淺談無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的分類和應(yīng)用

陳紹華

摘 要 無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成（CFPS）是一種技術(shù)平臺，為蛋白質(zhì)表達、代謝工程、治療發(fā)展、教育等提供了新的機會。CFPS相對于體內(nèi)蛋白質(zhì)表達的優(yōu)勢包括其開放的系統(tǒng)，消除對活細(xì)胞的依賴，以及將所有系統(tǒng)能量集中在生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)上的能力。在過去的60年里，CFPS平臺已經(jīng)大大發(fā)展和多樣化，并會繼續(xù)發(fā)展。當(dāng)前發(fā)展領(lǐng)域的新應(yīng)用和新類型都是基于多種生物提取物。本文主要介紹高采納平臺的應(yīng)用，從應(yīng)用的角度來闡明這些平臺的差異。

關(guān)鍵詞 無細(xì)胞蛋白合成（CFPS）;體外轉(zhuǎn)錄-翻譯（TX-TL）;無細(xì)胞蛋白表達（CFPE）;體外蛋白質(zhì)合成;無細(xì)胞合成生物學(xué)

引言

蛋白質(zhì)作為重要的生物大分子，是所有生物體維持結(jié)構(gòu)、功能的必需物質(zhì)[1]。無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成（Cell-free Protein Synthesis，CFPS）大約在60年前出現(xiàn)，作為一個平臺，被尼倫伯格和馬特海伊用來破譯遺傳密碼，并發(fā)現(xiàn)mRNA與蛋白質(zhì)合成之間的聯(lián)系。自這一發(fā)現(xiàn)以來，CFPS平臺已經(jīng)成長為各種應(yīng)用，從功能基因組學(xué)到大規(guī)模抗體生產(chǎn)。

目前，CFPS已經(jīng)使用來自許多不同生物體的細(xì)胞提取物來實現(xiàn)，其獨特的生物化學(xué)特性使其能夠廣泛應(yīng)用。對CFPS日益增長的興趣是與平臺開放性質(zhì)相關(guān)的關(guān)鍵優(yōu)勢的結(jié)果。CFPS反應(yīng)缺乏細(xì)胞膜和功能基因組，因此不受細(xì)胞生命目標(biāo)的限制。因此，當(dāng)試圖在體內(nèi)產(chǎn)生大量重組蛋白時，細(xì)胞所承受的代謝和細(xì)胞毒性負(fù)擔(dān)在CFPS中是被避免了，可以直接操縱蛋白質(zhì)生產(chǎn)環(huán)境，因為它是一個開放的系統(tǒng)。在某些情況下，使用CFPS可以獲得更高的蛋白質(zhì)滴度，因為系統(tǒng)中的所有能量都被引導(dǎo)到生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)中去。無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)已成為十分重要的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，在大規(guī)模表達重組藥物、制備蛋白質(zhì)芯片等方面具有巨大的潛力。

1CFPS反應(yīng)模式

作為一個開放和高度個性化的平臺，CFPS反應(yīng)可以以多種格式執(zhí)行，包括耦合、非耦合、批處理、連續(xù)流動、連續(xù)交換、凍干， 或微流控格式，這取決于用戶的需要。

除了基于細(xì)胞提取的CFPS試劑盒外，PURE 表達試劑盒包括重組大腸桿菌轉(zhuǎn)錄和翻譯機制的純化成分。 PURE（protein synthesis using recombinant elements）利用單獨純化的組分代替細(xì)胞提取物，其中包括10個翻譯因子：T7RNA聚合酶、20個氨基酰基-tRNA合成酶、核糖體、焦磷酸酶、肌酸激酶、肌激酶和核苷二磷酸激酶。該系統(tǒng)需要過表達和純化每個成分，但得益于沒有蛋白酶和核酸酶以及系統(tǒng)的確定性質(zhì)，總的來說PURE系統(tǒng)比均質(zhì)的細(xì)胞提取CFPS允許高純度和稍微容易操作的反應(yīng)條件。然而，這些試劑盒相對自己生產(chǎn)和商業(yè)上可用的基于提取物的CFPS是十分昂貴的（$0.99/?L反應(yīng)物），其生產(chǎn)力（～100?g/mL）也明顯低于它們的基于大腸桿菌提取物的CFPS對應(yīng)物。

2無細(xì)胞蛋白合成的應(yīng)用

2.1 平臺分類的介紹

在無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成出現(xiàn)的60年中，已經(jīng)開發(fā)了許多基于各種生物的細(xì)胞提取物平臺。 包括細(xì)菌、植物、哺乳動物和人類細(xì)胞系的提取物。每個產(chǎn)生的平臺由于給定生物物種的獨特生物化學(xué)特性，而在易于制備、蛋白質(zhì)產(chǎn)量和可能的應(yīng)用中都有不同的結(jié)果。 本文中將這些不同的平臺分為兩類：高采納平臺和低采納平臺。

