抑制素基因敲除小鼠模型的構(gòu)建及表型初步分析

洪勝輝，張旭亮，王芊芊，劉 平，劉迪文

(浙江大學(xué)實驗動物中心，杭州 310058)

抑制素（inhibin）是一種糖蛋白激素，屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族。抑制素由兩種亞基（α亞基和β 亞基）通過二硫鍵連接而成。其中β 亞基有兩種形式βA 和βB，因此根據(jù)不同連接方式，抑制素分為抑制素A（αβ A）和抑制素B（αβB）。另外，α 亞基的相對分子量為2×104，β 亞基的相對分子量為1.3×104，單獨的α 亞基和β 亞基均無生物活性，只有當(dāng)α 亞基和β 亞基互相結(jié)合時，才能形成相對分子量為3.2×104且具有生物活性的抑制素[1-2]。α 亞基具有糖基化位點，可以抑制卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）與其受體結(jié)合。β 亞基通過二硫鍵組成不同形式的激活素，分別為激活素A（β Aβ A）、激活素AB（βAβB）和激活素B（βBβB）3 種，激活素可刺激FSH 的產(chǎn)生和分泌[3-4]。

抑制素能夠特異性作用于垂體，抑制FSH的合成與分泌。抑制素還能夠通過調(diào)控激活素的釋放來調(diào)節(jié)機體的激素水平[5]。2015年，日本科學(xué)家Takeo 等[6]報道，使用抑制素抗血清聯(lián)合馬絨毛膜促性腺激素誘導(dǎo)C57BL/6J雌鼠超數(shù)排卵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)平均每只雌鼠排卵數(shù)量提高了2 倍以上，提示抑制素抗血清中和了小鼠分泌的內(nèi)源性抑制素后可大大提高雌鼠的排卵數(shù)量。那么完全敲除小鼠的抑制素基因是否也影響小鼠的排卵及生殖器官表型，值得進一步研究探討。

基因編輯技術(shù)是精準研究基因功能的一個重要手段，包括傳統(tǒng)的同源重組打靶方法、鋅指核酸內(nèi)切酶技術(shù)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)和成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9[clustered regularly interspaced short palindromic repeat（CRISPR）/CRISPR-associated protein 9（Cas9）]基因編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9 技術(shù)具有制作簡單、周期短、突變效率高以及成本低等特點，已經(jīng)被廣泛用于小鼠、大鼠、斑馬魚和水稻等物種的基因編輯[7]。通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合，形成雙鏈RNA；這一tracrRNA-crRNA 二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶標(biāo)的特定位點剪切雙鏈DNA，而且在與crRNA 引導(dǎo)序列互補的位點上，Cas9 蛋白的HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域剪切互補鏈，而Cas9 蛋白的RuvC 結(jié)構(gòu)域剪切非互補鏈，從而實現(xiàn)目的基因的敲除功能[8]。

本研究運用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，設(shè)計了針對抑制素α 亞基的單鏈向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA），成功誘導(dǎo)了抑制素α亞基的基因移碼突變，導(dǎo)致抑制素生物活性的缺失，從而成功制備了抑制素基因敲除小鼠模型，為進一步研究抑制素的生殖調(diào)控功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 SPF 級4～8 周齡C57BL/6J 小鼠和8～12周齡ICR小鼠均購自上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK（滬）2017-0005]，飼養(yǎng)在本實驗動物中心S P F 級屏障設(shè)施的獨立通風(fēng)籠具（individually wentilate cagesdul，IVC）環(huán)境中[SYXK（浙）2018-0016]，恒溫恒濕，12 h 光照，12 h 黑暗，自由采食。研究中涉及的動物實驗方案已通過浙江大學(xué)實驗動物倫理委員會審批（編號為17127）。

