老年糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清中HIF-1α、miR-210水平與微血管損傷的關(guān)系

朱祥祥 陳震 饒卓群 王瓊 楊揚(yáng)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者體內(nèi)內(nèi)分泌失調(diào)造成的眼部神經(jīng)和微血管病變，以視力下降、視物模糊、失明為主要臨床表現(xiàn)[1]。但DR診治手段缺乏特異性，因此，尋找有效診治DR的指標(biāo)極其重要。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是一種機(jī)體應(yīng)答缺氧環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子，在DR中呈高表達(dá)，經(jīng)雙丹明目膠囊治療后，HIF-1α表達(dá)水平下調(diào)，推測(cè)HIF-1α可能在DR產(chǎn)生新生血管的過程中發(fā)揮重要作用[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有調(diào)控基因表達(dá)的非編碼RNA分子，參與多種糖尿病相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展，有望成為糖尿病相關(guān)疾病的生物標(biāo)志物[3]?；加蠨R后，患者體內(nèi)miRNA表達(dá)水平產(chǎn)生明顯改變，miR-126有望成為增值DR病情評(píng)估的重要指標(biāo)[4]。微小RNA-210(miRNA-210，miR-210)是一種特異性缺氧miRNA，其在Ⅰ型糖尿病患者血漿中顯著上調(diào)，其可能參與糖尿病相關(guān)疾病的早期發(fā)作[5]。基于此，本研究通過觀察HIF-1α、miR-210在老年DR患者血清中的表達(dá)情況、分析兩者關(guān)系及與微血管損傷的關(guān)系，以期為早期防治DR提供可靠依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

選取2016年2月至2018年11月診治的DR患者122例進(jìn)行研究(DR組)，其中男性49例，女性73例；年齡48～74歲，平均年齡(67.64±5.81)歲；并選擇本院同期治療的單純糖尿病患者127例進(jìn)行對(duì)照研究(單純糖尿病組)，其中男性52例，女性75例；年齡46～75歲，平均年齡(66.95±5.72)歲。兩組性別、年齡方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。收集兩組體質(zhì)指數(shù)、收縮壓、舒張壓、吸煙史、尿微量白蛋白、空腹血糖、糖化血紅蛋白、糖尿病病程、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等各方面的基本資料。根據(jù)檢眼鏡檢查和眼底熒光血管造影將DR患者分為57例非增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)組(NPDR組)和65例增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)組(PDR組)。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合糖尿病分類和診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]及中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)會(huì)眼底病學(xué)組制定的DR相關(guān)診斷和分類標(biāo)準(zhǔn)[7]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合DR或經(jīng)眼底檢查無(wú)視網(wǎng)膜病變的單純糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)者；(2)具有完整的診斷資料，且病情診斷明確；(3)自愿參與且中途無(wú)退出研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并原發(fā)性腎臟功能障礙者及其他肝腎功能疾病者；(2)患有心腦血管、精神類、神經(jīng)類病變者；(3)合并腫瘤、免疫類疾病者；(4)患有糖尿病其他急性并發(fā)癥者；(5)患有其他眼部疾病者。所有患者或者家屬簽署知情同意書，且本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)該項(xiàng)研究后實(shí)施，研究方法符合《赫爾辛基宣言》。

二、主要試劑與儀器

TRIzol 試劑(貨號(hào)：5301100)購(gòu)買于上海名勁生物科技有限公司，Transcriptor One-Step RT-PCR Kit(貨號(hào)：4655885001)購(gòu)買于上?？道噬锟萍加邢薰荆琓aqman Universal master mix(貨號(hào)：4347166)購(gòu)買于天津泰澤興業(yè)生物科技有限公司。

紫外分光光度計(jì)(型號(hào)：UV-2102PCS)購(gòu)買于石家莊成達(dá)飛科學(xué)器材有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號(hào)：美國(guó)ABI StepOnePlus)購(gòu)買于上海凌儀生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀(型號(hào)：BD FACSCalibur)購(gòu)買于上海普迪生物技術(shù)有限公司。

三、方法

1.樣本采集及預(yù)處理：采集單純糖尿病患者及DR患者空腹肘靜脈血8 ml，均分成兩份。一份用于檢測(cè)所有研究對(duì)象內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)、內(nèi)皮組細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)含量；另一份置于5 ml EP管中，靜置約40 min，3500 g離心12 min，分離上層血清，分裝，密封，保存于-80 ℃冰箱中，用于檢測(cè)HIF-1α、miR-210、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)相對(duì)表達(dá)水平。

