白背天葵多酚的提取及其抗氧化活性

馬景蕃 林哲民 柳盈 劉喜明 陳雪梅

摘 ?要：本文研究了白背天葵多酚的超臨界CO₂提取工藝及其體內(nèi)外抗氧化活性，為白背天葵的開發(fā)利用提供依據(jù)。以萃取壓力、萃取時(shí)間、萃取溫度、CO₂流量和夾帶劑濃度為單因素，以多酚提取得率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。采用體外抗氧化活性試驗(yàn)分析提取物對DPPH及ABTS自由基的清除能力。體內(nèi)抗氧化活性試驗(yàn)以D-半乳糖致衰小鼠為模型，白背天葵多酚提取物150、300、600 mg/kg連續(xù)灌胃30 d，測定其血清及肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量。結(jié)果表明，白背天葵多酚的超臨界CO₂最優(yōu)提取工藝為萃取壓力35?MPa、萃取時(shí)間2 h、萃取溫度40?℃、CO₂流量20 L/h，多酚提取得率為5.32%。體外抗氧化試驗(yàn)表明，多酚對DPPH及ABTS自由基的清除率隨其濃度的提高而提高。與空白組比較，衰老模型組血清及肝組織中的SOD、GSH-Px、CAT活性顯著性降低，MDA含量顯著性升高，白背天葵多酚提取物能顯著提高衰老模型組血清及肝組織中的SOD、GSH-Px、CAT活性，并降低MDA含量。

關(guān)鍵詞：白背天葵;超臨界CO₂;自由基清除;抗氧化物酶;丙二醛（MDA）中圖分類號(hào)：S647;?R284.2??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Extraction and Antioxidant Activity of?Polyphenols from Gynura formosana Kitam

MA Jingfan^1，2， LIN Zhemin¹， LIU Ying¹，?LIU Ximing³， CHEN Xuemei^1，2

1. College of Life Sciences， Longyan University， Longyan， Fujian?364012， China; 2. Fujian?Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology （Longyan University）， Longyan， Fujian?364012， China;?3. College of Communication?and Design， Longyan University， Longyan， Fujian?364012， China

Abstract： The extracting technique of polyphenols fromGynura formosanaKitam by supercritical CO₂was optimized and the antioxidant activityin vitroandinvivowas studied to provide a theoretical basis for the development and comprehensive utilization ofG.?formosanaKitam. Extraction pressure， extraction time， extraction temperature， CO₂ flow rate， and the consolvent concentration as single factors， the response surface method was used to optimize the extract conditions based on extraction yield. The antioxidant activity?in vitrowas established by DPPH and ABTS?radicals scavenging rate. The antioxidant activityin vivowas evaluated using the D-galactose aging mice model. Three different doses （150， 300， 600 mg/kg every day） of polyphenols fromG.?formosanaKitam were?given for 30 days. ?superoxide dismutase （SOD），?glutathione peroxidase （GSH-Px）， catalase （CAT）?activities?and malondialdehyde （MDA）?content were determined in mice serum and liver.?The best conditions for extracting polyphenols fromG.?formosanaKitam were extraction pressure 35?MPa， extraction time 2 h， extraction temperature 40?℃?and CO₂flow rate 20 L/h. The yield under the optimal conditions was 5.32%?DPPH and ABTS radicals scavenging rate?were improved with the increasing concentration of extraction.?Compared to the control group， SOD， GSH-Px and CAT activities were decreased significantly and MDA content was increased significantly in mice serum and liver in the aging model group. Compared to the aging model group， SOD， GSH-Px and CAT activities were increased significantly and MDA content was decreased significantly in mice serum and liver in extract treatment group.

Keywords： Gynura formosanaKitam; supercritical CO₂; radicals scavenging; antioxidant enzymes; malondialdehyde?（MDA）

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.023

白背天葵（Gynura formosanaKitam）為菊科三七草屬植物，又名白鳳菜、白背三七，福建漳州地區(qū)稱其為“片仔癀草”，在福建、廣東、海南等地多有分布。白背天葵營養(yǎng)豐富，味道鮮美，是一種保健藥膳和珍稀蔬菜，有“最佳保健藥膳蔬菜”之稱^[1]，且全草可入藥。近年來，很多學(xué)者對白背天葵中的活性成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)白背天葵多酚類化合物為其提取物中重要的有效成分之一，它具有廣泛的生物活性，如具有抗炎^[2]、抗氧化、抗癌、防治心腦血管疾病等作用^[3]。

