中間錦雞兒CiCesA3的克隆及表達(dá)分析

朱宏，柴文娟，楊飛蕓, 3，王瑞剛 , 3

(1. 哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物逆境生理與分子生物自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)植物基因資源挖掘與分子育種工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

植物細(xì)胞最外層透明的薄壁組織結(jié)構(gòu)稱為細(xì)胞壁，具有保護(hù)和支持細(xì)胞的作用.纖維素、半纖維素和果膠等是細(xì)胞壁的主要組分，纖維素是由β-1,4-葡聚糖鏈組成的大分子多糖類物質(zhì)，是自然界中分布最廣、地球上生物量最多，與人類生產(chǎn)生活密切相關(guān)的可再生資源[1].

纖維素主要由纖維素合酶(cellulose synthase, CesA)合成[2]，編碼纖維素合酶的基因CesA在各物種中比較保守，通常包含9～13個內(nèi)含子，長度為3.5～5.5 kb[1].由CesA基因所編碼的纖維素合酶單體，需在高爾基體上組裝成為具有對稱玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)的纖維素合酶復(fù)合體(cellulose synthase complex, CSC)[3]，然后由分泌泡(secretory vesicles)將其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，纖維素才在細(xì)胞膜上得以生成并最終沉積到細(xì)胞壁上[4].CesA蛋白的保守結(jié)構(gòu)域主要包括：負(fù)責(zé)與其他CesA單體互作的鋅指/環(huán)指結(jié)構(gòu)(zinc-/Ring finger motif，位于N端)、8個跨膜區(qū)(Transmembrane domains，TMD；2個在N端，6個在C端)、β-糖苷基轉(zhuǎn)移酶的保守序列、D…D…D…QxxRW結(jié)構(gòu)(x為任意氨基酸)、1個高度可變區(qū)和1個植物保守區(qū)域[5-7].自第1個CesA基因在木醋桿菌Bacillusxylinus中被分離發(fā)現(xiàn)以來[8]，得益于生物技術(shù)手段與測序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的纖維素合酶基因被發(fā)現(xiàn)鑒定.目前，擬南芥Arabidopsisthaliana、楊樹Populusalba、棉花Gossypiumherbaceum、玉米Zeamays、葡萄Vitisvinifera、水稻Oryzasativa、馬尾松PinusmassonianaLamb和苧麻Boehmerianivea等40多個物種的16 400多條CesA基因序列都已被研究報道[9-10].擬南芥CesA基因家族共有10個成員，其中AtCesA1、AtCesA2、AtCesA3、AtCesA5、AtCesA6和AtCesA9參與植物細(xì)胞壁的初生壁形成時期纖維素的合成，而且已有研究表明AtCesA6和AtCesA2、AtCesA5、AtCesA9基因功能有部分冗余[11-13].次生壁纖維素的合成則由AtCesA4、AtCesA7和AtCesA8基因負(fù)責(zé)[12-14].Carroll等[15]研究發(fā)現(xiàn)AtCesA7基因可部分恢復(fù)cesa3突變體的初生細(xì)胞壁合成受阻的表型，表明初生壁CesA和次生壁CesA蛋白功能可以互補(bǔ).

中間錦雞兒是廣泛分布于中國西北部半干旱、干旱地區(qū)的一種多年生灌木，屬于豆科錦雞兒屬植物[16].近年來因其具有一定的飼用造紙等經(jīng)濟(jì)價值，同時也具有綠化環(huán)境、防風(fēng)固沙的生態(tài)價值而受到關(guān)注.當(dāng)中間錦雞兒做造紙用時，需要其具有較高含量的纖維素；做飼料用時，考慮到動物適口性及消化等因素，則要求中間錦雞兒纖維素含量不可過高.因此通過基因工程手段改變纖維素含量或質(zhì)量成為研究熱點(diǎn).本研究以中間錦雞兒為材料，通過同源克隆及RACE(rapid amplification of cDNA end)技術(shù)，從中間錦雞兒中克隆得到CiCesA3基因全長cDNA序列，并對基因進(jìn)行了生物信息學(xué)和組織表達(dá)分析，為進(jìn)一步了解中間錦雞兒纖維素合成提供了依據(jù).