2.2 高采納平臺

高采納包括基于大腸桿菌、昆蟲、酵母、中國倉鼠卵巢、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液、小麥胚芽和HeLa細(xì)胞的平臺。這些平臺已被用于各種應(yīng)用并在CFPS領(lǐng)域確立可用性和多功能性方面經(jīng)受了時間的考驗。

（1）教育

CFPS系統(tǒng)的開放性質(zhì)和由此產(chǎn)生的直接操縱細(xì)胞機器為基于探究的學(xué)習(xí)提供機會，這點使CFPS特別適合于教室。CFPS技術(shù)在教育中的第一個應(yīng)用是BioBits套件，它對不同年齡的學(xué)生進行了測試。這些套件提供了多功能的實驗選擇并且相對便宜（一個班級大約$100）。Bio Bits Bright和Explorer工具包代表了可以啟用CFPS的課堂實驗和應(yīng)用程序的多樣性，熒光蛋白的產(chǎn)生，水凝膠的產(chǎn)生以及水果DNA的鑒定。這些可能性表明，CFPS可以提供一種動手的方式來探究性地學(xué)習(xí)生物化學(xué)概念。

（2）翻譯后修飾（PTMs）

翻譯后修飾（PTMs）可以極大地影響蛋白質(zhì)的折疊、活性和穩(wěn)定性，這可能是治療蛋白、膜蛋白和病毒樣顆粒所必需的。因此在選擇CFPS平臺時，在感興趣的蛋白質(zhì)中進行各種翻譯后修飾（PTMs）的能力是一個關(guān)鍵的考慮因素。具有內(nèi)源性微粒體的平臺顯示出更大的支持PTM能力。這使得像中國倉鼠卵巢、HeLa和昆蟲這樣的平臺很適合這種應(yīng)用，因為內(nèi)源性微粒體是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成的，并在這些提取物的制備過程中得到保留。然而，當(dāng)利用內(nèi)源性微粒體時，就在系統(tǒng)中引入了一個新的“黑盒”，限制了用戶的控制，并將PTMs的選擇限制在那些固有細(xì)胞系中。

一些PTMs可以在大腸桿菌CFPS中實現(xiàn)，但由于缺乏內(nèi)源性微粒體和在桿菌中可能的PTMs數(shù)量有限，使這種應(yīng)用與真核生物相比通常在技術(shù)上更具挑戰(zhàn)性。然而，大腸桿菌的利用在總體蛋白質(zhì)產(chǎn)量和提取物制備方便方面仍然是有利的，這促使了PTMs在這個平臺上的發(fā)展。 反應(yīng)的開放性使用戶能夠調(diào)整氧化還原條件，使二硫鍵的形成在該平臺可行。

（3）高通量篩選

實現(xiàn)高通量蛋白質(zhì)生產(chǎn)的能力是CFPS的一個主要優(yōu)勢，因為它使快速生產(chǎn)和篩選各種蛋白質(zhì)產(chǎn)品的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于體內(nèi)蛋白表達模式。耦聯(lián)CFPS允許直接插入DNA模板，而不需要細(xì)胞轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染，在某些情況下可以不做純化直接進行蛋白質(zhì)產(chǎn)品的檢測，創(chuàng)造一個強大的一鍋系統(tǒng)。高通量CFPS的一個關(guān)鍵應(yīng)用是功能基因組學(xué)，它允許闡明新的基因及其相應(yīng)的蛋白質(zhì)功能。高通量篩選可以在任何平臺上進行，但最常見的是利用大腸桿菌、小麥胚芽和兔網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物。

（4）病毒樣粒子

病毒樣粒子（VLPs）是缺乏基因組物質(zhì)的病毒的衣殼，這意味著它們是一個高度組織和對稱的蛋白質(zhì)聚集體，能夠在其中攜帶感興趣的分子。因此，VLPs的生產(chǎn)允許研究病毒組裝，創(chuàng)建有效的疫苗，使用封裝輸送藥物以及材料科學(xué)方面的應(yīng)用。雖然VLPs可以在體內(nèi)產(chǎn)生，但在CFPS平臺上的生產(chǎn)提供了優(yōu)勢，包括合成有毒的VLPs和操縱反應(yīng)的氧化還原條件形成熱力學(xué)穩(wěn)定所必需的合適的二硫鍵。CFPS反應(yīng)的多功能性還允許一個能夠生產(chǎn)許多類型VLPs的單一的、更強的平臺，在一個比體內(nèi)條件下可伸縮的更高產(chǎn)量和更容易修改的反應(yīng)設(shè)置平臺來實現(xiàn)。

（5）大規(guī)模生產(chǎn)