1.1.2 試劑 Tag 聚合酶及PCR 產(chǎn)物純化試劑盒均購自北京全式金生物科技有限公司。DNA提取試劑盒購自浙江易思德生物科技有限公司。限制性內(nèi)切酶購自NEB（北京）公司。Cas9 表達載體和pUC57-GDNA-T7 載體均由本中心張旭亮博士提供。RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒及純化試劑盒均購自美國Ambion 公司。小鼠胚胎體外操作液購自美國Sigma 公司。小鼠胚胎培養(yǎng)液KSOM 購自美國CQISSON公司。PCR引物合成及測序均由蘇州金維智生物科技有限公司完成。二甲苯、氨水和中性樹膠均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。蘇木精染液和伊紅染液均由武漢谷歌生物公司提供。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA 的設(shè)計及重組質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)GenBank 公布的小鼠抑制素α 亞基的基因序列，將待敲除的基因序列利用C R I S P R 設(shè)計工具（http://crispr.mit.edu/）進行分析。依據(jù)中靶Score 的高低及脫靶Score 的高低，設(shè)計一對長度為20 bp 的 sgRNA 靶向序列，并在該靶區(qū)域設(shè)計引物用于后續(xù)陽性小鼠的基因鑒定。抑制素基因鑒定的上游（F）引物序列為5'-GGGTGAGAAGGGTAGAAGAAGG-3'，下游（R）引物序列為5'-CCGCTTGAGAAGTAGAGGCTA-3'。sgRNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建步驟：將靶序列上下游引物稀釋，再進行引物退火及加磷酸，用Bsa Ⅰ酶切pUC57-GDNA-T7 質(zhì)粒線性化過夜，將加磷酸產(chǎn)物與線性化載體pUC57-GDNA-T7 進行連接，該連接反應(yīng)在干式恒溫器中進行。連接后的重組質(zhì)粒采用基因測序方法篩選陽性克?。麨閜UC-57 sgRNA），并用甘油菌－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 sgRNA和Cas9體外轉(zhuǎn)錄及純化 以上述構(gòu)建的pUC-57 sgRNA 和Cas9 表達載體為模板，用T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄sgRNA 和Cas9 的mRNA并純化。將得到的sgRNA 測定濃度，進行電泳鑒定后，分裝保存以備用。

1.2.3 Cas9/sgRNA的顯微注射及胚胎移植 將轉(zhuǎn)錄得到的sgRNA和Cas9 mRNA分別稀釋至質(zhì)量濃度為50 ng/μL，然后以體積比為1∶1 混合待用。用顯微操作儀將混合物注射到受精卵的細胞質(zhì)中。注射后的受精卵在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)30 min，然后移植到假孕的ICR 母鼠的輸卵管里。常規(guī)飼養(yǎng)母鼠，等待F0 代小鼠的出生。

1.2.4 F0代小鼠的鑒定及回交 在F0代小鼠出生7 d 后，采用剪腳趾法標(biāo)記小鼠，剪取鼠尾組織并用設(shè)計的靶區(qū)域引物（抑制素αF/抑制素αR）進行PCR 鑒定，選PCR 陽性樣品進行克隆測序。將測序正確的陽性F0代小鼠與野生型C57BL/6J小鼠進行交配，產(chǎn)生F1 代小鼠。

1.2.5 F2 代小鼠存活數(shù)統(tǒng)計、體質(zhì)量比較以及生殖器官大體觀察 采用PCR 方法鑒定F1 代小鼠，選F1 代雜合子小鼠自交產(chǎn)生F2 代小鼠。統(tǒng)計F2代小鼠中野生型、雜合子和基因敲除（純合子）3 種基因型的存活個體數(shù)量，并計算各基因型小鼠所占比例，判斷其是否符合孟德爾分離定律。選90日齡的F2 代小鼠，分別測量并記錄體質(zhì)量，比較3 種基因型小鼠的體質(zhì)量差異。觀察抑制素基因敲除純合子小鼠的睪丸及卵巢變化，比較純合子、雜合子、野生型雄鼠睪丸和雌鼠卵巢的大小。

1.2.6 抑制素基因敲除純合子小鼠生殖器官的HE染色 選F2代抑制素基因敲除純合子雄鼠睪丸和雌鼠卵巢組織，制作石蠟切片并進行HE 染色，觀察生殖器官的組織病理學(xué)變化。H E 染色方法：取新鮮組織，固定于4%多聚甲醛溶液中24 h以上，依次脫水、包埋、切片；用蘇木精染液染色細胞核，用伊紅染液染色細胞質(zhì)，脫水后用中性樹膠封固，觀察染色結(jié)果并拍照。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 運用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，并用GraphPad Prism5 軟件制圖。計量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA 靶向序列的設(shè)計

