櫻桃谷肉鴨傳染性漿膜炎的診治

李晨 孫培明 莫玲 李玲 徐文豪 李峰

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.32? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C? ? ?文章編號(hào)：1673-1085（2020）7-0047-03

櫻桃谷肉鴨具有生長(zhǎng)快、飼料轉(zhuǎn)化利用率高等優(yōu)點(diǎn)，是我國(guó)目前規(guī)?；B(yǎng)殖的主要肉鴨品種，但在飼養(yǎng)中疫病問(wèn)題一直存在。其中鴨傳染性漿膜炎是櫻桃谷肉鴨規(guī)模養(yǎng)殖常見(jiàn)主要疫病之一[1]。該病的發(fā)生可貫穿商品肉鴨整個(gè)生長(zhǎng)周期，特別是2～3周齡雛鴨易發(fā)，發(fā)病率在5%～90%，病死率高達(dá)80%或以上[2，3]。2020年3月份，濱州某櫻桃谷肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生疑似鴨傳染性漿膜炎，現(xiàn)就其診斷與防治情況總結(jié)如下，以期為該病綜合防控提供借鑒與參考。

1? 材料與方法

1.1? 病料來(lái)源及記錄發(fā)病情況? 濱州某養(yǎng)殖場(chǎng)送檢病死鴨，記錄其臨床發(fā)病癥狀，剖檢觀察其病理變化。

1.2? 試劑材料? 胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB），購(gòu)自Dfico公司;麥康凱瓊脂，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;微量生化發(fā)酵管、藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司;SPAReasy細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒、2×Spark Taq PCR Master Mix（Spark Taq DNA 聚合酶、DNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液）、DL2000 DNA Marker等，購(gòu)自山東思科捷科學(xué)儀器有限公司;革蘭氏染液、瑞士染液、超純水等，由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院制備;鴨疫里默菌（RA）參考菌株JX-1，由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院分離鑒定并保存。

1.3? 細(xì)菌分離與培養(yǎng)? 無(wú)菌條件下，采集病死鴨肝臟、脾臟、腦組織，劃線接種含有50mL/L的TSA，置于燭缸中，37℃溫箱培養(yǎng)24～48h;同時(shí)，劃線接種麥康凱平板，37℃溫箱培養(yǎng)18～24h。觀察菌落長(zhǎng)出情況。

1.4? 分離菌生化試驗(yàn)? 挑取分離菌純培養(yǎng)物，無(wú)菌接種于微量生化發(fā)酵管，37℃溫箱培養(yǎng)48h，觀察并記錄結(jié)果。

1.5? PCR診斷

1.5.1? 引物設(shè)計(jì)? 參照文獻(xiàn)[4]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成一對(duì)特異性引物RA-F和RA-R。

RA-F：5'-GACTATACAGGTCTTACGTTCCCT

GT-3';

RA-R： 5'-TAACTGAGATGGGTTAACACCTCTA

GC-3'。

1.5.2? 模板DNA制備? 挑取TSA單個(gè)菌落，通過(guò)振蕩培養(yǎng)30min，按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取制備DNA模板。取RA JX-1株純培養(yǎng)單個(gè)菌落，同樣方法提取制備DNA模板，作為對(duì)照。同時(shí)取ddH2O作為空白對(duì)照。

1.5.3? PCR反應(yīng)體系? 反應(yīng)體系為25μL：12.5μL 2×Spark Taq PCR Master Mix，上下游引物各0.25μL，5μL模板，7μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6? 藥敏試驗(yàn)? 采用紙片法進(jìn)行，按照《抗生素藥物藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)》判定記錄結(jié)果。

