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    一種用于微滴式d-PCR 的疏水通道微流控芯片制備方法

    2020-09-02 09:01:08王帥超曾杰生王姍姍
    關(guān)鍵詞:微滴載玻片玻片

    王帥超,曾杰生,王姍姍

    (廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院/廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院,廣東 佛山 528000)

    微流控芯片技術(shù)作為一種新興的技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了數(shù)十年,基于微流控芯片技術(shù)的應(yīng)用也漸漸趨向于生物檢測醫(yī)用方向[1-2]。近年來,在有限而又昂貴的樣本條件限制下,使得樣本反應(yīng)數(shù)量無限化的微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)的應(yīng)用迅速發(fā)展[3-4]。以檢測生成微滴擴(kuò)增后樣本中基因變異數(shù)成為一種日趨可行化的方案。一個(gè)穩(wěn)定的微滴生成體系包含了表面性質(zhì)穩(wěn)定的微流控芯片和相對穩(wěn)定的試劑化的連續(xù)相及分散相[5];基于此,本文探究了內(nèi)部流道表面性質(zhì)穩(wěn)定的微流控芯片制備即玻片表面改性的方法及所得微流控芯片用于生成微滴的性能。

    通常實(shí)驗(yàn)室階段用于微流控芯片制備的原料是聚二甲基硅氧烷[6-7],雖然聚二甲基硅氧烷(PDMS)基材表面為疏水性質(zhì),但是與其鍵合的芯片內(nèi)部通道玻片表面屬親水性質(zhì),大大削弱了試劑改良后的微滴生成效果。本文基于成熟的制備微流控芯片的軟光刻工藝[8],提出一種簡單高效的微流控PDMS芯片疏水表面制備方法,大大改善了玻璃基底的表面疏水性質(zhì),提高了疏水性能,使得微流控芯片的微滴生成更易實(shí)現(xiàn)。

    1 通道表面疏水的微流控芯片制備

    1.1 硅基模具的制作

    在液滴微流控系統(tǒng)中,主要有三種生成微滴的通道結(jié)構(gòu):T 型結(jié)構(gòu)、流動聚焦結(jié)構(gòu)及共軸流結(jié)構(gòu)[9]?;诒緦?shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ),采用常用的十字交叉法[10]微滴生成方案,通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)得到預(yù)設(shè)計(jì)的微流控微滴生成芯片圖紙,并通過高分辨率打印得到用于光刻的菲林掩模版。其最小線寬為20 μm,滿足微滴生成需要。

    光刻采用國產(chǎn)接觸式紫外光刻機(jī)(URE-2000/A型),將負(fù)性光刻膠SU8-3050 涂覆在等離子清洗處理過的硅片表面,目標(biāo)膠層厚度為50 μm。曝光后經(jīng)后烘、顯影、硬烘等常規(guī)工藝即可制得硅基模具。其中各項(xiàng)指標(biāo)均參照SU8-3000系列光刻膠產(chǎn)品說明書。

    1.2 載玻片的表面改性

    一般商用的載玻片并無表面修飾或改性,其表面性質(zhì)與普通玻璃表面性質(zhì)相近[11]。本實(shí)驗(yàn)室采用常見的玻璃載玻片,其規(guī)格為25*76*1 mm。首先將待處理玻片清洗,去除雜質(zhì)及有機(jī)物質(zhì),一般包括去離子水清洗和酸性溶液超聲清洗,可適當(dāng)加熱以提高清洗效率。清洗程序一般設(shè)置為40 KHz、30 min,烘干后使用Piranha 溶液清洗30 min,更換去離子水后連續(xù)清洗數(shù)次,后置于真空干燥箱于65 ℃條件下烘干,確認(rèn)載玻片表面無明顯可見雜質(zhì)或水漬,降至室溫后置于干燥處備用。再將清洗后的玻片置于丙酮溶液中浸泡,隨后對其進(jìn)行超聲處理,處理程序設(shè)置為40 KHz、30 min,連續(xù)處理三次后使用去離子水洗去表面殘留,并置于烘箱烘干??啥啻问褂帽貜?fù)處理,以提高表面改性效果。