2.qRT-PCR法檢測(cè)血清中HIF-1α、miR-210、VEGF表達(dá)水平：從-80 ℃冰箱中取出1.3.1預(yù)處理的血清樣本，冰上溶解，無(wú)菌環(huán)境中，按照TRIzol法提取所有研究樣本總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所有血清樣本總RNA純度、濃度。依照Transcriptor One-Step RT-PCR Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。依據(jù)TaqMan MicroRNA Assay、Taqman Universal master mix說(shuō)明書流程將所得cDNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。miR-210以U6為內(nèi)參，HIF-1α、VEGF以β-actin為內(nèi)參，其對(duì)應(yīng)引物序列見表1所示。以2-△△CT法計(jì)算HIF-1α、miR-210、VEGF表達(dá)水平。

3.ECs、EPCs水平檢測(cè)：采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血ECs、EPCs含量，求百分比，評(píng)估微血管損傷程度。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組基本資料比較

與單純糖尿病組相比，DR組DR患者收縮壓明顯升高，吸煙史比例和尿微量白蛋白含量明顯增高，糖尿病病程明顯延長(zhǎng)(P均<0.05)。見表2。

二、兩組血清HIF-1α、miR-210、VEGF水平及ECs、EPCs含量比較

與單純糖尿病組相比，DR組血清HIF-1α、miR-210、VEGF表達(dá)水平均明顯升高(P均<0.05)，外周血ECs含量明顯增高(P<0.05)，EPCs含量明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 兩組血清HIF-1α、miR-210、VEGF水平及ECs、EPCs含量比較

三、不同老年DR患者血清HIF-1α、miR-210、VEGF水平及ECs、EPCs含量比較

與NPDR組相比，PDR組患者血清HIF-1α、miR-210、VEGF表達(dá)水平均明顯升高(P均<0.05)，外周血ECs含量明顯增高(P<0.05)，EPCs含量明顯降低(P<0.05)。見表4。

表4 不同DR患者血清HIF-1α、miR-210、VEGF水平及ECs、EPCs含量比較

四、老年DR患者血清中HIF-1α、miR-210與VEGF、ECs、EPCs水平的關(guān)系

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析可知，DR患者血清中HIF-1α表達(dá)水平均與VEGF表達(dá)水平、ECs含量呈正相關(guān)(r=0.528、0.415，P均<0.05)，與EPCs含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.364，P<0.05)。

DR患者血清中miR-210表達(dá)水平均與VEGF表達(dá)水平、ECs含量呈正相關(guān)(r=0.422、0.513，P均<0.05)，與EPCs含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.436，P<0.05)。見表5。

表5 DR患者血清中HIF-1α、miR-210與外周血ECs、EPCs含量的關(guān)系

五、老年DR患者血清中HIF-1α、miR-210的相關(guān)性

Pearson法分析顯示，老年DR患者血清中HIF-1α與miR-210表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.518，P<0.05)。見圖1。

六、Logistic回歸分析老年DR發(fā)生PDR的影響因素

以DR是否發(fā)生PDR為因變量，收縮壓、吸煙史、尿微量白蛋白、糖尿病病程、HIF-1α、miR-210、VEGF為自變量納入Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，收縮壓、尿微量白蛋白、糖尿病病程、HIF-1α、miR-210、VEGF是老年DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表6。

表6 影響老年DR發(fā)生PDR的Logistic回歸分析

討 論

DR是以慢性缺血、缺氧為視網(wǎng)膜組織病理變化基礎(chǔ)，由多種血管生長(zhǎng)因子及抑制因子相互作用引起血管內(nèi)皮功能異常、微血管瘤、新生血管過度增生及微血管損傷所引發(fā)的糖尿病并發(fā)癥，發(fā)生率居高不下，可導(dǎo)致失明，給患者及其家庭帶來(lái)沉重的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[8]。因此，尋找可評(píng)估DR的指標(biāo)，分析其與微血管損傷的關(guān)系，并有效控制老年DR發(fā)生的影響因素，可有效提高患者生活、生存質(zhì)量。