傳統(tǒng)的植物多酚多采用有機(jī)溶劑等進(jìn)行提取^[4]，容易導(dǎo)致有機(jī)溶劑的殘留。作為一種新型提取分離技術(shù)，超臨界CO₂萃取技術(shù)具有無溶劑殘留、萃取能力強(qiáng)、萃取溫度低、效率高等特點(diǎn)，正逐漸被應(yīng)用到植物多酚的提取中^[4]。響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）作為一種有效的加工工藝優(yōu)化方法，目前已被廣泛應(yīng)用于提取工藝方面，其具有試驗(yàn)周期短，求得的回歸方程精度高等優(yōu)點(diǎn)^[5]。本文通過超臨界CO₂萃取技術(shù)對白背天葵的多酚進(jìn)行提取，并應(yīng)用響應(yīng)面分析法對工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)通過體內(nèi)外試驗(yàn)考察了白背天葵多酚對自由基的清除作用及在小鼠體內(nèi)的抗氧化作用，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用白背天葵多酚化合物提供科學(xué)依據(jù)。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1 ?材料與試劑??白背天葵，種植于龍巖學(xué)院植物房內(nèi)，取其莖葉部分于60?℃烘干后，粉碎、過60目篩，備用。

50只雄性昆明小鼠，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005，體質(zhì)量28～30?g，飼養(yǎng)溫度（22±1）℃，光周期12?L∶12D，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水^[6]。

沒食子酸（149-91-7），阿拉丁試劑公司;D-半乳糖（D-gal），美國Sigma公司;Vc對照品（A-4544），美國Fluka公司;超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、總蛋白定量試劑盒，南京建成生物科技有限公司。

1.1.2??儀器與設(shè)備 ?UV-1800紫外-可見分光光度計(jì)，日本SHIMADZU公司;Bio-TekELX800酶標(biāo)儀，美國寶特公司;HA121-50-01型超臨界CO₂萃取儀，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司。

1.2方法

1.2.1 ?白背天葵多酚的測定??參照文獻(xiàn)[7-9]的方法測定多酚含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，依下述公式計(jì)算多酚的提取得率：

式中，C為標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)多酚的質(zhì)量濃度（mg/mL）;V為樣液的體積（mL）;a為稀釋倍數(shù);W為白背天葵的質(zhì)量（g）。

1.2.2 ?單因素試驗(yàn) ?分別對超臨界萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間、CO₂流量和夾帶劑濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以白背天葵多酚的提取得率為指標(biāo)，確定各因素的最佳選擇范圍。

1.2.3 ?超臨界CO₂萃取工藝優(yōu)化??在單因素的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，選擇萃取壓力（X₁）、萃取時(shí)間（X₂）、萃取溫度（X₃）、CO₂流量（X₄）4因素作為自變量，以白背天葵多酚的提取得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.2.4 ?體外抗氧化指標(biāo)測定 ?參照文獻(xiàn)[10]的方法測定白背天葵多酚清除DPPH及ABTS自由基的活性，以抗壞血酸為對照。

1.2.5 ?體內(nèi)抗氧化指標(biāo)測定??試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，即空白組、衰老模型組、多酚提取物低、中、高劑量組（每日給藥劑量分別為150、300、600?mg/kg的多酚提取物），空白組與模型組灌胃等量生理鹽水;衰老組與提取物各組每日皮下注射0.2?mg/g的D-半乳糖（10?μL/g），空白組則每日皮下注射等量的生理鹽水。連續(xù)給藥30?d，于試驗(yàn)給藥末次，禁食15?h，摘眼球采血，后處死小鼠取出肝臟勻漿。按各試劑盒說明書操作，測血清及肝組織中的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量。

1.3數(shù)據(jù)處理

每項(xiàng)試驗(yàn)至少重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 8.0軟件完成繪圖。

