人乳頭瘤病毒核酸分型定量檢測(cè)試劑盒的研發(fā)與評(píng)估

張蓉

（江蘇碩世生物科技股份有限公司上海分公司，上海201114）

宮頸癌是女性第二常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于乳腺癌，也是目前唯一一個(gè)病因明確的惡性腫瘤[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)，2018 年估計(jì)有57 萬例新病例，占所有女性癌癥死亡人數(shù)的7.5%。每年估計(jì)超過31.1 萬例死于宮頸癌，超過85%發(fā)生在欠發(fā)達(dá)地區(qū)[2]。在發(fā)達(dá)國家，女性可以接受針對(duì)人乳頭瘤病毒的疫苗接種，并可以對(duì)婦女進(jìn)行定期篩查，在易于治療的階段識(shí)別出癌前病變。因此可以大大降低宮頸癌的發(fā)生。人乳頭瘤病毒（HPV）是一種主要存在于人皮膚、黏膜及女性宮頸上皮細(xì)胞異形區(qū)的病毒。1995 年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）正式宣布HPV 某些型別持續(xù)性感染是導(dǎo)致宮頸癌的最主要因素。WHO 把與宮頸癌發(fā)生有關(guān)的HPV 型別稱為高危型，有HPV 16，18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82等；與腫瘤不相關(guān)的稱為低危型，最常見的為HPV 6, 11 和81等。研究提示在宮頸癌的發(fā)生中16、18 等高危型的致癌性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他型別[3-4]。美國陰道鏡和宮頸病理學(xué)會(huì)將16 和18 型陽性列為病理學(xué)檢測(cè)指癥。病毒載量被認(rèn)為是中度宮頸上皮內(nèi)瘤變（CINⅡ）或更高級(jí)別的宮頸上皮內(nèi)瘤變的潛在生物指征。本研究開發(fā)一個(gè)試劑盒，用于研究HPV 型別及載量在臨床上的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 臨床樣本及參考品

因暫無人乳頭狀瘤病毒體外培養(yǎng)技術(shù)，本研究采用HPV16型國際標(biāo)準(zhǔn)品、宮頸腺癌細(xì)胞Hela 細(xì)胞、鱗癌細(xì)胞Siha、重組HPV 質(zhì)粒及臨床樣本等進(jìn)行性能評(píng)估。采用的樣本來源于2011.07～2013.12 期間臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)收集的宮頸脫落細(xì)胞剩余樣本。

1.1.2 儀器

SLAN-96P 熒光定量PCR 儀購買自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.1.3 試劑

人乳頭瘤病毒核酸分型定量檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法）自主研發(fā)，采用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)，主要以HPV L1 區(qū)為靶區(qū)域，可一次性檢測(cè)21 種常見HPV 高、中、低危型及取樣細(xì)胞數(shù)，并通過參考基因與待測(cè)細(xì)胞的線性關(guān)系獲得HPV16 型在單位細(xì)胞中的載量。

1.2 方法

1.2.1 試劑性能驗(yàn)證

性能評(píng)估包括最低檢測(cè)限、HPV 分型準(zhǔn)確度、HPV16 型定量準(zhǔn)確度、線性范圍、特異性、精密度評(píng)價(jià)等。

a.最低檢測(cè)限：采用陽性參考品進(jìn)行梯度稀釋確定本試劑盒的靈敏度。將一定濃度的HPV 陽性參考品進(jìn)行10 倍倍比稀釋，用于反應(yīng)體系靈敏度的確定，當(dāng)陽性檢出率≥95%時(shí)的濃度即為試劑盒的最低檢出限。另外，采用21 個(gè)HPV 國家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋至最低檢測(cè)限濃度（1×104copies/ml，等同于20copies/反應(yīng)），重復(fù)檢測(cè)20 次，以驗(yàn)證本試劑盒的最低檢測(cè)限。

b.HPV 分型準(zhǔn)確度：采用細(xì)胞系、20 個(gè)HPV 型別國家標(biāo)準(zhǔn)品和HPV68 型參考品對(duì)試劑盒的分型準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

c.定量準(zhǔn)確度：采用HPV16 型國際標(biāo)準(zhǔn)品（1×107IU/ml）、人白細(xì)胞樣本、HPV16 型定量參考品（濃度為104copies/mL，104個(gè)/mL 白細(xì)胞作為基質(zhì)）分別對(duì)HPV16 型、參考基因以及HPV16型感染單位的定量準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。以上量值進(jìn)行測(cè)定后，按照B=M-T 公式（B- 絕對(duì)偏差；M- 測(cè)試結(jié)果均值；T- 參考物質(zhì)標(biāo)示值）進(jìn)行計(jì)算。絕對(duì)偏差均不超過±0.5 個(gè)對(duì)數(shù)數(shù)量級(jí)為量值準(zhǔn)確度的標(biāo)準(zhǔn)。