1 材料和方法

1.1 植物材料與處理方法

實(shí)驗(yàn)所用中間錦雞兒種子采于內(nèi)蒙古烏蘭察布市四子王旗.選取生長飽滿的種子播種于裝有營養(yǎng)土和蛭石(體積比1∶3)的培養(yǎng)缽中，在溫室中培養(yǎng)25 d，具體培養(yǎng)條件為7 000～8 000 lx光照強(qiáng)度、22 ℃、16 h光照/ 8 h黑暗.

選擇長勢良好、未受脅迫的中間錦雞兒幼苗用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).小心從蛭石中取出中間錦雞兒幼苗，并用清水清洗干凈幼苗根部的蛭石，放于清水中，以溫室培養(yǎng)條件培養(yǎng)2 d.分別剪取幼苗的根、莖、葉部分并于液氮中速凍，存于-80 ℃?zhèn)溆?

1.2 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

利用TRIzol(Invitrogen公司)法進(jìn)行中間錦雞兒總RNA及根、莖、葉RNA的提取.用超微量紫外分光光度計(Quawell公司，Q5000)測定所提取的檸條總RNA及不同組織RNA的含量，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，選取條帶清晰且無拖帶現(xiàn)象的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄.

取1 000 ng純化過的總RNA，利用RTase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(大連寶生物工程有限公司，TaKaRa)，依照反轉(zhuǎn)錄試劑說明書合成cDNA第1條鏈.

1.3 基因保守區(qū)克隆與cDNA末端快速擴(kuò)增

根據(jù)大豆Glycinemax、楊樹、棉花Gossypiumraimondii以及中間錦雞兒中其他已知的CesA基因序列，利用Primer premier5.0軟件設(shè)計簡并引物(表1)，以cDNA第1條鏈為模板進(jìn)行基因中間片段的克隆.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)體系：10×LA PCR Buffer Ⅱ(+Mg2+)5 μL，上游(CiCesA3-jb5＇)和下游(CiCesA3-jb3＇)引物各2 μL(10 μmol/L)，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)8 μL，模板1 μL，LA Taq酶0.5 μL，無菌水31.5 μL.引物退火溫度為58 ℃，PCR反應(yīng)條件依照TaKaRa LA Taq?說明書(Cat#RR002B)設(shè)置.PCR反應(yīng)中所用到的rTaq酶、PrimeSTAR高保真酶、LA Taq酶及Marker DL5000均購于TaKaRa.

表1 基因克隆與表達(dá)分析所用引物

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，利用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化(膠回收試劑盒采購于天根生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司).將純化過的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體(TaKaRa)相連接，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細(xì)胞DH5α，37 ℃培養(yǎng)9～12 h.藍(lán)白斑篩選后，使用移液槍挑取白色陽性克隆菌落，溶于20 μL無菌水中并吹打混勻，取5 μL上述菌液為模板進(jìn)行菌落PCR.挑選成功擴(kuò)增出目的基因的陽性克隆搖菌(37 ℃，200 r/min, 培養(yǎng)9～12 h)，取2 mL菌液送上海生工生物工程有限公司測序.

根據(jù)測序得到的部分基因序列設(shè)計RACE引物CiCesA3-rc5＇、CiCesA3-rc3＇(表1)，以中間錦雞兒cDNA為模板進(jìn)行RACE實(shí)驗(yàn)，具體操作按照SMARTerTM RACE cDNA Amplification kit試劑盒(TaKaRa)說明書進(jìn)行.

1.4 CiCesA3基因cDNA全長克隆

將RACE得到的序列與中間保守序列進(jìn)行拼接，獲得CiCesA3基因全長序列，設(shè)計特異性全長引物CiCesA3-5＇和CiCesA3-3＇(表1)對拼接結(jié)果進(jìn)行PCR驗(yàn)證.PCR反體系：5×Primer STAR buffer(+Mg2+)10 μL，上、下游引物各2 μL(10 mol/L)，模板1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，Primer STAR酶0.5 μL，無菌水補(bǔ)充至50 μL.引物退火溫度為62.3 ℃，PCR具體反應(yīng)條件根據(jù)PrimeSTAR HS DNA Polymerase說明書(Cat#R010B)設(shè)置.

