神經(jīng)類固醇在阿普唑侖抗大鼠焦慮樣行為效應(yīng)中的作用研究

梁鈺華 黎少英 陳淑華

（廣州市番禺中心醫(yī)院，廣東 廣州 511400）

焦慮癥是一種社會(huì)性精神性障礙疾病。其發(fā)病影響著發(fā)病者的日常行為，目前，該疾病已成為全球關(guān)注和研究的精神性衛(wèi)生難題。流行病學(xué)分析顯示全球患者中約有20%的患者可能終身性患有焦慮癥。焦慮癥患者主要有以下癥狀，如神經(jīng)失常和不安，機(jī)體方面可能有自主性肌肉緊張等。其發(fā)病給國(guó)家，家庭和個(gè)人都帶來極大的負(fù)面影響[1-2]。據(jù)此，焦慮癥的研究和治療收到越來越多學(xué)者的關(guān)注。

目前尚未明確焦慮癥的發(fā)病機(jī)制，研究顯示焦慮癥的發(fā)病涉及多種因素。其中傳統(tǒng)研究的影響因素為腦區(qū)單胺功能和水平的紊亂。而在單胺遞質(zhì)系統(tǒng)中，去甲腎上腺素，多巴胺，5-羥色胺（serotonin，5-HT）等遞質(zhì)水平的異常是焦慮的發(fā)病機(jī)制重要影響因素[3]。根據(jù)焦慮癥的發(fā)病機(jī)制，5-HT再攝取抑制劑是臨床上常用的抗焦慮藥物之一，具體代表藥有舍曲林和帕羅西汀等[4]。該類藥物的作用機(jī)制是通過作用于機(jī)體中5-HT受體，使5-HT水平正常化而產(chǎn)生抗焦慮作用。然而，5-HT再攝取抑制劑在臨床上抗焦慮須慎用，這體現(xiàn)在其具有起效較慢，有效率不高，可導(dǎo)致服用者自殺傾向等不良反應(yīng)[5]。根據(jù)以上該類藥物在臨床使用中的種種不足，挖掘強(qiáng)效低毒的抗焦慮藥物對(duì)臨床防治焦慮癥具有重要意義。

研究顯示神經(jīng)類固醇與焦慮癥的發(fā)病有關(guān)，其體現(xiàn)在焦慮癥患者中，部分腦區(qū)（如前額平層和海馬體）的神經(jīng)類固醇（如四氫孕酮，孕酮和孕烯醇酮等）水平的紊亂可能導(dǎo)致焦慮癥的發(fā)生[6]。而神經(jīng)類固醇水平的正?；哂酗@著的抗精神性疾病的作用，如抗驚恐，抗應(yīng)激，抗抑郁，抗焦慮等。其作用靶點(diǎn)是γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）受體。阿普唑侖是傳統(tǒng)的抗焦慮藥物，其起效途徑是作用于GABAA受體，提高GABA能中神經(jīng)傳遞和突觸后抑制作用，使腦區(qū)多巴胺的釋放降低。然而，阿普唑侖的作用途徑是否與神經(jīng)類固醇有聯(lián)系還在研究。而本研究也嘗試通過動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)神經(jīng)類固醇（如四氫孕酮，孕酮和孕烯醇酮）在阿普唑侖抗焦慮效應(yīng)中所扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物：大鼠（SD品屬，雄性，體質(zhì)量為180±20 g）飼養(yǎng)于動(dòng)物房中。在飼養(yǎng)大鼠的過程中，動(dòng)物可以自由攝食和飲水，同時(shí)給予每天12 h的光照。每組實(shí)驗(yàn)大鼠為10只，每5只一籠飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境。飼養(yǎng)的溫度為18-24 ℃，濕度為54%-56%。

1.2 藥物與試劑：阿普唑侖用0.9%的生理鹽水進(jìn)行處理。藥物對(duì)大鼠的給藥方式為腹腔給藥，給藥的容積為2 mL/kg。選用的劑量范圍是根據(jù)前期文獻(xiàn)中其抗焦慮和抗抑郁的劑量范圍 （0.5，1，2 mg/kg)[7-8]。正常對(duì)照組大鼠則給予相應(yīng)體積的溶媒（0.9%的生理鹽水）。連續(xù)對(duì)大鼠給予阿普唑侖7 d后采用動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其抗焦慮活性。在檢測(cè)行為學(xué)效應(yīng)前1 h給予藥物。具體的實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。