d.線性范圍：分別對(duì)HPV16 型定量參考品和參考基因的線性范圍進(jìn)行研究，將1×1012copies/ml 濃度的HPV16 型、參考基因質(zhì)粒分別進(jìn)行梯度稀釋，使用多項(xiàng)式回歸分析判斷校準(zhǔn)曲線是否具有線性，根據(jù)R2大于0.995 從而判斷本試劑盒的檢測(cè)范圍。

e.特異性驗(yàn)證：采用本研究試劑盒檢測(cè)與人乳頭瘤病毒感染部位相同、癥狀相似的病原體及于試劑盒檢測(cè)范圍之外的其它病原體來驗(yàn)證試劑盒的特異性，細(xì)菌的濃度為106cfu/ml，病毒的濃度為105pfu/ml，HPV 特異性型別的濃度為106copies/ml。檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞樣本中可能存在的干擾物質(zhì)，具體組分和濃度如下表1。

表1 干擾物質(zhì)及病原體

f. 精密度評(píng)價(jià)：采用精密性參考品對(duì)試劑盒進(jìn)行精密度評(píng)估，每份參考品重復(fù)檢測(cè)20 次。對(duì)熒光PCR 數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)價(jià)批內(nèi)、批間變異系數(shù)，要求變異系數(shù)CV 小于5%（定量采用濃度對(duì)數(shù)計(jì)算）。

1.2.2 臨床試驗(yàn)

試驗(yàn)共采集2140 份樣本進(jìn)行本試劑盒的定性檢測(cè)，其中508 份HPV16 型樣本進(jìn)行定量檢測(cè)*。通過與 人乳頭狀瘤病毒(HPV)分型檢測(cè)試劑盒(PCR+膜雜交法)）的一致性評(píng)價(jià)來確定試劑盒的有效性。另外，以病理或細(xì)胞學(xué)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行HPV16 型定量結(jié)果的評(píng)價(jià)。將病理學(xué)結(jié)果按照宮頸癌的病變程度分為4 個(gè)等級(jí)：第1 組為未見上皮病變或惡性改變（NILM）；第2 組為低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）；第3 組為高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）；第4 組為癌癥。觀察不同病毒等級(jí)組間的差異，以病理等級(jí)為金標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證HPV16 型載量臨床Cutoff 值（16600拷貝/10000 個(gè)細(xì)胞）的靈敏度和特異性。

注：*其中的一家中心817 份樣本數(shù)據(jù)（包含313 例HPV16型，用于定量分析）已經(jīng)發(fā)表在BMC Cancer[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算計(jì)量資料的均數(shù)、方差、標(biāo)準(zhǔn)差和CV，以及臨床一致性的陽性符合率、陰性符合率、總符合率、Kappa 值。

2 結(jié)果

2.1 試劑性能驗(yàn)證

2.1.1 最低檢測(cè)限

本研究對(duì)反應(yīng)體系的靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，濃度為1×104copies/ml 的21 個(gè)HPV 國家標(biāo)準(zhǔn)品檢出率分別都大于95%。因此本試劑盒反應(yīng)體系的靈敏度確定為1×104copies/ml（20 copies/反應(yīng)）。

2.1.2 HPV 分型準(zhǔn)確度

檢測(cè)以上參考品，陽性符合率和陰性符合率均為100%。

2.1.3 定量準(zhǔn)確度

分別對(duì)HPV16 型定量準(zhǔn)確度、參考基因定量準(zhǔn)確度以及HPV16 型感染單位（拷貝數(shù)/10000 細(xì)胞）量值測(cè)定結(jié)果如下表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，試劑盒對(duì)HPV16 型國際標(biāo)準(zhǔn)品、參考基因以及HPV16 型感染單位的濃度的絕對(duì)偏差均不超過±0.5 個(gè)對(duì)數(shù)數(shù)量級(jí)，符合試劑盒性能要求。

2.1.4 線性范圍

確定HPV16 型的線性范圍是1×1010copies/ml 至1×104copies/ml，參考基因的線性范圍是5×109copies/ml 至2×103copies/ml，當(dāng)處于以上濃度范圍時(shí)，所有點(diǎn)都處于一條直線上，線性相關(guān)系數(shù)R2大于0.995。

2.1.5 特異性驗(yàn)證

與人乳頭瘤病毒感染部位相同、癥狀相似的病原體及于試劑盒檢測(cè)范圍之外的其它病原體均無交叉。干擾物質(zhì)研究時(shí)，經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)組P 值均大于0.05，差異不顯著，說明以上濃度干擾物質(zhì)對(duì)試劑盒的分型和定量檢測(cè)沒有影響。

2.1.6 精密度評(píng)價(jià)