利用CRISPR 設(shè)計工具在抑制素基因外顯子（Exon）1 上設(shè)計了一對長度為20 bp 的sgRNA靶向序列（圖1），圖1 中紅色字體為sgRNA 靶序列，綠色字體為PAM（protospacer adjacent motif）序列。

圖1 抑制素基因敲除靶向sgRNA 的設(shè)計Figure 1 Design of target single guide RNA (sgRNA) for mouse inhibin gene knockout

2.2 F0 代小鼠的獲得、鑒定及回交結(jié)果

將sgRNA 和Cas9 mRNA 顯微注射入受精卵后，一共存活75 枚胚胎，全部存活胚胎移植了3 只假孕的ICR 受體母鼠。胚胎移植20 d 后，一共出生了12 只F0 代小鼠，其中有8 雄4 雌（雄鼠編號為1～8，雌鼠編號為9～12）。提取小鼠基因組DNA，PCR 后進行瓊脂糖凝膠電泳（圖2）。由圖2 可見，編號為1、3、6、7、8、9、10、12 的小鼠電泳條帶有2 條或者3 條，說明這些小鼠的基因組可能發(fā)生了序列刪除或堿基插入；而編號為2、4、5、11 的小鼠疑似發(fā)生堿基突變。將這12只小鼠的抑制素基因的PCR擴增產(chǎn)物進行TA 克隆測序，結(jié)果顯示，編號為1、7、8、9、10 的5 只小鼠發(fā)生了序列缺失或堿基插入，編號為3 和6 的小鼠PCR 擴增產(chǎn)物TA克隆測序結(jié)果不理想，其余編號小鼠未發(fā)生突變；其中，發(fā)生移碼突變的小鼠有7 號（缺失128 bp）、8 號（缺失143 bp，同時插入3 bp）和10 號（缺失122 bp）（表1）。將編號為7、8、10 的3 只小鼠與C57BL/6J 小鼠回交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：7號小鼠交配后未正常生育；8 號小鼠交配后其后代缺失片段較大；10 號小鼠是雌鼠，產(chǎn)仔繁殖速度較慢。因此，后續(xù)選擇了8 號小鼠交配籠繼續(xù)繁育。

2.3 F2代小鼠中各基因型比例統(tǒng)計及體質(zhì)量差異

8 號F0代雄鼠與C57BL/6雌鼠回交，得到F1代雜合子小鼠，然后F1代雜合子小鼠自交后產(chǎn)生F2 代小鼠，抑制素基因鑒定結(jié)果見圖3A。統(tǒng)計173 只F2 代野生型、雜合子和基因敲除純合子3種基因型小鼠的存活個體數(shù)量，分別為45、93和35 只，占全部F2 代小鼠的26.0%、53.7%和20.2%，約為1∶2∶1，符合孟德爾分離定律，說明抑制素基因敲除小鼠不存在胚胎致死表型。F2 代野生型、雜合子和基因敲除純合子3 種基因型小鼠于90 日齡的平均體質(zhì)量比較見圖3B，與野生型小鼠相比，雜合子小鼠體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05），而抑制素基因敲除純合子小鼠的體質(zhì)量明顯減輕（P＜0.05）。

2.4 抑制素基因敲除小鼠的生殖器官大體觀察

將F2 代抑制素基因敲除雄鼠與雌鼠交配，結(jié)果不育。將抑制素α基因敲除雌鼠與C57BL/6J雄鼠交配，仍然不育。觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2 代及后續(xù)子代中抑制素α 基因敲除雄鼠分籠飼養(yǎng)后，肉眼可見睪丸會逐漸增大。將抑制素基因敲除雄鼠和雌鼠解剖后觀察其生殖系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)雄鼠的生殖系統(tǒng)發(fā)育異常，睪丸變大，顏色發(fā)黑，內(nèi)有血液，附睪萎縮或被吸收入睪丸組織（圖4A）；雌鼠的生殖系統(tǒng)同樣發(fā)育異常，卵巢變大，顏色發(fā)黑，輸卵管已萎縮或被吸收入卵巢組織，子宮粗大，內(nèi)部充滿液體（圖4 B）。