HIF-1α是缺血、缺氧刺激細(xì)胞產(chǎn)生的特異性轉(zhuǎn)錄因子，可應(yīng)對(duì)細(xì)胞的缺氧狀況[9]。劉鵬等[10]研究顯示，HIF-1α在非增生型期DR中高水平，經(jīng)復(fù)方血栓通聯(lián)合羥苯黃酸鈣治療后，表達(dá)水平下降，可能參與非增生期DR的發(fā)生發(fā)展，可作為評(píng)估非增生期DR進(jìn)展的生物學(xué)指標(biāo)。HIF-1α、VEGF在DR中表達(dá)水平明顯上調(diào)，且兩者表達(dá)相互影響，通過干擾HIF-1α或使VEGF沉默，從而減少VEGF表達(dá)，有效抑制血管新生，HIF-1α有望成為防治DR的靶指標(biāo)[11]。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)DR中視網(wǎng)膜血管生成與HIF-1α水平升高密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)HIF-1α水平，進(jìn)而抑制血管新生，有效阻止DR的發(fā)生發(fā)展，為治療DR提供新思路。以上研究表明，DR發(fā)病進(jìn)程與HIF-1α、VEGF表達(dá)失調(diào)關(guān)系密切，且與HIF-1α、VEGF具有一定相關(guān)性。本研究中DR組患者血清HIF-1α、VEGF表達(dá)水平均明顯高于單純糖尿病組患者，提示HIF-1α、VEGF可能在DR發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮重要作用。

miRNA在個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝、信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)過程起到重要調(diào)節(jié)作用，可作為糖尿病及糖尿病腎病、糖尿病冠心病、DR等糖尿病相關(guān)疾病的診斷標(biāo)志物和防治指標(biāo)[13]。miR-15a表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)視網(wǎng)膜血管新生和細(xì)胞炎癥反應(yīng)，miR-15a可通過調(diào)節(jié)血管生成及炎癥反應(yīng)進(jìn)而影響DR疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。miR-93在DR中的表達(dá)水平明顯高于2型糖尿病患者，miR-93影響DR的發(fā)展進(jìn)程，有望成為診斷DR的生物學(xué)指標(biāo)[15]。以上研究表明，miRNA表達(dá)失調(diào)可能與DR的發(fā)病進(jìn)程關(guān)系密切。miR-210在糖尿病冠心病患者血漿中的表達(dá)水平明顯高于單純糖尿病者，可作為糖尿病患者是否合并冠心病的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[16]。miR-210在糖尿病合并缺血性腦卒患者血漿中的表達(dá)失調(diào)，有望作為診斷糖尿病合并缺血性腦卒中有效指標(biāo)[17]。本研究中miR-210在DR患者血清中的表達(dá)水平明顯高于單純糖尿病患者，提示miR-210在DR的發(fā)展進(jìn)程中起到一定作用。

血清VEGF水平可作為糖尿患者患有微血管損傷類疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，ECs、EPCs與血管新生有關(guān)，且兩者可作為微血管內(nèi)皮功能指標(biāo)，VEGF、ECs在DR患者微血管損傷中呈高水平，EPCs呈低水平，VEGF表達(dá)水平與ECs、EPCs有關(guān)聯(lián)，VEGF在DR患者形成微血管損傷過程中和血管內(nèi)皮功能相關(guān)[18]。本研究中ECs在DR患者外周血中呈高水平，EPCs呈低水平，提示外周血ECs、EPCs比例失調(diào)可能影響DR發(fā)病進(jìn)展。

進(jìn)一步分析顯示，PDR組患者血清HIF-1α、miR-210、VEGF、外周血ECs水平均明顯高于NPDR組，EPCs含量明顯低于NPDR組，提示HIF-1α、miR-210、VEGF、外周血ECs水平隨DR發(fā)展過程呈上升趨勢(shì)，EPCs水平呈下降趨勢(shì)，HIF-1α、miR-210、VEGF、外周血ECs、EPCs水平可以評(píng)估DR病情程度。本研究中DR患者血清中HIF-1α、miR-210表達(dá)水平均與VEGF、ECs水平呈正相關(guān)，均與EPCs水平呈負(fù)相關(guān)，提示HIF-1α、miR-210可能均與VEGF、ECs、EPCs相互作用共同影響DR疾病發(fā)生發(fā)展過程。本研究顯示，收縮壓、尿微量白蛋白、糖尿病病程、HIF-1α、miR-210、VEGF是老年DR發(fā)生PDR的危險(xiǎn)因素，提示收縮壓、尿微量白蛋白、HIF-1α、miR-210、VEGF水平升高，糖尿病病程延長(zhǎng)均可增加PDR發(fā)病幾率，及時(shí)監(jiān)控收縮壓、尿微量白蛋白、HIF-1α、miR-210、VEGF水平，有利于及時(shí)診斷和防治GDM的病情進(jìn)展。

綜上所述，老年DR患者血清HIF-1α、miR-210呈高表達(dá)，可加重微血管損傷，兩者均可能參與DR的發(fā)生與發(fā)展。但本研究存有一些不足之處，即取樣量較少，可能會(huì)致使結(jié)果出現(xiàn)偏差，后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本取樣量進(jìn)行深入研究。