采用3 個(gè)批次試劑，驗(yàn)證試劑盒的批內(nèi)和批間精密度，其變異系數(shù)CV 均小于5%。說明本研究試劑精密度較高。

2.2 臨床對(duì)比評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2.1 人乳頭瘤病毒分型檢測(cè)結(jié)果

在2140 例臨床檢測(cè)樣本中，陽性樣本數(shù)最多的前4 個(gè)型別分別是16 型（630 例）、52 型（423 例）、58 型（286 例）、18 型（217例）。對(duì)兩種方法進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)，總體陽性符合率為91.2%，陰性符合率為98.2%，總符合率為97.7%，Kappa 值為0.823。其中HPV16、18、31、66、53、33、58、45、52、68、39、6、11 的檢出結(jié)果一致性較好，kappa 系數(shù)均大于0.75(P＜0.05)。差異樣本經(jīng)基因測(cè)序驗(yàn)證，得知對(duì)于兩種試劑盒結(jié)果中21 個(gè)型別不符的樣本有944 例（同一樣本有多型別不符按多個(gè)納入統(tǒng)計(jì)），對(duì)照試劑的準(zhǔn)確率為17.90%，本研究方法準(zhǔn)確率為82.10%。一致性較低的HPV59、56、35、51、81，均為對(duì)照試劑漏檢導(dǎo)致，因此可以明顯看出本方法在分型方面靈敏度及準(zhǔn)確率明顯優(yōu)于對(duì)照試劑。

2.2.2 HPV16 載量與病理等級(jí)的相關(guān)性

對(duì)508 例HPV16 樣本的定量結(jié)果按照病理學(xué)等級(jí)進(jìn)行分級(jí)，1-4 級(jí)的病毒感染單位中位數(shù)為2128（245 例）、45622.93（78例）、84721.2（115 例）、92846.35（70 例）。通過Wilcoxon 檢驗(yàn)進(jìn)行1 級(jí)與2-4 級(jí)間的差異性分析，結(jié)果P 值小于0.0001，表明病理等級(jí)在CINⅠ-Ⅱ以上（2-4 級(jí)）同病理檢查正常、炎癥間病毒感染量有顯著性差異。

將HPV16 型樣本的檢測(cè)載量按產(chǎn)品的臨床Cutoff 值劃分為陽性和陰性，以病理結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)分析載量預(yù)測(cè)的效果。其靈敏度為72.62%，特異度為72.24%。HPV16 型定量檢測(cè)通過cutoff值判定病理等級(jí)CINⅠ- Ⅱ及以上等級(jí)的準(zhǔn)確率在72.44%（68.33%～76.28%），對(duì)臨床診斷有一定輔助意義。

表2 定量準(zhǔn)確度參數(shù)

3 討論

就大多數(shù)患者而言，從感染到最終宮頸癌的發(fā)生存在一個(gè)緩慢的潛伏期，因此，及時(shí)定期檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞中HPV 的有無及載量的變化在宮頸癌的早期篩查、輔助診斷和愈后評(píng)估等環(huán)節(jié)中顯得尤為重要。本研究研制的“人乳頭瘤病毒核酸分型定量檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法）”采用熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)適齡婦女進(jìn)行宮頸癌的早期篩查，對(duì)HPV21 個(gè)型別進(jìn)行核酸水平的分型和定量分析。從性能評(píng)價(jià)和臨床驗(yàn)證結(jié)果可以看到試劑盒各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求，與臨床已上市產(chǎn)品相比，HPV 型別檢測(cè)的一致性較高。

而關(guān)于HPV 型別載量與宮頸疾病進(jìn)程相關(guān)性一直是近年來研究的關(guān)注點(diǎn)，Kim J 等研究推測(cè)在HPV 16、18 和58 感染病例中，型別特異性病毒載量可能是一個(gè)強(qiáng)有力的HSIL+診斷指標(biāo)，如果在所有其他高危HPV 型中也得到證實(shí)，病毒載量檢測(cè)可能導(dǎo)致細(xì)胞學(xué)異常的診斷策略發(fā)生轉(zhuǎn)變[6]。在HPV16 感染的患者中，病毒載量與高級(jí)別上皮內(nèi)病變或?qū)m頸癌相關(guān)，這可以作為腫瘤進(jìn)展和宮頸癌篩查的有效預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物[7]，且研究提示于高病毒載量的患者，特定的隨訪可能有用[8]。本研究根據(jù)臨床數(shù)據(jù)，也提示通過HPV16 型病毒載量預(yù)測(cè)病理等級(jí)CINⅠ-Ⅱ及以上等級(jí)的準(zhǔn)確率在72.44%，病毒載量的測(cè)試可以用于疾病進(jìn)程的分流中，具有一定的臨床診斷意義。且本方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，適合于臨床HPV DNA 檢查和大規(guī)模的樣本篩查，為人乳頭瘤病毒的快速篩查提供更有效的輔助手段。