    1.3 PDMS 芯片鍵合及微滴生成驗(yàn)證

    PDMS 蓋片的澆注及成型采用常規(guī)微流控芯片加工工藝制備,使用Dow Corning-184 套裝,10 ∶1 比例配制膠體溶液,固化程序設(shè)置為65 ℃、2 h。然后經(jīng)過清洗、打孔、切割等后續(xù)工藝得到PDMS 蓋片。由于處理后的載玻片表面是非親性質(zhì)的,故需適當(dāng)延長Plasma 表面處理時(shí)間以確保PDMS 蓋片與載玻片鍵合效果。經(jīng)實(shí)際實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對比,等離子表面處理程序設(shè)置為115 W,真空度80 Pa 左右,處理時(shí)間為40 s 時(shí),PDMS 與玻片鍵合效果較好,既能保證完全鍵合且不發(fā)生翹曲現(xiàn)象。鍵合后的芯片需經(jīng)過老化處理后即可進(jìn)行微滴生成測試。

    微滴生成測試采用正壓進(jìn)樣的方式,由于微流控芯片通道的微小尺度特性,實(shí)驗(yàn)過程需保證壓力源的穩(wěn)定及良好的氣密性。從而確保實(shí)驗(yàn)過程中不產(chǎn)生壓力擾動等干擾因子,有效保證生成微滴的穩(wěn)定性和均一性,見圖1。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 硅基PDMS 芯片的制備

    通過測定PDMS 蓋片通道部分橫截面參數(shù)即通道高度得到硅基模具上的膠層厚度,驗(yàn)證設(shè)計(jì)圖紙與實(shí)物芯片各項(xiàng)參數(shù)的一致性。分別測定硅基底對應(yīng)PDMS 蓋片不同位置處的高度數(shù)據(jù),得到其通道高度及寬度,見圖2。

    表1 表明PDMS 蓋片各測量點(diǎn)位深度均值均在50~51 μm 之間,數(shù)據(jù)具有較好的一致性,由于儀器本身所具有的光刻誤差,導(dǎo)致設(shè)計(jì)值與實(shí)際值之間具有一定的誤差;但不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)開展。

    圖1 微流控芯片及進(jìn)樣氣路系統(tǒng)示意圖

    圖2 PDMS 蓋片通道橫截面參數(shù)

    表1 PDMS 蓋片通道高度參數(shù) μm

    2.2 玻璃載玻片表面改性評估

    以純水作為連續(xù)相溶液,采用滴液式方法以測定表面疏水角為特征參數(shù)表征玻片表面疏水程度[12];實(shí)驗(yàn)測定了不同處理方式的玻片樣本,以清洗烘干后的玻片作為空白對照,經(jīng)過改性處理的玻片表面呈現(xiàn)出一定的疏水特性,其疏水角接近80 度。

    實(shí)驗(yàn)分別測定了經(jīng)過一次、二次、三次改性處理且經(jīng)過等離子處理后(即鍵合前)靜置72 h 后的玻片表面疏水角,見表2。

    表2 不同玻片表面疏水角參數(shù)統(tǒng)計(jì) 單位/角度°

    結(jié)果表明改性后鍵合前靜置72 h 的玻片疏水角在65 °左右,僅改性后(未經(jīng)氧等離子處理)的玻片疏水角接近80 °,而未改性(經(jīng)過Plasma 處理后)的玻片則只有幾度的疏水角,見圖3。這表明了玻片經(jīng)Plasma 處理后親水性極大的提升,但隨著時(shí)間的推移,玻片表面逐漸恢復(fù)改性后的特征,這與已有的相關(guān)研究結(jié)果吻合[13-14]。