2? 結(jié)果

2.1? 臨床特征與病理剖檢? 該場(chǎng)本批次飼養(yǎng)有10000只商品肉鴨，送檢時(shí)約為16日齡，已發(fā)病4d左右。主訴表現(xiàn)為發(fā)病鴨精神沉郁，縮頸呆立，步態(tài)不穩(wěn)，跛行或頭頸扭斜，伴有頭部震顫等神經(jīng)癥狀，排黃綠色或白綠色稀便，病死鴨呈角弓反張等癥狀。每天死亡50～100只不等，死亡率約為5%。剖檢病死鴨，均為典型的心包炎、肝周炎、氣囊炎等纖維素滲出特征，肝臟、脾臟腫大，肺臟出血、淤血，喉頭有粘液。

2.2? 細(xì)菌分離與培養(yǎng)特征? 肝臟、脾臟、腦組織等病料接種TSA，燭缸培養(yǎng)24h，均有菌落長(zhǎng)出，而麥康凱瓊脂平板上無(wú)菌落長(zhǎng)出。挑取單個(gè)菌落，接種TSA、TSB純化培養(yǎng)，同時(shí)分別涂片革蘭氏、瑞士染色鏡檢。TSA純培養(yǎng)菌落直徑多為1～2mm，邊緣整齊、微隆起、半透明，呈晶瑩光滑黃油狀。革蘭氏染色鏡檢，可見(jiàn)紅色小桿菌，無(wú)芽孢，單個(gè)或成雙存在，有的菌體連接為一串，呈弧狀、長(zhǎng)絲狀。瑞士染色呈兩極濃染。

2.3? 生化特征? 分離菌不分解葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、水楊苷，VP試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)均為陰性，不產(chǎn)生H2S，符合鴨疫里默菌的生化特征[5]。

2.4? PCR檢測(cè)結(jié)果? 經(jīng)檢測(cè)，分離菌與參考菌均在860bp處擴(kuò)增出目的條帶，空白對(duì)照無(wú)任何條帶擴(kuò)出，見(jiàn)圖1。

2.5? 藥敏試驗(yàn)結(jié)果? 分離菌對(duì)頭孢噻呋、大觀霉素高敏，對(duì)卡那霉素、新霉素中敏，對(duì)鏈霉素、克林霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、多粘菌素、氟苯尼考、利福平耐藥。

3? 分析與討論

3.1? 通過(guò)臨床特征、病理剖檢、細(xì)菌分離、生化試驗(yàn)及PCR檢測(cè)，確診引起該場(chǎng)發(fā)病的病原為鴨疫里默菌。通過(guò)藥物敏感性試驗(yàn)，推薦遴選敏感藥物大觀霉素用于臨床治療。跟蹤反饋意見(jiàn)，防治效果良好。

3.2? 鴨疫里默菌能通過(guò)污染的飼料、飲水、飛沫等經(jīng)呼吸道、消化道及皮膚表面?zhèn)诘榷喾N途徑引起鴨群發(fā)病[6]。其臨床特征與鴨大腸桿菌病、沙門(mén)氏菌病等具有相似性。由于缺乏合適的選擇性培養(yǎng)基，常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)鑒別方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。基于16S rRNA基因序列或RA的外膜蛋白A基因保守序列設(shè)計(jì)引物，建立的PCR檢測(cè)方法、熒光定量PCR檢測(cè)方法[7-9]等具有特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)勢(shì)，且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病料組織的直接測(cè)定，大大縮短診斷時(shí)間，已成為該病快速診斷的有效方法。

3.3? 該病的防控措施主要有疫苗免疫與藥物防治，一般認(rèn)為該菌血清型眾多，且不同血清型缺乏理想的交叉保護(hù)[10，11]，提高了疫苗制備的難度。但分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果，分離菌存在多重耐藥，單純依靠藥物防治亦有其局限性。劉建濤等[12]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，免疫鴨傳染性漿膜炎三價(jià)疫苗，能有效提高成活率2.1%，且料肉比有所降低。因此，在鴨傳染性漿膜炎通用疫苗研發(fā)上市之前，選擇區(qū)域優(yōu)勢(shì)血清型進(jìn)行疫苗制備，結(jié)合藥敏試驗(yàn)選擇敏感性藥物進(jìn)行防控是最佳組合措施。

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