1.5 CiCesA3基因組織特異性表達(dá)分析

根據(jù)CiCesA3基因cDNA序列設(shè)計qRT-PCR特異性引物(表1)，并利用SYBR@Green I熒光染料，以中間錦雞兒幼苗的根、莖、葉cDNA為模板，在實(shí)時熒光定量PCR儀(羅氏Light Cycler480)中進(jìn)行CiCesA3基因組織特異性表達(dá)分析.內(nèi)參基因選擇中間錦雞兒延伸因子EF1α(elongation factor 1-alpha，EF1α).PCR具體反應(yīng)體系及反應(yīng)條件依照TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)(Cat#RR420B).反應(yīng)結(jié)束后利用2-ΔCT算法分析數(shù)據(jù).

1.6 CiCesA3基因生物信息學(xué)分析

將基因序列輸入到NCBI Blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站搜索并比對，推測其序列的完整性.使用Vector NTI Advance@ 11.5軟件拼接擴(kuò)增得到的3段序列.登錄ExPASy 網(wǎng)站后，分別利用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)、ProParam(http://web.expasy.org/protparam/)工具進(jìn)行預(yù)測蛋白質(zhì)的親疏水性、理論等電點(diǎn)與分子質(zhì)量的預(yù)測.利用MEGA 5.0進(jìn)化分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.將氨基酸序列輸入到HNN網(wǎng)站中(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa)分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu).同時在CBS網(wǎng)站中，通過TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域的數(shù)量與位置.

2 結(jié)果與分析

2.1 CiCesA3基因克隆

從NCBI中下載大豆、楊樹、棉花等物種的纖維素合酶基因CesA3序列，分析這些序列的保守區(qū)域并根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計簡并引物，以中間錦雞兒cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1a).測序結(jié)果表明擴(kuò)增得到基因中間片段序列長度為2 287 bp，進(jìn)一步針對該中間片段設(shè)計引物，分別進(jìn)行3＇RACE和5＇RACE，電泳分別檢測到約700 bp(圖1b)和1 300 bp(圖1c)的擴(kuò)增產(chǎn)物.測序并將接頭序列剪切后，3＇RACE和5＇RACE擴(kuò)增產(chǎn)物長度為479 bp和1 198 bp.將擴(kuò)增獲得的3＇RACE、5＇RACE和中間片段進(jìn)行拼接得到中間錦雞兒CiCesA3基因.針對該基因序列設(shè)計特異性引物，以cDNA為模板，利用RT-PCR擴(kuò)增驗(yàn)證拼接得到的全長序列(圖2).測序結(jié)果表明CiCesA3基因cDNA全長為3 475 bp.

a.中間保守區(qū)域克??；b. 3＇RACE；c.5＇RACE；M. DL 5 000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).圖1 CiCesA3基因克隆凝膠電泳分析Fig.1 Agarose gel analysis of CiCesA3 gene cloning

1，2.CiCesA3全長cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物；M. DL 5000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).圖2 CiCesA3基因全長cDNA擴(kuò)增凝膠電泳分析Fig.2 Agarose gel analysis of CiCesA3 full-length cDNA cloning

2.2 CiCesA3基因序列分析

用ORF(open reading frame, ORF) finder分析該基因cDNA序列發(fā)現(xiàn)其具備完整的ORF，5＇UTR長度為175 bp，3＇UTR長度為76 bp， ORF長度為3 225 bp，編碼1 075個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA(圖3).將該基因序列輸入到NCBI Blast中進(jìn)行搜索發(fā)現(xiàn)，其和大豆GmCesA3基因相似度最高，故命名為CiCesA3.