實現(xiàn)CFPS的演示從高通量規(guī)模的到制造規(guī)模擴大了該平臺的效用。 有興趣利用這個應(yīng)用能力的用戶用CFPS生產(chǎn)抗體和工業(yè)酶等，以及將CFPS工具包用于現(xiàn)場或教育用途，這些用戶應(yīng)考慮在整個流程中擴大其規(guī)模的技術(shù)細(xì)節(jié)。這首先是細(xì)胞生長的能力，以及規(guī)模化提取物的制備，能夠?qū)崿F(xiàn)這種規(guī)模的平臺包括大腸桿菌、小麥胚芽兔網(wǎng)織紅細(xì)胞。

（6）膜蛋白

膜蛋白的研究是蛋白質(zhì)組學(xué)的一個重要組成部分，因為它們在生物體中具有很高的豐度。大約25%的測序基因編碼把自己整合到細(xì)胞膜上的輸水蛋白。膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)有很多功能，包括細(xì)胞識別、免疫應(yīng)答、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子轉(zhuǎn)運。但是在體內(nèi)以正確的構(gòu)象表達這些完整的蛋白質(zhì)往往是一個挑戰(zhàn)，因為在表達過程中自然豐度低，疏水性高，必須轉(zhuǎn)運到膜上，這會影響宿主細(xì)胞膜的完整性。

CFPS平臺能夠通過非膜結(jié)合系統(tǒng)避免依賴細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性來規(guī)避這些挑戰(zhàn)。此外，在提取物制備過程中，微粒體、囊泡狀結(jié)構(gòu)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段（內(nèi)源性微粒體）的存在允許膜蛋白正確折疊和結(jié)合，在蛋白質(zhì)合成過程中蛋白質(zhì)本身進入這些結(jié)構(gòu)。也就是說HeLa、中國倉鼠卵巢和昆蟲平臺都含有內(nèi)源性微粒體它是在由提取物制備過程中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破裂形成的。這些平臺已經(jīng)成功地表達了許多膜蛋白，從雙跨膜瘧疾蛋白（HeLa）到表皮生長因子受體蛋白質(zhì)（中國倉鼠卵巢），最后到KcsA鉀離子通道（昆蟲）。

（7）抗體

利用CFPS在體外生產(chǎn)功能性抗體和抗體片段具有簡化抗體生產(chǎn)過程以更快速制造的潛力。這個優(yōu)點部分是由于系統(tǒng)開放，它可以很容易地應(yīng)用快速設(shè)計-構(gòu)建-測試循環(huán)和修改氧化還原潛力，從案例到案例地進行修改以生產(chǎn)活性抗體。家兔網(wǎng)織紅細(xì)胞、大腸桿菌、中國倉鼠卵巢、小麥胚芽和昆蟲平臺都已經(jīng)能產(chǎn)生抗體。

2.3 低采納平臺

迄今為止，低應(yīng)用程度的無細(xì)胞平臺包括來自粗糙鏈孢霉、鏈霉菌、納氏弧菌、枯草芽孢桿菌、煙草、擬南芥、假單胞菌、大芽孢桿菌，古細(xì)菌和利什曼原蟲的平臺。這些平臺被定性為低采納平臺，因為每個平臺發(fā)表的論文少于25篇。

對該平臺進行優(yōu)化的目的是用于表達高GC含量模板，以便在體外生產(chǎn)天然基因簇。隨著新的基因組挖掘技術(shù)，對天然產(chǎn)物基因簇的認(rèn)識正在迅速增加。然而，在體內(nèi)表達這些簇會導(dǎo)致非常低的可溶性產(chǎn)量，因為其對細(xì)胞有代謝負(fù)擔(dān)?；阪溍咕腃FPS不僅為更高GC含量模板的密碼子優(yōu)化提供了一個機會，也為天然產(chǎn)物基因簇的可溶性表達提供了一個機會。

3結(jié)束語

高采納已經(jīng)得到了最好的優(yōu)化，并且有豐富的文獻來支持。高采納平臺包括大腸桿菌、昆蟲、酵母、中國倉鼠卵巢細(xì)胞、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞，小麥胚芽，和海拉細(xì)胞。它的應(yīng)用包括教育、翻譯后修飾、高通量表達、類病毒粒子生產(chǎn)、大規(guī)模合成、膜蛋白以及難以合成的蛋白質(zhì)（抗體、大蛋白、冰結(jié)構(gòu)蛋白和金屬蛋白），以及其他各種應(yīng)用（翻譯機制、遺傳密碼擴展、代謝工程和遺傳線路的研究等）。本文還簡要介紹了低采納平臺所啟用的應(yīng)用，包括鏈霉菌等。雖然這些平臺有一些工作支持它們的使用，但它們通常只被少數(shù)人使用，沒有經(jīng)過很多優(yōu)化。如果對這些平臺做更多的工作，仍然可能為該領(lǐng)域提供一些關(guān)鍵優(yōu)勢。

參考文獻

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