制馬錢子中馬錢子堿的電化學分析方法研究*

翟佳莉，張云靜，田 蕾，張自品

（安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥230012）

馬錢子，又稱番木鱉，為馬錢科植物馬錢（Strychons nux-vomaca L.）或云南馬錢（strychnos pierrianan A.W.Hill）的干燥成熟種子，是一種臨床療效明確的傳統(tǒng)中藥[1]。馬錢子臨床上常用于治療風寒濕痹、麻木癱瘓、跌打損傷和癰疽腫痛，其抗菌、鎮(zhèn)痛、興奮中樞神經(jīng)、抗心律失常和抗腫瘤等藥理作用顯著[1-4]。但是馬錢子卻具神經(jīng)毒性，應用不慎極易中毒甚至死亡[5,6]。馬錢子主要成分為吲哚類生物堿，其中馬錢子堿和士的寧占總生物堿的80%左右，一般認為馬錢子堿是馬錢子的有效和毒性成分[7,8]。目前已報道的馬錢子堿的分析方法包括高效液相色譜法[9]、薄層色譜法[10]、液相色譜-質(zhì)譜法[11]、毛細管電泳法[12]和電化學分析方法[13]。然而，馬錢子藥材及其炮制品中馬錢子堿的選擇性電化學分析卻具有挑戰(zhàn)性，這是因為馬錢子中的士的寧含量很高，其化學結(jié)構(gòu)和馬錢子堿極為相似（圖式1）以及氧化電位非常接近、氧化峰互相重疊。因此，如何避免士的寧的干擾，是建立馬錢子堿的電化學分析方法的關(guān)鍵問題。盡管目前已報道的馬錢子堿的電化學分析方法有很好的分析性能，其中基于馬錢子堿的直接電化學氧化的方法，均沒有考慮士的寧的干擾，因此，這些電化學分析方法無法對馬錢子實際樣品中的馬錢子堿進行準確的定量分析。本研究希望發(fā)展一種簡單靈敏并且能有效避免士的寧干擾的馬錢子堿的電化學分析方法。

本研究發(fā)現(xiàn)馬錢子堿和士的寧的直接電化學氧化的電極過程對介質(zhì)的pH值依賴性不同，利用這個特點，通過篩選介質(zhì)pH值，從而將二者的氧化峰電位分離開。該方法具有簡單快速、靈敏易行、能有效地避免士的寧的干擾、并成功用于制馬錢子中馬錢子堿含量的測定。

圖式1 化學結(jié)構(gòu)式Sch.1 Chemical structures of brucine（A）and strychnine（B）

1 實驗部分

1.1 藥品與試劑

抗壞血酸、尿酸、多巴胺、葡萄糖和氧化石墨烯（GO）均購自Sigma公司。鹽酸5-羥色胺、去甲腎上腺素、和腎上腺素酒石酸氫鹽購自阿拉丁化學試劑有限公司。馬錢子堿對照品（批號：CHB160318）、士的寧對照品（批號：CHB171022）均購自于成都克洛瑪生物技術(shù)有限公司。制馬錢子購自當?shù)厮幉氖袌?。Britton-Robinson（BR）緩沖液由 40mM H3PO4、40mM HAC和40mM H3BO3組成，用0.2M NaOH調(diào)至不同pH值。實驗中所用其它試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

CHI730E電化學工作站（上海辰華有限公司）；EX125DZH十萬分之一天平（奧豪斯儀器有限公司，常州）；PHS-3C型pH計（世紀方舟科技有限公司，成都）；KQ-200KDB型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；79-1磁力攪拌器（國宇儀器制造有限公司，常州）；DFT-50型手提式中藥粉碎機（青州三寶中藥機械廠）；UHPLC-MS/MS系統(tǒng)由安捷倫（美國安捷倫科技公司）UHPLC-1290系統(tǒng)（二元泵，脫氣器和自動進樣器）與Applied Biosystems（美國AB SCIEX）QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜儀組成。