小寫字母表示5＇UTR和3＇UTR.圖3 CiCesA3基因的cDNA及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 cDNA and deduced amino acid sequence of CiCesA3

2.3 CiCesA3蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析

對CiCesA3基因所推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)是6.54，分子質(zhì)量約為119.89 ku.此外，利用ProtScale工具分析所推導(dǎo)蛋白序列的親疏水性.正值越大說明該區(qū)域氨基酸越疏水，相反，負(fù)值越大表明該區(qū)域氨基酸越親水.分析發(fā)現(xiàn)第103、104位的谷氨酰胺(Gln)和天冬酰胺(Asn)具最低分值-3.244，親水性最強(qiáng)；第274位的精氨酸(Arg)則具最高分值3.2，疏水性最強(qiáng).多肽鏈中親水性氨基酸整體上分布較多，預(yù)示著該蛋白是親水的.同時還預(yù)測了CiCesA3蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該蛋白二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲占比最大，β折疊占比最小，α螺旋位于中間(表2).

表2 CiCesA3蛋白二級結(jié)構(gòu)

在TMHMM網(wǎng)站中預(yù)測了CiCesA3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白C端有6個跨膜區(qū)，具體氨基酸位置為851～873、885～907、922～944、970～992、1 002～1 024、1 037～1 056，此外N端第300個氨基酸位置附近也可能存在2個跨膜區(qū)(圖4).

圖4 CiCesA3蛋白跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果Fig.4 Predication of transmembrane domains of CiCesA3

2.4 CiCesA3基因的進(jìn)化分析

在NCBI BlastP中輸入中間錦雞兒CiCesA3氨基酸序列并進(jìn)行搜索，在搜索結(jié)果中下載擬南芥、大豆等物種的CesA序列進(jìn)行多重序列比對.結(jié)果顯示CiCesA3與大豆及擬南芥CesA3的氨基酸序列相似度非常高(圖5)，其中，與野生大豆GsCesA3(KHN37622.1)和大豆GmCesA3(XP_003542849.1)的相似度分別達(dá)到94%和92%，與同為初生CesA蛋白的大豆GmCesA1(XP_003542849.1)的相似度也達(dá)到69%.

從Genebank中下載與CiCesA3氨基酸序列相似的其他物種的序列，采用ClustalW法進(jìn)行多重序列比對，在MEGA5.0軟件中進(jìn)行中間錦雞兒CiCesA3的系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖6).分析結(jié)果表明，CiCesA3與大豆GmCesA3、野生大豆GsCesA3親緣關(guān)系最近，相似度均達(dá)到92%以上.此外CiCesA3與同是初生壁蛋白的大豆GmCesA1、擬南芥AtCesA1的親緣關(guān)系相對較近，序列相似度達(dá)到60%以上.而與次生壁蛋白，如野生大豆GsCesA4、GsCesA8、大豆GmCesA4、GmCesA8-like、GmCesA7、擬南芥AtCesA4、AtCesA8的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn).

圖中從上至下依次為野生大豆、擬南芥、中間錦雞兒和大豆的序列.圖5 CiCesA3和其他植物CesAs氨基酸序列比對Fig.5 Alignment of amino acid sequences from CiCesA3 and other plant CesAs

采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；Bootstrap 設(shè)置為1 000次.圖6 CiCesA3與其他植物CesAs系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of CiCesA3 and other plant CesAs

2.5 CiCesA3基因的組織表達(dá)分析

為了探究CiCesA3基因表達(dá)的組織特異性，本研究采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測了中間錦雞兒幼苗根、莖、葉中CiCesA3的表達(dá)情況.結(jié)果表明該基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，但表達(dá)量各有不同，其中，在葉中表達(dá)最高，莖中次之，根中最低，葉中的表達(dá)量是根中的7倍多(圖7).

圖7 CiCesA3組織特異性表達(dá)檢測Fig.7 Gene expression analysis of CiCesA3 from different tissue by qRT-PCR

3 討論

纖維素作為植物細(xì)胞壁的主要組分，對植物細(xì)胞的形態(tài)建成起著至關(guān)重要的作用.隨著人類對自然資源的過度開發(fā)與利用，可再生資源的研究逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，纖維素作為全球生物量巨大的可再生資源，正在被廣泛研究.中間錦雞兒不僅具有防風(fēng)固沙的生態(tài)價值，還具有重要的藥用、飼用及造紙價值.