2??結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1 ?萃取壓力的選擇??在萃取溫度為40?℃、萃取時(shí)間為1.5?h、CO₂流量為15 L/h和夾帶劑濃度為90%乙醇的條件下，以白背天葵多酚提取得率為指標(biāo)，考察當(dāng)萃取壓力為20、25、30、35、40、45?MPa時(shí)對白背天葵多酚提取得率的影響。由圖1可知，當(dāng)萃取壓力在20～35?MPa之間時(shí)，多酚提取得率隨著壓力的升高而升高;萃取壓力超過35?MPa后，提取得率稍有下降。其原因可能是壓力增大，使得超臨界CO₂流體的密度增加，從而增加了溶質(zhì)與溶劑之間的傳質(zhì)效率，使得超臨界CO₂流體的溶解能力增強(qiáng)，萃取更充分。但當(dāng)繼續(xù)增大壓力，超臨界CO₂流體的黏度增加，減小了溶質(zhì)與溶劑之間的傳質(zhì)效率，多酚溶出困難，提取得率下降。此外壓力增大也不利于安全^[11]，因此選擇萃取壓力范圍為30～40?MPa。

2.1.2 ?萃取時(shí)間的選擇??在萃取溫度為40?℃、萃取壓力為30?MPa、CO₂流量為15 L/h和夾帶劑濃度為90%乙醇的條件下，以白背天葵多酚提取得率為指標(biāo)，考察當(dāng)萃取時(shí)間為1、1.5、2、2.5、3、3.5?h時(shí)對白背天葵多酚提取得率的影響。由圖2可知，隨著萃取時(shí)間的延長，多酚提取得率增加，但當(dāng)大于2?h后，提取得率增加緩慢。其原因?yàn)殡S著時(shí)間的延長，超臨界CO₂流體與溶質(zhì)接觸越來越充分，提取得率增加，但當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，多酚在超臨界CO₂流體中溶出達(dá)到平衡，提取得率增加緩慢，且會(huì)增加生產(chǎn)成本^[12]。因此選擇萃取時(shí)間范圍為1.5～2.5 h。

2.1.3 ?萃取溫度的選擇??在萃取時(shí)間為1.5 h、萃取壓力為30 MPa、CO₂流量為15 L/h和夾帶劑濃度為90%乙醇的條件下，以白背天葵多酚提取得率為指標(biāo)，考察當(dāng)萃取溫度為 30、35、40、45、50、55?℃時(shí)對白背天葵多酚提取得率的影響。由圖3可知，隨著溫度的升高，多酚提取得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。其原因?yàn)闇囟壬咴黾恿巳苜|(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)，使得溶質(zhì)更易溶出，提取得率升高，但溫度升高又降低了超臨界CO₂流體的密度，導(dǎo)致其溶解能力降低，提取得率下降^[13]。因此選擇萃取溫度范圍為35～45?℃。

2.1.4??CO₂流量的選擇??在萃取溫度為40?℃、萃取時(shí)間為1.5?h、萃取壓力為30?MPa和夾帶劑濃度為90%乙醇的條件下，以白背天葵多酚提取得率為指標(biāo)，考察當(dāng)CO₂流量為5、10、15、20、25、30?L/h時(shí)，對白背天葵多酚提取得率的影響。由圖4可知，隨著CO₂流量的增加，多酚提取得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。其原因?yàn)樵黾恿薈O₂流量，即增加了溶劑與溶質(zhì)的接觸面積，從而促進(jìn)了超臨界CO₂流體的溶解能力，提高了提取得率，但繼續(xù)增大流量使得流體與溶質(zhì)接觸不充分，提取得率下降，同時(shí)增加了生產(chǎn)成本^[14]。因此選擇CO₂流量范圍為15～25 L/h。

2.1.5 ?夾帶劑濃度的選擇??在萃取溫度為40?℃、萃取時(shí)間為1.5?h、萃取壓力為30?MPa和CO₂流量為15?L/h的條件下，以白背天葵多酚提取得率為指標(biāo)，考察當(dāng)夾帶劑濃度為75%、80%、85%、90%、95%、100%時(shí)，對白背天葵多酚提取得率的影響。由圖5可知，隨著夾帶劑濃度的增加，多酚提取得率逐漸增加，當(dāng)濃度達(dá)到100%（無水乙醇）時(shí)，提取得率達(dá)到最大值。其原因可能為

夾帶劑含水量越大，溶質(zhì)越易吸水膨脹，從而影響超臨界CO₂流體對溶質(zhì)的滲入，影響提取得率^[15]。因此選擇無水乙醇作為夾帶劑。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 ?試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果??進(jìn)行4因素3水平的Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察萃取壓力（X₁）、萃取時(shí)間（X₂）、萃取溫度（X₃）和CO₂流量（X₄）對白背天葵多酚提取得率（Y）的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