圖2 12只F0 代小鼠抑制素基因的PCR 后電泳結(jié)果Figure 2 Electrophoretic results of inhibin gene in F0 mice after PCR

表1 F0 代小鼠抑制素基因的TA 克隆測序結(jié)果Table 1 TA cloning and gene sequencing results of inhibin gene in F0 mice

2.5 抑制素基因敲除小鼠生殖器官組織病理學(xué)觀察

野生型雄鼠的睪丸組織結(jié)構(gòu)正常，有很多形狀規(guī)則的曲細精管，排列緊密，而且管內(nèi)生精細胞排列緊密，數(shù)量豐富，形態(tài)正常，并可見長梭形精子（圖5A）。而抑制素基因敲除雄鼠的睪丸大面積曲細精管形狀不規(guī)則或被腫瘤組織取代，腫瘤組織呈彌漫性或結(jié)節(jié)狀分布，沒有邊界；腫瘤細胞為多形細胞，有豐富的嗜酸性或空泡狀細胞質(zhì)（黑色箭頭），少見核分裂現(xiàn)象（紅色箭頭）；腫瘤結(jié)節(jié)內(nèi)可見大量囊腔，伴出血，內(nèi)充滿紅細胞（黃色箭頭）；睪丸組織中局部曲細精管結(jié)構(gòu)尚未完全消失，但管內(nèi)正常生精細胞消失，小管邊緣為腫瘤細胞（綠色箭頭）（圖5 B 和5C）。

觀察卵巢組織HE 染色切片可見，野生型雌鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)正常，有較多卵泡及黃體結(jié)構(gòu)，卵泡內(nèi)的卵母細胞形態(tài)正常，顆粒細胞排列緊密且形態(tài)正常，組織未見異常（圖5D）。而抑制素基因敲除雌鼠卵巢內(nèi)正常結(jié)構(gòu)消失，卵泡異?；蛳?，被腫瘤組織取代；腫瘤由混合性囊性和實性的小葉狀或結(jié)節(jié)性區(qū)域組成，腫瘤細胞為多形細胞，細胞嗜酸性（黑色箭頭）；部分濾泡內(nèi)還伴有出血，可見紅細胞（紅色箭頭）；少量腫瘤細胞凋亡，細胞核碎裂，細胞質(zhì)嗜酸性增強（黃色箭頭）（圖5E 和5F）。

圖3 F2 代小鼠的抑制素α 基因PCR 鑒定（A）和體質(zhì)量比較（B）Figure 3 Electrophoretic results of PCR products of inhibin α gene (A) and body weight of F2 mice (B)

圖4 抑制素基因敲除小鼠的生殖器官觀察Figure 4 Reproductive organs of inhibin gene knockout mice (A, male mouse testis; B, female mouse ovary)

圖5 抑制素基因敲除小鼠生殖器官的組織切片病理學(xué)觀察（HE 染色，×200）Figure 5 Pathological observation on the tissue sections of reproductive organs in inhibin gene knockout mice(HE staining, ×200)

3 討論

與傳統(tǒng)基因同源重組靶技術(shù)相比，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)簡單，成本低，速度快，制作全身基因敲除的小鼠只需要設(shè)計1 對目的基因的靶向sgRNA 序列，然后通過合成、體外轉(zhuǎn)錄、受精卵注射和胚胎移植就可以得到F0代小鼠，順利的情況下1個月即可獲得F0 代小鼠[9]。本課題將sgRNA 和Cas9 mRNA 混合物注入后存活的75枚受精卵移植到3 只受體母鼠中，結(jié)果3 只受體小鼠均妊娠，出生12 只F0 代小鼠。PCR 顯示其中8 只小鼠發(fā)生了抑制素α 基因堿基突變。通過TA克隆測序分析發(fā)現(xiàn)，有5 只小鼠的抑制素α基因發(fā)生了片段缺失或堿基插入，其中8 號雄鼠交配的雌鼠最先正常產(chǎn)仔且基因缺失片段較大。因此，選擇8 號雄鼠繼續(xù)繁育，得到F1 代雜合子小鼠并建系成功。因為α 亞基是抑制素A 和抑制素B 的共有核心部分，所以當(dāng)α亞基基因缺失后，抑制素A 和抑制素B 均會失去生物活性，從而提示本研究成功獲得抑制素基因敲除小鼠模型。