1.3 電化學測試

實驗采用三電極體系，氧化石墨烯修飾的玻碳電極（GO/GC）作為工作電極，Ag/AgCl（飽和氯化鉀）作為參比電極，鉑絲作為對電極。玻碳電極（Φ=3mm）使用前首先分別經(jīng)粒徑為3.0、1.0和0.05μm的Al2O3粉末拋光，然后再置于無水乙醇和水中各超聲清洗3min，N2吹干備用。將氧化石墨烯（1.0mg）分散在2.0mL乙醇中，并將混合物超聲處理1h，得到分散良好的懸浮液。然后取5L石墨烯乙醇懸浮液滴涂在潔凈的GC表面以獲得GO/GC電極，GO/GC電極空氣中干燥揮去溶劑后進行馬錢子堿的電化學分析。實驗中采用循環(huán)伏安（CV）技術(shù)或差分脈沖法（DPV）技術(shù)，所有實驗均在室溫下進行。其中，馬錢子提取液的DPV測定結(jié)果，扣除相應的溶劑背景。

1.4 UHPLC-MS/MS測試

UHPLC-MS/MS系統(tǒng)由UHPLC系統(tǒng)和Applied Biosystems三重四極桿質(zhì)譜儀組成。色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.1×50mm,2.7μm） 色譜柱，流動相為純甲醇-水（含0.05甲酸和10mmol·L-1乙酸銨）（10∶90），進樣量為 2μL。采用電噴霧電離源，正離子模式，最終得到優(yōu)化的質(zhì)譜條件如下：離子源噴霧電壓-4500V；離子源溫度550℃；氣簾氣30psi；霧化氣 55psi；干燥氣 55psi；去簇電壓 150V；入口電壓10V；碰撞能量為47eV。用于定量分析的離子對：馬錢子堿：m/z 395.2→324.2。

1.5 實際樣品準備與測試

將制馬錢子粉碎至過三號篩，取0.6g置具塞錐形瓶中，加1mol·L-1NaOH溶液3mL，混勻，放置30min，精密加氯仿20mL進行萃取，密塞，稱定重量。超聲處理（功率150W，頻率80kHz）60min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用鋪有少量無水硫酸鈉的濾紙過濾。精密量取續(xù)濾液3mL，置10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，作為待測樣品儲備液。將該儲備液用pH值5.0 BR緩沖液分別稀釋10倍、25倍、50倍作為測試樣品進行電化學測試，每種樣品溶液測試3次。樣品溶液測試采用DPV技術(shù)，掃描電位從+0.70V到+1.10V，脈沖增量為4mV，脈沖幅度為50mV。

2 結(jié)果和討論

2.1 馬錢子堿和士的寧的電化學行為研究

馬錢子堿和士的寧在裸電極上的直接電化學氧化都具有較大的過電位，如圖1（a）所示，在pH值為7.0的條件下，馬錢子堿在玻碳電極上從+0.83V（vs.Ag/AgCl）開始氧化，氧化峰電位在+0.98V，該氧化過程可以歸屬為馬錢子堿的甲氧基氧化為醌式結(jié)構(gòu)（圖式2），是一步兩電子兩質(zhì)子的電極過程。在相同條件下，士的寧從+0.85V（vs.Ag/AgCl）開始氧化，如圖1（b）所示，推測為士的寧結(jié)構(gòu)上N原子的一步一質(zhì)子兩電子的氧化過程或含N原子的六元環(huán)上形成雙鍵的過程。

圖式2 馬錢子堿電化學氧化的電極過程Sch.2 Electrooxidation pathway of brucine

圖1 在玻碳電極上的CV圖形Fig.1 CVs for GC electrode containing 1mM brucine（a）or strychnine（b）

從圖1可以看出，士的寧和馬錢子堿的電化學起峰電位有很大程度的重疊，并且相同實驗條件下，相同濃度的士的寧的氧化峰電流明顯高于馬錢子堿。因此，士的寧的電化學氧化會嚴重干擾中馬錢子中馬錢子堿的電化學分析，這也是建立基于馬錢子堿的直接電化學氧化的馬錢子中馬錢子堿的電化學分析方法需要解決的首要關(guān)鍵問題。