1.3 大鼠Vogel飲水沖突實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第8日進(jìn)行大鼠Vogel飲水沖突實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)是具有評(píng)價(jià)抗焦慮藥物藥理效應(yīng)的作用[9]。在大鼠Vogel飲水沖突實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物首先禁止飲水48 h，然后單獨(dú)置于帶有電柵的實(shí)驗(yàn)籠中。當(dāng)大鼠在實(shí)驗(yàn)籠中飲水每20次以后，電柵對(duì)大鼠進(jìn)行1次足底電擊，電擊調(diào)條件為0.30 mA，持續(xù)2 s，記錄在3 min內(nèi)大鼠的舔水次數(shù)。

1.4 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第10日進(jìn)行大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)是具有評(píng)價(jià)抗焦慮藥物藥理效應(yīng)的作用[10]。大鼠高架十字迷宮主要有以下的部件構(gòu)成：兩條長(zhǎng)和寬分別為60 cm×12 cm的開臂以及兩條長(zhǎng)、寬、高分別為60 cm×12 cm×40 cm的閉臂組成。四臂交匯于一中央平臺(tái)，面積為12 cm×12 cm。迷宮的底面與地面的距離為50 cm。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，實(shí)驗(yàn)者將動(dòng)物放置于中央平臺(tái)，頭朝閉臂，觀察和記錄動(dòng)物的5 min內(nèi)的活動(dòng)狀況。記錄指標(biāo)如下：大鼠的總?cè)氡鄞螖?shù)和總?cè)氡蹠r(shí)間，開臂進(jìn)入次數(shù)和開臂停留時(shí)間。通過以上指標(biāo)，進(jìn)一步計(jì)算出進(jìn)入開臂次數(shù)的百分?jǐn)?shù)和在開臂停留時(shí)間的百分?jǐn)?shù)。

1.5 開場(chǎng)試驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第12日進(jìn)行大鼠開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)主要研究阿普唑侖對(duì)大鼠自發(fā)活動(dòng)的影響。實(shí)驗(yàn)采用大鼠開場(chǎng)箱進(jìn)行。大鼠開場(chǎng)箱的構(gòu)造如下：儀器由長(zhǎng)、寬、高分別為76 cm×76 cm×46 cm不透明的塑料板構(gòu)造。在儀器的底面則等面積劃分為16個(gè)方格。本試驗(yàn)評(píng)價(jià)阿普唑侖在抗焦慮樣行為效應(yīng)同時(shí)對(duì)大鼠動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)的影響（第12天）。大鼠須在相對(duì)安靜的環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)者把大鼠單獨(dú)置于儀器底面，觀察和記錄其5 min內(nèi)的站立次數(shù)，跨格數(shù)和糞便顆粒數(shù)。以上指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)大鼠的自發(fā)活動(dòng)。