對表1數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到的回歸方程為

Y=5.31+0.052?X₁+0.12X₂+0.023X₃+0.082X₄-?0.041?X₁X₂-0.048X₁X₃-0.015X₁X₄+0.0073X₂X₃+?0.070X₂X₄+0.089X₃X₄-0.38X₁²-0.39X₂²-?0.24X₃²-?0.54X₄²

對回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析，結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，該模型極顯著（P<0.01），相關(guān)系數(shù)R²=0.9983，校正決定系數(shù)R_adj=0.9965，失擬

項(xiàng)不顯著（P=0.1646>0.05）。說明該回歸方程擬合度較好，模型試驗(yàn)誤差小，因此，可以用該方程對白背天葵多酚提取得率進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測和分析。模型的X₁、X₂、X₄、X₂X₄、X₃X₄、X₁²、X₂²、X₃²、X₄²為極顯著（P<0.01），X_3、X₁X₂、X₁X₃為顯著（P< 0.05）。通過F值可知，各單因素對白背天葵多酚提取得率影響的大小依次為X₂>X₄>X₁>X₃;交互項(xiàng)對提取得率影響的大小依次為X₃X₄>X₂X₄>X₁X₃>X₁X₂>X₁X₄>X₂X₃。

注：*表示差異顯著（P<0.05）;**表示差異極顯著（P<0.01）。

Note： *?means significant difference?（P<0.05）; **?means extremely significant difference?（P<0.01）.

2.2.2 ?響應(yīng)面分析??由圖6可知，萃取溫度和CO₂流量、萃取時(shí)間和CO₂流量交互作用最為顯著，萃取壓力和萃取溫度、萃取壓力和萃取時(shí)間次之，萃取壓力和CO₂流量、萃取時(shí)間和萃取溫度不顯著，這與模型中F值分析結(jié)果相一致。

2.2.3 ?驗(yàn)證試驗(yàn) ?通過響應(yīng)面回歸方程，得到白背天葵多酚提取的最佳條件為萃取壓力35.25?MPa、萃取時(shí)間2.10?h、萃取溫度40.27?℃、CO₂流量20.29?L/h，在此條件下模型預(yù)測白背天葵多酚提取得率為5.3238%。為方便實(shí)際操作，修正后的條件為萃取壓力35?MPa、萃取時(shí)間2?h、萃取溫度40?℃、CO₂流量20?L/h，此條件下多酚提取得率為5.32%，與理論值接近，RSD為0.45%。證明該回歸模型是可靠的。

2.3白背天葵多酚的抗氧化活性

2.3.1 ?白背天葵多酚對DPPH自由基的清除作用??如圖7所示，維生素C和白背天葵多酚對DPPH 自由基的清除均呈現(xiàn)劑量依賴性，其清除率隨著

濃度的增加而增加，當(dāng)白背天葵多酚的濃度達(dá)到200?μg/mL時(shí)，對DPPH自由基的清除率達(dá)到最大，為72.17%。

2.3.2??白背天葵多酚對ABTS自由基的清除作用??白背天葵多酚對ABTS自由基的清除效果見圖8，與清除DPPH自由基相似，其清除ABTS自由基的作用也隨著濃度的增加而增加，當(dāng)白背天葵多酚的濃度達(dá)到200?μg/mL時(shí)，對ABTS自由基的清除率達(dá)到最大，為80.64%。

2.3.3 ?白背天葵多酚的體內(nèi)抗氧化結(jié)果??如表3及表4所示，模型組小鼠血清的SOD、CAT活性及小鼠肝組織中SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量與空白組相比具有極顯著性差異，模型組小

鼠血清的GSH-Px活性及MDA含量與空白組相比具有顯著性差異，說明小鼠造模成功^[16]。當(dāng)灌胃低劑量（150?mg/kg）的白背天葵多酚時(shí)，小鼠血清的SOD活性與模型組相比具有極顯著性差異，GSH-Px活性及MDA含量與模型組相比具有顯著性差異，但CAT活性無顯著性差異;當(dāng)灌胃高劑量（600?mg/kg）的白背天葵多酚時(shí)，小鼠血清的SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量與模型組相比均具有極顯著性差異（表3）;同樣，當(dāng)灌胃高劑量的白背天葵多酚時(shí)，小鼠肝組織的SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量與模型組相比也具有極顯著性差異（表4）。表明白背天葵多酚提取物具有顯著提高體內(nèi)抗氧化酶活性的作用^[17]。

注：^*表示與空白組比較差異顯著（P<0.05）;^**表示與空白組比較差異極顯著（P<0.01）;^#表示與模型組比較差異顯著（P<0.05）;^##表示與模型組比較差異極顯著（P<0.01）

Note：^*means?significant difference?（P<0.05）?vs control;^**means extremely significant difference?（P<0.01）?vs control;^#means?significant difference?（P<0.05）?vs model;^##means extremely significant difference?（P<0.01）?vs model.