2.2 馬錢子堿和士的寧的電化學氧化對pH值的依賴性考察

由于馬錢子堿和士的寧的電化學氧化過程均是質(zhì)子參與的，因此，我們分別考察了介質(zhì)pH值對馬錢子堿和士的寧的電化學氧化過程的影響。根據(jù)二者在pH值為2.0～10.0范圍內(nèi)的循環(huán)伏安結(jié)果，各自的氧化起始電位在不同pH值下的結(jié)果見圖2A。隨著溶液pH值的不斷增加，士的寧（b）和馬錢子堿（a）的起峰電位不斷負移，這是由于二者的電化學氧化過程均為失質(zhì)子過程。在溶液pH值小于6.0的條件下，士的寧的起峰電位是明顯高于馬錢子堿的起峰電位的，當溶液pH值大于等于6.0時，二者起峰電位幾近重合，該結(jié)果和峰電位的變化趨勢也非常一致，該結(jié)果說明在pH值小于6.0的條件下，士的寧的氧化可以和馬錢子堿的氧化分開，馬錢子堿的氧化可以避免士的寧的干擾。同時我們也考察了馬錢子堿峰電流隨著pH值的變化情況，結(jié)果如（c）所示。結(jié)果顯示，pH值在2.0～4.0的范圍內(nèi)，馬錢子堿的氧化峰電流隨著pH值的增加逐漸增加，在pH值為6.0時，其氧化峰電流達到最大，隨后隨著pH值的增加，其峰電流逐漸降低。因此，在可以把馬錢子堿和士的寧的氧化分開的前提下，在pH值為5.0時馬錢子堿的氧化峰電流最大，因此，在隨后的研究中，我們選擇pH值為5.0作為馬錢子堿電化學分析的最佳pH值。

圖2 （A）不同pH值條件下，500μM馬錢子堿（a）和士的寧（b）的氧化起始電位、以及馬錢子堿的氧化峰電流（c）。（B）500μM馬錢子堿（a）、士的寧（b）和馬錢子堿和士的寧混合物（c）在玻碳電極上的DPV行為Fig.2 （A）Onset potentials of 500μM brucine（a）and strychnine（b）under different pH,and the oxidation peak current of brucine under different pH（c）.（B）DPVs for 500μM brucine（a）,strychnine（b）,and the mixture of brucine and strychnine（c）

為了進一步考察在pH值為5.0條件下，士的寧的電化學氧化不干擾馬錢子堿的電化學分析，我們分別考察了在該條件下，單獨的馬錢子堿、士的寧以及兩者混合物的伏安行為，結(jié)果見圖2B。與CV技術(shù)相比，DPV技術(shù)由于扣除了背景電流，因而具有更好的分辨率和更高的信噪比，因此，在隨后的分析測試中我們采用了DPV技術(shù)?？梢钥闯?，在該條件下，單獨的士的寧（b）的起峰電位和峰電位都和單獨的馬錢子堿（a）能夠很好的分開，該結(jié)果和圖2A的CV結(jié)果保持一致。更重要的是，單獨的馬錢子堿的DPV曲線和相同濃度二者的混合物（c）的完全重合，氧化峰電流和峰形幾乎完全一致，該結(jié)果進一步說明在pH值為5.0的條件下，士的寧的電化學氧化不干擾馬錢子堿的電化學分析，這為下一步建立基于馬錢子堿直接電化學氧化的分析方法提供了必要條件。

2.3 馬錢子堿和士的寧在GO/GC電極上的電化學氧化

以上結(jié)果表明，通過篩選介質(zhì)的pH值能夠?qū)崿F(xiàn)馬錢子堿的選擇性分析，可以建立基于馬錢子堿直接電化學氧化的馬錢子堿的電化學分析方法。為了提高馬錢子堿電化學分析的分析性能，我們采用GO/GC電極來加快馬錢子堿的電化學氧化速率，提高其電流響應，結(jié)果見圖3。

圖3 1mM馬錢子堿在玻碳電極（a）、馬錢子堿（b）和士的寧（c）在GO/GC電極上（pH 5.0）的CV圖Fig.3 CVs for 1 mM brucine obtained at GC electrode（a）,brucine（b）and strychnine at and GO/GC electrode（c）

相較于馬錢子堿在玻碳電極上的電化學氧化（a），馬錢子堿在GO/GC電極上的氧化電流增加了2.7倍（b），同時氧化峰電位負移了50mV，表明氧化石墨烯加快了馬錢子堿的電子轉(zhuǎn)移動力學、提高了馬錢子電化學分析的分析性能。在相同條件下，相同濃度士的寧在GO/GC電極的氧化電流明顯低于馬錢子堿（c），并且氧化過電位相較于玻碳電極上沒有降低，以上結(jié)果表明，氧化石墨烯對于馬錢子堿的電化學氧化的催化效果遠遠高于士的寧。