1.6 大鼠腦區(qū)神經(jīng)類固醇（四氫孕酮，孕酮，孕烯醇酮）的含量檢測(cè)：本部分實(shí)驗(yàn)屬于機(jī)制探討研究，主要研究神經(jīng)類固醇，如四氫孕酮，孕酮，孕烯醇酮在阿普唑侖抗焦慮藥理效應(yīng)中的作用。在開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)完成后的24 h以內(nèi)，將動(dòng)物進(jìn)行斷頭處死。動(dòng)物處死后取其海馬體和前額皮層做后續(xù)檢測(cè)。每100 mg的動(dòng)物腦組織加入1 mL的組織裂解液（內(nèi)含蛋白酶抑制劑），然后低溫電動(dòng)使組織勻漿。勻漿后把樣品標(biāo)號(hào)并轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中離心。離心條件為10000 r/min 4 ℃，離心時(shí)間為25 min。離心完后取少量上清液進(jìn)行蛋白濃度的定量，通過稀釋液稀釋使蛋白濃度定量為4 μg/μL。樣品定量以后將其放置于-80 ℃冰箱備測(cè)。實(shí)驗(yàn)前把四氫孕酮ELISA試劑盒，孕酮ELISA試劑盒，孕烯醇酮ELISA試劑盒放置于室溫下平衡。實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)置相關(guān)實(shí)驗(yàn)孔：空白對(duì)照孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔，樣品孔。其中，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入標(biāo)準(zhǔn)品100 μL；樣品孔先加入樣品稀釋液90 μL后再加入樣品10 μL。然后，每孔加入50 μL的抗體試劑和50 μL的酶標(biāo)試劑。采用保護(hù)膜把酶標(biāo)板覆蓋起來后，使用平板搖床在室溫下?lián)u晃，條件為3 h，600 rpm。搖晃處理后，用甩干的方法棄去液體，然后每孔加入300 μL的洗滌液，并靜置5 min。時(shí)間點(diǎn)過后甩去洗滌液，并用吸水紙拍干，如此步驟重復(fù)3遍。接著每孔加入pNpp底物溶液并在室溫下孵育1 h。最后每孔加入50 μL終止液結(jié)束樣品處理過程。在加入終止液15 min以內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和吸光度計(jì)算樣品的濃度。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用組間單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以P＜0.05顯示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 阿普唑侖抗大鼠焦慮樣行為實(shí)驗(yàn)研究流程：見圖1。大鼠在經(jīng)過適應(yīng)期以后，在第1日到第12日給予阿普唑侖（0.5，1，2 mg/kg）和相應(yīng)的溶媒。并在第8日進(jìn)行Vogel飲水沖突實(shí)驗(yàn)，在第10日進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和在第12日進(jìn)行開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完畢后，提取海馬體和前額皮層進(jìn)行后續(xù)機(jī)制研究。

圖1 阿普唑侖抗大鼠焦慮樣行為實(shí)驗(yàn)研究流程

2.2 阿普唑侖在大鼠Vogel飲水沖突實(shí)驗(yàn)中的抗焦慮行為效應(yīng)：見圖2。在大鼠Vogel飲水沖突實(shí)驗(yàn)中，阿普唑侖對(duì)大鼠的抗焦慮樣行為藥理效應(yīng)。通過One-way ANOVA統(tǒng)計(jì)分析顯示，與正常對(duì)照組的舔水次數(shù)相比，阿普唑侖可增加大鼠的舔水次數(shù)（P＜0.05），其有效劑量為1和2 mg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在該實(shí)驗(yàn)中，阿普唑侖具有顯著的抗焦慮樣行為作用。

圖2 顯示阿普唑侖在大鼠Vogel飲水沖突實(shí)驗(yàn)中對(duì)焦慮樣行為的改變。

2.3 阿普唑侖在大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中抗焦慮樣行為藥理效應(yīng)：圖3顯示在大鼠高架十字迷宮試驗(yàn)中對(duì)大鼠的抗焦慮樣行為藥理效應(yīng)。通過One-way ANOVA統(tǒng)計(jì)和分析顯示結(jié)果如下：與正常對(duì)照組的指標(biāo)相比，阿普唑侖可以增加大鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)（P＜0.05；圖3D）和停留時(shí)間（P＜0.05；圖3C），其有效劑量為1和2 mg/kg。然而，在該有效劑量下，大鼠的總?cè)氡鄞螖?shù)（P＞0.05；圖3B）和總?cè)氡蹠r(shí)間（P＞0.05；圖3A）均不受影響。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也提示阿普唑侖在劑量范圍下對(duì)大鼠具有顯著的抗焦慮樣行為藥理效應(yīng)。

圖3 顯示阿普唑侖在大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中抗焦慮樣行為效應(yīng)。

2.4 阿普唑侖在開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中對(duì)大鼠自發(fā)活動(dòng)的影響：圖4顯示在大鼠開場(chǎng)試驗(yàn)中，阿普唑侖對(duì)其自發(fā)活動(dòng)的影響。通過One-way ANOVA的統(tǒng)計(jì)和分析顯示如下：大鼠組與組之間在跨格數(shù)（P＞0.05；圖4A），站立次數(shù)（P＞0.05；圖4B） 和糞便顆粒數(shù)（P＞0.05；圖4C）這幾項(xiàng)指標(biāo)中均無顯著性差異。這樣的結(jié)果也提示阿普唑侖的處理不影響大鼠的自發(fā)活動(dòng)。