注：^*表示與空白組比較差異顯著（P<0.05）;^**表示與空白組比較差異極顯著（P<0.01）;^#表示與模型組比較差異顯著（P<0.05）;^##表示與模型組比較差異極顯著（P<0.01）

Note：^*means?significant difference?（P<0.05）?vs control;^**means extremely significant difference?（P<0.01）?vs control.^#means?significant difference?（P<0.05?vs model）;^##means extremely significant difference?（P<0.01）?vs model.

3??討論

本研究采用超臨界CO₂萃取技術(shù)，通過響應(yīng)面法進(jìn)行白背天葵多酚的提取工藝優(yōu)化，并確定了最佳提取工藝，為進(jìn)一步綜合開發(fā)利用白背天葵奠定了基礎(chǔ)。王萍等^[18]采用有機(jī)溶劑法對陜產(chǎn)枇杷核多酚進(jìn)行提取，其平均提取得率為1.527%;高林曉等^[19]采用超聲波法對刺三加根多酚進(jìn)行提取，其提取得率為1.34%。本研究采

用超臨界CO₂法提取的多酚提取得率為5.32%，顯著高于有機(jī)溶劑法和超聲波法，可能原因?yàn)镃O₂流體的擴(kuò)散系數(shù)介于液體和氣體之間，所以使得溶質(zhì)與溶劑之間有較好的傳質(zhì)效率，提取得更加充分。另外，使用超臨界CO₂提取，既能保證提取過程中多酚的活性不受影響，還易于除去過多的提取溶劑，不會(huì)對多酚提取物產(chǎn)生溶劑污染，最大程度地保存了多酚的生物活性，為評價(jià)其活性奠定了良好的基礎(chǔ)。

過量的自由基易對核酸、蛋白質(zhì)等機(jī)體內(nèi)重要分子造成損傷。很多研究表明植物多酚作為一種天然抗氧化劑，能夠清除自由基，減少其對人體的傷害。鄧俊琳等^[20]研究發(fā)現(xiàn)，余甘子多酚對ABTS自由基、DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除作用。魏園園等^[21]通過體外試驗(yàn)證實(shí)，橡子果仁純多酚清除DPPH自由基、ABTS自由基的能力與Vc相當(dāng)。本研究結(jié)果表明白背天葵多酚對DPPH自由基、ABTS自由基均具有較好的清除效果，且呈劑量依賴效應(yīng)。

MDA的含量常用來表示細(xì)胞的受損程度及機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平，其可與脂質(zhì)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，損傷細(xì)胞DNA的結(jié)構(gòu)。楊寬等^[22]研究表明，茶多酚能降低高脂血癥大鼠肝組織中的MDA含量，減少脂質(zhì)過氧化對肝臟的損害。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白背天葵多酚能夠顯著減少大鼠血清與肝組織中MDA的生成量，顯著降低脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生。

機(jī)體主要通過SOD、GSH-Px及CAT等抗氧化酶來抵抗過量自由基對其造成的傷害，其中SOD可清除機(jī)體內(nèi)的超氧陰離子自由基;GSH-Px可使還原型谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽，使有毒的自由基轉(zhuǎn)化為無毒的羥基;CAT能夠分解H₂O₂，從而可有效地保護(hù)機(jī)體發(fā)生過氧化反應(yīng)。王飛霞等^[23]研究表明，豆芽多酚可提高果蠅體內(nèi)SOD及GSH-Px活力。本研究中體內(nèi)抗氧化結(jié)果表明，白背天葵多酚能增加小鼠血清和肝臟組織的SOD、GSH-Px、CAT活性。

綜上所述，白背天葵多酚可提高機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶活性，清除自由基，最終增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化功能^[24]。白背天葵多酚是天然植物提取物，因此將其開發(fā)成天然的自由基清除劑或抗氧化劑對于保護(hù)機(jī)體健康、預(yù)防疾病均具有重要意義。今后我們將對白背天葵多酚的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)組成和活性機(jī)理進(jìn)行深入研究。

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