2.4 線性、重現(xiàn)性

以上結(jié)果表明，pH值為5.0的條件下在GO/GC電極上能夠?qū)崿F(xiàn)馬錢子堿的選擇性分析并能提高分析方法的靈敏度。在最優(yōu)的實驗條件下，用DPV技術(shù)對馬錢子堿的電化學氧化進行了線性考察，結(jié)果見圖 4。在0.5～1000μM的濃度范圍，氧化電流與馬錢子堿濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為 I（A）=0.053C（M）+0.57（0.5～100μM）和 I（A）=0.017C（M）+4.3（100～1000μM），相關(guān)系數(shù)為 0.99。根據(jù)LOD=3σ/K計算出本方法的檢測限為0.21μM，其中σ是對空白溶液進行20次測定反復測定的電流值的標準偏差，K是馬錢子堿在低濃度范圍內(nèi)的線性回歸方程的斜率。用該方法對400μM馬錢子堿進行反復8次的測量，馬錢子堿氧化峰電流大小基本一致，其相對標準偏差為 3.4%，說明電極具有很好的重現(xiàn)性。此外，我們還用該方法對生理樣品中常見的內(nèi)源性電活性物種進行了考察，結(jié)果表明抗壞血酸、多巴胺、尿酸、5-羥色胺，腎上腺素、去甲腎上腺素、以及葡萄糖對該方法不干擾（數(shù)據(jù)未列出）。因此該方法具有良好的線性、重現(xiàn)性和靈敏度、并有效地避免士的寧和其他電活性物種的干擾，可用于實際樣品中馬錢子堿的定量分析。

圖4 （A）0.5-1000μM的馬錢子堿在GO/GC電極上的DPV曲線；（B）馬錢子堿的氧化峰電流與其濃度之間的線性關(guān)系Fig.4 （A）DPVs obtained containing brucine with the concentration ranged from 0.5 to 1000μM；（B）Linear plots of oxidation peak current versus the concentration of brucine

2.5 制馬錢子中馬錢子堿的分析

以上結(jié)果表明該方法分析性能良好，可以用于實際樣品中馬錢子堿的定量分析。我們用該分析方法對馬錢子中馬錢子堿的含量進行了測定。對馬錢子待測樣品儲備液用pH值為5.0 BR緩沖液分別進行了10倍、25倍、50倍的稀釋，稀釋后的樣品的電化學測試結(jié)果見圖5。

圖5 不同稀釋倍數(shù)的馬錢子儲備液在GO/GC電極上的DPV曲線Fig.5 Typical DPVs obtained for the diluted Strychni Semen solution

結(jié)果表明，不同稀釋倍數(shù)的馬錢子在GO/GC電極上有明顯的響應，且隨著稀釋倍數(shù)的增加，馬錢子堿的氧化電流響應降低。根據(jù)稀釋倍數(shù)計算出實際樣品的濃度結(jié)果見表1。

表1 本方法測定制馬錢子中的馬錢子堿含量的結(jié)果Tab.1 Electrochemical detection of brucine in Strychni Semen

制馬錢子中馬錢子堿的含量為（198.89±0.04）μM（n=9）。同一批樣品用經(jīng)典的高效液相色譜-質(zhì)譜法進行測定，結(jié)果為（203.33±0.11）μM（數(shù)據(jù)未列出），顯著性檢驗結(jié)果表明，本工作建立的電化學分析方法和和經(jīng)典的高效液相色譜-質(zhì)譜法比較沒有顯著性差異。以上結(jié)果表明該方法可準確用于馬錢子中馬錢子堿含量的測定。

3 結(jié)論

本研究基于馬錢子堿和士的寧電化學氧化的電極過程對介質(zhì)的pH值依賴性不同，通過篩選介質(zhì)的pH值實現(xiàn)了士的寧和馬錢子堿氧化峰電位的分離，避免了士的寧對馬錢子中馬錢子堿的電化學分析的干擾；同時采用氧化石墨烯提高馬錢子堿電化學分析方法的靈敏度，從而建立了一種基于石墨烯修飾電極的馬錢子堿的電化學分析方法。該方法簡單快速、靈敏可靠、選擇性好，能夠?qū)χ岂R錢子中馬錢子堿進行準確的定量分析。本研究將為理解馬錢子中毒機制和研究其毒性物質(zhì)基礎提供有效的手段和方法，為指導馬錢子的臨床合理用藥提供科學依據(jù)。