    圖3 不同處理玻片的表面疏水角度參數(shù)

    玻璃主要成分為二氧化硅,硅原子在多面體中央;氧在頂角,為公共氧,一個(gè)氧最多與兩個(gè)形成網(wǎng)絡(luò)的正離子相連。多面體頂角無規(guī)則相連,通過公共氧(橋氧)搭成無規(guī)則網(wǎng)絡(luò)[15]。而玻璃表面結(jié)構(gòu)是不對稱的。配位不全,存在著斷鍵,因而具有極性。表面結(jié)構(gòu)的無序程度較內(nèi)部增加,表面化學(xué)鍵相比玻璃內(nèi)部普遍存在斷鍵,即由 ≡Si-O-Si ≡ 斷裂成為≡Si-O 和 =Si-[16]。在清洗過程中玻璃表面部分?jǐn)噫I發(fā)生羥基化,在與丙酮相互作用的過程中,其中的硅原子及其上的活性羥基與丙酮中斷裂的碳氧雙鍵發(fā)生作用,形成新鍵 ≡Si-O-CH(CH3)2;此時(shí)接枝的甲基為吸電性甲基,裸露在玻璃表面,起到了降低了其表面能的作用,從而在宏觀上表現(xiàn)出一定的疏水性能。

    2.3 芯片微滴生成質(zhì)量測試

    為驗(yàn)證玻片表面改性方案對微流控芯片生成微滴性能的影響,實(shí)驗(yàn)分別探究了改性前后玻片所制作的微流控芯片在不同油水壓力條件下的生成性能及生成微滴的直徑大小等。

    實(shí)驗(yàn)油水相分別采用氟油和去離子水,進(jìn)樣壓力均設(shè)置為20 kPa。此條件下,改性后芯片可長時(shí)間穩(wěn)定生成油包水微滴,如圖4a;生成的微滴具有較好的均一性,其直徑大小約為89 μm,如圖4c、4d 所示。但是未改性的玻片所制得的芯片在相同條件下不能保持長時(shí)間穩(wěn)定生成,主要表現(xiàn)在十字交叉口處生成界面不穩(wěn)定,導(dǎo)致其終端所生成微滴直徑不均一,如圖4b 所示。

    同時(shí)實(shí)驗(yàn)探究了該芯片可用于生成微滴的進(jìn)樣壓力閾值及生成微滴直徑范圍,當(dāng)油水相壓力分別為15 kPa、20 kPa 時(shí),油水比極小、生成微滴較大,隨時(shí)可能產(chǎn)生層流;當(dāng)油水相壓力分別為26 kPa、20 kPa 時(shí),油水比極大、生成微滴較小,生成頻率過小。如圖5 所示。由表3 中數(shù)據(jù)可得,當(dāng)水相壓力固定時(shí),生成微滴直徑隨油相壓力增加而減小。在非臨界范圍內(nèi),所生成微滴大小呈現(xiàn)出一定的線性變化規(guī)律。但是未改性芯片由于不能穩(wěn)定生成,其終端微滴大小不一,沒有統(tǒng)計(jì)意義。

    圖4 生成芯片生成性能驗(yàn)證

    圖5 特定臨界生成情況

    表3 生成微滴范圍情況

    3 結(jié)論

    本文提出一種簡單高效的玻片表面改性方案,并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該方案用于微滴式數(shù)字PCR 微滴生成模塊的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過改性的玻片表面疏水性能有極大提升,且經(jīng)過長時(shí)間放置其疏水性能仍可以保持穩(wěn)定。鍵合后微流控芯片在一定范圍內(nèi)可以穩(wěn)定生成穩(wěn)定均一的微滴。與以往的方法相比,該方案操作簡便、成本低廉且可以批量處理,并且提高了微流控生成芯片微滴生成的大小閾值范圍,在微滴式數(shù)字PCR 的產(chǎn)業(yè)化中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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