圖4 顯示在大鼠開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，通過跨格數(shù)，站立次數(shù)和糞便顆粒數(shù)體現(xiàn)阿普唑侖對(duì)其自發(fā)活動(dòng)的影響（n=10）。

2.5 阿普唑侖對(duì)大鼠前額皮層和海馬體中孕烯醇酮，孕酮和四氫孕酮含量的改變：圖5所顯示，阿普唑侖對(duì)大鼠前額皮層和海馬體中孕烯醇酮，孕酮和四氫孕酮含量的改變。通過One-way ANOVA的統(tǒng)計(jì)和分析顯示如下：與正常對(duì)照組中孕酮和四氫孕酮指標(biāo)對(duì)比，大鼠前額皮層（圖5A）和海馬體（圖5B）中孕酮（P＜0.05，前額皮層；P＜0.05，海馬體）和四氫孕酮 （P＜0.05，前額皮層；P＜0.05，海馬體）可被阿普唑侖（2 mg/kg）劑量處理后顯著提高。然而，這兩個(gè)腦區(qū)中孕烯醇酮的水平卻沒有因?yàn)榘⑵者騺龅膭┝刻幚矶a(chǎn)生顯著性變化（P＞0.05，前額皮層；P＞0.05，海馬體）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示阿普唑侖的抗焦慮樣行為藥理效應(yīng)與前額皮層和海馬體中的孕酮和四氫孕酮水平的提高密切聯(lián)系。

圖5 阿普唑侖對(duì)大鼠前額皮層和海馬體中孕烯醇酮，孕酮和四氫孕酮含量的改變。

3 討 論

在本研究中，我們主要通過經(jīng)典的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)阿普唑侖的抗大鼠焦慮樣行為效應(yīng)。這些經(jīng)典的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)包括高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)以及Vogel飲水沖突實(shí)驗(yàn)。Vogel飲水沖突實(shí)驗(yàn)屬于條件性的反射性實(shí)驗(yàn)。這種實(shí)驗(yàn)的原理主要是根據(jù)大鼠在禁止飲水時(shí)所產(chǎn)生的煩渴心理以及舔水時(shí)所受到電擊而產(chǎn)生的恐懼心理形成矛盾性行為沖突所開展的實(shí)驗(yàn)[6]。該實(shí)驗(yàn)對(duì)臨床評(píng)價(jià)抗焦慮藥的藥理效應(yīng)具有參考意義和應(yīng)用較為廣泛，主要是該實(shí)驗(yàn)可模擬人類的焦慮反應(yīng)行為。為增強(qiáng)說服力，本研究中采用另一種評(píng)價(jià)焦慮行為的實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)是高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)已被廣泛適用于評(píng)價(jià)多種嚙齒類動(dòng)物的焦慮樣行為，也是目前國(guó)際上所公認(rèn)的評(píng)價(jià)抗焦慮藥物藥效的途徑。

本實(shí)驗(yàn)采用長(zhǎng)期給藥的方式評(píng)價(jià)阿普唑侖對(duì)大鼠的抗焦慮樣行為藥理作用。在上述研究結(jié)果也顯示在大鼠Vogel飲水沖突實(shí)驗(yàn)中，大鼠的舔水次數(shù)在阿普唑侖的處理后顯著提高（圖2）。不僅在大鼠Vogel飲水沖突實(shí)驗(yàn)，在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，大鼠的開臂進(jìn)入次數(shù)（圖3D）和停留時(shí)間（圖3C）在阿普唑侖給藥后顯著增多。在兩種評(píng)價(jià)抗焦慮藥物藥理效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中，阿普唑侖均顯示明顯的抗焦慮樣行為活性，而且兩種實(shí)驗(yàn)中有效劑量范圍相同。這結(jié)果也提示著阿普唑侖在1 mg/kg和2 mg/kg的劑量范圍抗焦慮樣行為作用。不局限于本研究的結(jié)果，也有文獻(xiàn)報(bào)道阿普唑侖的抗焦慮和抗抑郁作用上的劑量范圍于本研究的結(jié)果一致[7-8]。據(jù)此，也提示著阿普唑侖在這個(gè)劑量范圍下藥理效應(yīng)的可靠性。

