miR-326-3p對視網膜祖細胞分化調控作用的研究

高慧芹 莊艾 張丹丹 谷平

視網膜退行性疾病主要包括年齡相關性黃斑變性 (age-related macular degeneration,AMD)、視網膜色素變性(retinal degeneration,RP)、Stargardt's病等[1]。視網膜退行性疾病雖然病因病程進展等不盡相同，但該類疾病的共同特點是: 視網膜中的關鍵細胞(如感光細胞、視網膜色素上皮細胞和神經節(jié)細胞)變性、死亡，患者的視功能逐漸喪失至失明，目前仍然沒有好的治療辦法。近年來，隨著對干細胞及其應用研究的深入，干細胞的細胞替代治療有望為此類疾病的治療提供新的途徑。目前治療視網膜退行性疾病的干細胞主要為胚胎干細胞、誘導多能性干細胞以及成體干細胞[2]，前兩種細胞都有成瘤的可能性，相比之下，視網膜祖細胞(retinal progenitor cells, RPCs)為成體干細胞的一種，具有自我更新和分化成視網膜各類神經元的能力，因它們不具有成瘤性，并且能夠免疫豁免，被認為是極具臨床應用前景的替代細胞。

然而，RPCs雖能成功地從胚胎或出生后早期的視網膜中分離提取出來，但體外誘導分化的干細胞定向分化為功能性視網膜神經元的能力有限，限制了其未來的臨床應用[3]，因此如何提高RPCs的分化能力，是目前該領域研究的焦點之一。針對干細胞定向分化的難題，運用基因修飾調控干細胞分化的研究日益受到關注。

微小 RNA(micro RNA，miRNA)作為重要的表觀遺傳調控因子廣泛存在于生物界，具有高度保守性， 是長度約為18～25個核苷酸的小分子非編碼RNA， 主要通過與靶基因結合，導致 mRNA 降解或翻譯抑制，在轉錄后水平發(fā)揮表觀遺傳調控作用[4]。近年來，多個課題組發(fā)現(xiàn)一類與視網膜發(fā)育及光感受器細胞分化密切相關的miRNAs(miR-96, miR-143, miR-145, miR-183等)[5-7]能夠調控干細胞分化，在本實驗中，我們研究了miR-326-3p對RPCs分化的作用，旨在為干細胞移植治療視網膜退行性疾病研究提供新的實驗依據(jù)。

資料與方法

一、實驗材料

RPCs從出生1 d C57BL/6小鼠的視網膜中分離，增殖培養(yǎng)基(進口DMEM/F12含20 ng/ml EGF、1%N2、2mM L-谷氨酰胺)，分化培養(yǎng)基(進口DMEM/F12含1%N2、2mM L-谷氨酰胺、10%FBS)，胰酶消化液 ( Invitrogen)，TRIzol試劑盒(Invitrogen)，逆轉錄試劑盒(Takara),蛋白裂解液和BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific)，PVDF膜(Millipore)，抗體GFAP(Chemicon)、抗體PKC-a(BD)、抗體Recoverin(Millipore)、抗體Rhodopsin(Chemicon)、抗體β 3-tubulin(Chemicon)、抗體β-actin (Sigma)、 抗體- rabbit/mouse IgG(Sigma)。

二、細胞處理及分組

分離后的RPCs種植于增殖培養(yǎng)液中，3 d后消化傳代，定期傳代換液。在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)RPCs,分別于于0、1、4、7 d提取培養(yǎng)細胞的總RNA和蛋白，經qPCR實驗和Western blotting實驗檢測RPCs分化指標GFAP、PKC-a、Recoverin、Rhodopsin和β 3-tubulin的表達水平變化以及miR-326-3p的表達水平變化。把RPCs細胞隨機分為3組，分別為對照組(Control組)、miR-326-3p過表達組(Mimics組)和miR-326-3p敲降組(Inhibitors組)，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)待細胞融合至70%后，分別轉染miR-326-3p-Control、Mimics和Inhibitor,轉染72 h后，再次轉染miR-326-3p-Control、Mimics和Inhibitors，再次轉染48～72 h后分別收取3組細胞的RNA和蛋白樣本，用于后期的qPCR實驗和Western blotting實驗。

三、實驗方法

1. RNA提取和qPCR實驗：使用Trizol提取細胞總RNA，使用反轉錄試劑盒反轉獲得cDNA(方法如廠家所述)。隨后以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測，以 β-actin和U6分別為mRNAs和miRNAs的內參。PCR 引物序列: GFAP Forward (5′-3′)：agaaaaccgcatcaccattc，Reverse (5′-3′)：tcacatcaccacgtccttgt；PKC-a Forward (5′-3′)：cccattccagaaggagatga，Reverse (5′-3′)：ttcctgtcagcaagcatcac；Rhodopsin Forward (5′-3′)：tcaccaccaccctctacaca，Reverse (5′-3′)：tgatccaggtgaagaccaca；Recoverin Forward (5′-3′)：atggggaatagcaagagcgg，Reverse (5′-3′)：gagtccgggaaaaacttggaata；

