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平，降低p21、Bax表達(dá)水平，降低細(xì)胞凋亡率，提高細(xì)胞活性，降低SOD活性，提高M(jìn)DA含量。說明抑制miR-369-3p表達(dá)可抑制缺氧誘導(dǎo)的Hhn細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)缺氧誘導(dǎo)的Hhn細(xì)胞損傷。

NAMPT參與NAD的合成，與神經(jīng)退行性疾病以及心腦血管疾病密切相關(guān)[16]。有研究報(bào)道老年小鼠腦缺血情況下NAD水平明顯降低，補(bǔ)充NAD對腦缺血具有保護(hù)作用[17]。此外，研究報(bào)道上調(diào)NAMPT可提高SAMP8小鼠的認(rèn)知功能[18]。以上研究表明NAMPT可能參與腦部疾病的進(jìn)展過程，但其對缺氧處理的神經(jīng)元損傷的影響還尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在缺氧處理的細(xì)胞Hhn中NAMPT低表達(dá)，過表達(dá)NAMPT可提高CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平，降低p21、Bax表達(dá)水平，降低細(xì)胞凋亡率，提高細(xì)胞活性，降低SOD活性，提高M(jìn)DA含量。說明過表達(dá)NAMPT可抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)缺氧誘導(dǎo)的Hhn細(xì)胞損傷。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)miR-369-3p靶向調(diào)控NAMPT；而抑制NAMPT表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-369-3p對缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn增殖促進(jìn)、凋亡抑制及提高SOD活性、降低MDA含量的作用。提示，miR-369-3p可能通過調(diào)控NAMPT影響缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞Hhn損傷。

綜上所述，抑制miR-369-3p表達(dá)可促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，即可保護(hù)缺氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與NAMPT相關(guān)，將可為阿爾茲海默癥的防治提供新思路和新靶點(diǎn)。