此外，在本實(shí)驗(yàn)研究中我們除了探索阿普唑侖的抗焦慮作用，還嘗試探討長(zhǎng)期給予阿普作用是否影響大鼠的自發(fā)活動(dòng)。據(jù)此，我們采用了經(jīng)典的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)大鼠的自發(fā)活動(dòng)變化。實(shí)驗(yàn)指標(biāo)為糞便顆粒數(shù)，站立次數(shù)和跨格數(shù)。在實(shí)驗(yàn)中結(jié)果顯示，在給藥過程中，阿普唑侖不影響大鼠的跨格數(shù)（圖4A），站立次數(shù)（圖4B）和糞便顆粒數(shù)（圖4C）這些指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示阿普唑侖長(zhǎng)期給藥不影響動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)。與此一致的是，在上述高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，阿普唑侖不影響大鼠總?cè)氡鄞螖?shù)（圖3B）和時(shí)間（圖3A）。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)均有指標(biāo)提示其一致性。

進(jìn)一步我們?cè)趧?dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完結(jié)后提取前額皮層和海馬體進(jìn)行機(jī)制研究。主要檢測(cè)這兩個(gè)腦區(qū)中神經(jīng)類固醇（如四氫孕酮，孕酮和孕烯醇酮）的水平，以進(jìn)一步探討阿普唑侖抗焦慮作用與這些神經(jīng)類固醇水平的相關(guān)性。結(jié)果顯示在海馬體（圖5B）和前額皮層（圖5A）中四氫孕酮和孕酮的水平可被阿普唑侖劑量范圍下提高。這個(gè)結(jié)果也提示阿普唑侖的抗焦慮樣行為效應(yīng)與這兩個(gè)腦區(qū)中孕酮和四氫孕酮水平的提高有關(guān)。對(duì)照文獻(xiàn)結(jié)果，有報(bào)道顯示阿普唑侖的抗抑郁樣行為效應(yīng)與提高以上兩個(gè)腦區(qū)中的四氫孕酮水平相關(guān)[8]。這個(gè)結(jié)果與本研究結(jié)果一致。結(jié)合文獻(xiàn)和本研究結(jié)果，阿普唑侖的抗焦慮樣行為效應(yīng)可能與提高海馬體和前額皮層兩個(gè)腦區(qū)中四氫孕酮水平有關(guān)。前期研究顯示焦慮癥的發(fā)病與腦區(qū)中四氫孕酮和孕酮水平的下降有關(guān)[9]。如焦慮癥患者腦髓液中四氫孕酮的水平較正常水平低，其原因可能與四氫孕酮合成關(guān)鍵酶5α還原酶水平下降有關(guān)。無獨(dú)有偶，在相關(guān)的焦慮實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)中，四氫孕酮和孕酮水平的下降可能成為大鼠至焦慮的重要誘因，其嚴(yán)重程度與大腦前額皮層中的以上兩種神經(jīng)類固醇水平合成有關(guān)。綜合本研究與前期研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，阿普唑侖的抗焦慮樣行為效應(yīng)可能與四氫孕酮和孕酮水平的正?；嘘P(guān)。尤其是四氫孕酮，其作用在GABA受體上特異性亞基后可產(chǎn)生相應(yīng)的藥理作用，如抗抑郁，抗驚恐，抗焦慮等藥理效應(yīng)。綜上所述，阿普唑侖具有顯著的抗焦慮作用，而該作用可能與提高特異性腦區(qū)海馬體和前額皮層中四氫孕酮和孕酮水平相關(guān)。然而，本研究中孕烯醇酮的水平則無顯著性改變，這可能是因?yàn)樵邢┐纪鳛橐陨蟽煞N神經(jīng)類固醇的上游產(chǎn)物。在轉(zhuǎn)化過程中對(duì)下游產(chǎn)物產(chǎn)生變化。更多和進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)需要驗(yàn)證以上的推測(cè)。