β 3-tubulin Forward (5′-3′)：cgagacctactgcatcgaca，Reverse (5′-3′)：cattgagctgaccagggaat；

β-actin Forward (5′-3′)：agccatgtacgtagccatcc，Reverse (5′-3′)：ctctcagctgtggtggtgaa；miR-326-3p Forward(5′-3′)：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagactggagg，Reverse (5′-3′)：acactccagctgggcctctgggcccttcct；

U6 Forward(5′-3′)：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagaacgc，Reverse (5′-3′)：acactccagctgggacgcaaattcgtgaag；

2. 蛋白提取及Western blotting：用含蛋白酶抑制劑裂解液提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量，95 ℃煮沸10 min，按每孔20 μg蛋白量，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離蛋白。轉膜90min后，5%脫脂奶粉的吐溫磷酸緩沖液(PBST)封閉1 h，一抗(1:1000)4 ℃孵育過夜，PBST洗3次膜，二抗(1:2000)孵育1 h，PBST再洗膜3次，隨后使用ECL化學發(fā)光液進行顯影拍照。

四、統(tǒng)計分析與圖標的制作

結 果

一、RPCs分化過程中分化指標的表達變化

在RPCs細胞分化過程中，RPCs分化特異性指標GFAP、PKC-a、Rhodopsin、Recoverin和β 3-tubulin的mRNA和蛋白表達水平都不斷地增加(圖1)。

二、RPCs分化過程中miR-326-3p表達水平逐漸增加

RPCs分別在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)0、1、4、7 d，qPCR實驗證明RPCs分化過程中內源性miR-326-3p的mRNA表達水平不斷地增加，提示miR-326-3p可能在RPCs細胞分化中發(fā)揮重要作用(圖2)。

三、檢測miR-326-3p過表達敲降效率

RPCs轉染48 h后，收取樣本，檢測3組細胞中miR-326-3p表達量的變化，相對于對照組，過表達miR-326-3p組中其表達量明顯地增加，而敲除miR-326-3p組中其表達量明顯地降低，表明轉染成功(圖3)。

四、miR-326-3p促進RPCs細胞的分化

過表達miR-326-3p后，在mRNA和蛋白水平RPCs分化指標GFAP、PKC-a、Rhodopsin、Recoverin和β3-tubulin相比較于對照組都有明顯的增加，表明miR-326-3p促進RPCs分化，特別是向視網膜神經元細胞分化能力增強(PKC-a、Rhodopsin、Recoverin表達量上升的更加明顯)；而敲除miR-326-3p后，這些分化指標相比較于對照組都有明顯的降低，表明敲除miR-326-3p后抑制RPCs的分化(圖4)。

討 論

視網膜退行性疾病，其特征是視網膜神經元細胞的逐漸喪失，導致視力的不可逆下降，甚至失明。由于變性和凋亡的神經細胞不能再生，干細胞移植是最具臨床應用前景的治療方法[8]。目前治療視網膜退行性疾病的種子細胞主要包括視網膜祖細胞(RPCs)、胚胎干細胞和誘導多能干細胞，三種干細胞中，從視網膜分離的RPCs因沒有成瘤和免疫反應等問題成為干細胞移植治療首選細胞[9]。

RPCs可以與視網膜整合，分化為視網膜神經元細胞，形成突觸連接，甚至改善視覺功能[10-12],但其向視網膜神經元分化能力有限，是其未來臨床應用的潛在的重要障礙。越來越多的研究表明，microRNA對決定干細胞的命運有著至關重要的影響[13]。本課題組也先后發(fā)現(xiàn)一群miRNAs(miR-9, let-7b,miR-29a等)對RPCs的增殖分化具有重要調控作用[14-16]。在本研究中，我們的數(shù)據(jù)表明，內源性miR-326-3p在RPCs的分化過程中表達量明顯地上調，過表達miR-326-3p后RPCs分化能力明顯增強。綜上所述，我們的實驗證明了miR-326-3p促進RPCs的分化。未來的研究我們將進一步闡明miR-326-3p如何對RPCs分化起到促進作用，以及miR-326-3p在視網膜發(fā)育和體內功能中的具體作用，以期為視網膜祖細胞移植治療視網膜退行性疾病提供新的思路和方法。

綜上所述，外源性過表達 miR-326-3p后促進RPCs分化，特別是向視網膜神經元細胞分化能力增強，我們可以通過對RPCs基因修飾作用以促進其向視網膜神經元方向分化的作用，為視網膜祖細胞的移植治療提供新的實驗依據(jù)。