抑制素主要由雌性動物的卵巢和雄性動物的睪丸分泌。國內(nèi)外大量研究主要集中在抑制素對雌性動物生殖調(diào)控的作用機制和應(yīng)用方面[10-11]。由卵巢分泌的抑制素又稱為卵泡抑制素。抑制素能夠特異性作用于垂體，通過負反饋機制阻止促性腺激素釋放激素對垂體的作用，從而抑制FSH的合成與分泌。抑制素還可以通過抑制激活素來調(diào)節(jié)FSH 的分泌。激活素是通過結(jié)合跨膜的絲氨酸-蘇氨酸激酶受體完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[12]。張德坤等[13]研究抑制素基因免疫調(diào)控家畜內(nèi)源性抑制素的分泌，提高雌性家畜動物體內(nèi)FSH 的合成與分泌，從而提高雌性動物窩產(chǎn)仔數(shù)。Cho 等[14]研究抑制素α 亞基轉(zhuǎn)基因大鼠時發(fā)現(xiàn)，雌性大鼠卵巢中抑制素βA和βB水平下降時，F(xiàn)SH水平下降，LH水平升高，52%的雌性大鼠窩產(chǎn)仔數(shù)減少，雄性大鼠窩產(chǎn)仔數(shù)沒有明顯變化，但是精子數(shù)量減少50%。Matzuk 等[15]研究抑制素缺失小鼠時發(fā)現(xiàn)，雄鼠和雌鼠生殖器官由于發(fā)生癌變導(dǎo)致不育，生殖腺的惡性腫瘤會導(dǎo)致小鼠肝臟和胃等器官組織發(fā)生惡性病變以及貧血，癌變的原因是小鼠抑制素缺失導(dǎo)致激活素A 和B 水平升高。Rukmali等[16]研究抑制素α亞基缺失小鼠模型時同樣發(fā)現(xiàn)雄鼠睪丸增大且形成腫瘤組織，檢測發(fā)現(xiàn)激活素水平顯著升高。

筆者受上述研究結(jié)果的啟發(fā)，制作了抑制素基因敲除小鼠模型，然后觀察發(fā)現(xiàn)獲得的抑制素基因敲除雌鼠發(fā)生了卵巢癌變、輸卵管萎縮和子宮腔積液等病變，而抑制素基因敲除雄鼠發(fā)生了睪丸癌變，這些癥狀與前人研究結(jié)果基本一致。Takeo等[6]使用抑制素抗血清中和雌鼠分泌的內(nèi)源性抑制素后，超數(shù)排卵數(shù)量翻倍；而筆者制作的抑制素缺失小鼠模型的生殖系統(tǒng)癌變后無法排卵。究其原因，可能是：短時地抑制或中和抑制素可促進FSH 的合成和分泌，提高激活素A和B 的分泌水平，不會使小鼠發(fā)生病變，同時能夠提高小鼠的排卵；而徹底的抑制素基因敲除會使小鼠完全缺乏抑制素的調(diào)控，小鼠體內(nèi)FSH 和激活素的合成和分泌都會失去控制，從而導(dǎo)致生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生紊亂，進而使生殖系統(tǒng)發(fā)生病變。抑制素和激活素處在什么水平或者達到怎樣的平衡狀態(tài)可以使動物的生殖力達到最佳，這還需要進一步的研究。

本研究尚有不足之處，即未能在蛋白質(zhì)水平進一步驗證小鼠目的基因的敲除，這是因為抑制素是一種內(nèi)分泌激素蛋白，其表達受小鼠內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控，處在一個動態(tài)變化當(dāng)中，蛋白質(zhì)免疫印跡法難以捕捉到正常小鼠（對照組）體內(nèi)抑制素的表達。激素蛋白的檢測可能需要靈敏度更高的技術(shù)手段，本課題組將在后續(xù)的研究中進一步探索。