本研究從中間錦雞兒中通過同源克隆、RACE技術(shù)獲得1個纖維素合酶基因——CiCesA3.序列分析表明該基因5＇UTR長為175 bp，3＇UTR長為76 bp，ORF長度為3 225 bp，編碼1 075個氨基酸.CiCesA3蛋白預(yù)測分子質(zhì)量為119.89 ku，是親水性蛋白.

植物細(xì)胞壁是保護(hù)、支撐細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)，分為初生壁和次生壁，構(gòu)成細(xì)胞壁的主要化學(xué)組分是半纖維素、纖維素以及木質(zhì)素.植物CesA基因常根據(jù)其表達(dá)時所具有的特定的時空性，被分為初生壁纖維素合酶基因和次生壁纖維素合酶基因[17-18].進(jìn)化分析結(jié)果表明，本研究中克隆得到的CiCesA3基因與次生壁CesA親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與同為初生壁CesA的AtCesA3和GmCesA3親緣關(guān)系更近.已有研究表明纖維素合酶是具有1個催化中心和多個跨膜區(qū)的典型細(xì)胞質(zhì)膜蛋白，中間錦雞兒CiCesA3蛋白具有D…D…D…QxxRW催化中心，且蛋白N端有2個跨膜區(qū)，C端有6個跨膜區(qū).

所有植物纖維素合酶基因都會參與纖維素的合成，同時有些家族成員還參與植物抵抗逆境脅迫的過程.由AtCesA1蛋白催化中心的1個氨基酸發(fā)生錯義突變(D640N)形成的擬南芥突變體any1，表現(xiàn)出植株矮小、根及毛狀體變少的表型，而且CSC移動速率和細(xì)胞壁結(jié)晶速度降低，但其纖維素總量和野生型并無差別[19].AtCesA3突變體mre1(G916E)植物根部細(xì)胞形狀改變且細(xì)胞分裂受到抑制，導(dǎo)致根及下胚軸變短變粗，同時還表現(xiàn)出纖維素含量降低、植株矮小的表型[20].此外，在煙草中表達(dá)AtCesA3ixr1-2基因使轉(zhuǎn)基因植物出現(xiàn)植株矮化、纖維素總量降低、次生壁纖維素雜亂沉積，同時對異惡草胺(isoxaben)耐受的表型[21].將擬南芥AtCesA6基因突變后發(fā)現(xiàn)，突變體植物纖維素含量降低，下胚軸和根變得又短又粗，而且植物根部皮層微管排列方向發(fā)生變化[22].二穗短柄草BrachypodiumdistachyonBdCesA4和BdCesA7基因突變后，植株變矮且開花延遲，同時細(xì)胞壁結(jié)晶纖維素合成減少，木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞的細(xì)胞壁變薄[23].在楊樹中過表達(dá)PtCesA8基因后，過表達(dá)植物出現(xiàn)生長停滯、枝條萎蔫、初生葉片變小、根系延伸受阻、細(xì)胞壁不規(guī)則和纖維素含量驟減等現(xiàn)象[24].

與擬南芥CesA1基因同源的花椰菜BrassicaoleraceaL.BoiCesA基因突變后，T3代植株葉片維管束細(xì)胞伸長不足，植物可溶性糖和脯氨酸含量升高，而且表現(xiàn)出比野生型更加耐鹽的表型[25].擬南芥次生壁蛋白CesA4/ IRREGULAR XYLEM5 (IRX5)、 CesA7/ IRX3和CesA8/ IRX1依賴于乙烯、水楊酸和茉莉酸信號途徑負(fù)調(diào)控植物抗病過程，當(dāng)茄科雷爾氏菌Ralstoniasolanacearum或黃瓜枯萎菌Plectosphaerellacucumerina侵染植物后，這3個基因的突變體植株表現(xiàn)出比野生型更抗病的表型，但初生壁CesA蛋白(CesA1、CesA3和CesA6)并不參與這一過程[26].根據(jù)已有研究結(jié)果可推測，中間錦雞兒CiCesA3也可能同時參與了纖維素的合成與植物抵抗非生物或生物脅迫的過程，但還需進(jìn)一步地實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.