生物再生生命保障系統(tǒng)中小麥秸稈好氧生物處理及其微生物群落演替

劉佃磊，王律杰，董迎迎，謝倍珍，3*，劉 紅，3

（1.北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京100191；2.北京航空航天大學(xué)環(huán)境生物學(xué)與生命保障技術(shù)研究所，北京100191；3.北京航空航天大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程高精尖中心，北京100191）

1 引言

生物再生生命保障系統(tǒng)（Bioregenerative Life Support System，BLSS）是目前國際上最先進(jìn)的、可實(shí)現(xiàn)高閉合度物質(zhì)循環(huán)的生命保障技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)在空間基地長期生存必不可少的關(guān)鍵技術(shù)［1］。高等植物作為BLSS中極其重要的部分，能為整個閉合系統(tǒng)持續(xù)提供食物和氧氣，幫助實(shí)現(xiàn)水循環(huán)，但是同時也會產(chǎn)生不可食部分，成為系統(tǒng)中固體廢物的主要組成之一。植物不可食生物量的循環(huán)處理是系統(tǒng)閉合性提高的關(guān)鍵影響因素［2-3］。

BLSS中固體廢物主要包括生活垃圾、乘員及動物糞便，以及植物不可食生物量等，其中植物秸稈處理技術(shù)要求最高。植物秸稈的處理技術(shù)有焚燒、化學(xué)處理、類土壤基質(zhì)（Soil-Like Substrate，SLS）技術(shù)及微生物發(fā)酵技術(shù)等［4］。焚燒技術(shù)易產(chǎn)生NOX、SOX等有害氣體，化學(xué)處理易產(chǎn)生廢酸、廢水［5］，SLS技術(shù)將秸稈等不可食部分經(jīng)過處理最終轉(zhuǎn)化為可種植植物的基質(zhì)，但會引入蚯蚓等外源不能處理的生物量，且處理時間略長［6］。微生物發(fā)酵處理固體廢物是將植物不可食生物量經(jīng)烘干磨碎后加入生物反應(yīng)器進(jìn)行生物好氧降解，反應(yīng)器溫度范圍為35～70℃，發(fā)酵后的基質(zhì)可以作為植物生長所需養(yǎng)分［7］。嗜熱菌在固體廢物處理中起著關(guān)鍵作用，尤其是在堆肥過程中［8-10］。

Trotman等［11-12］提出利用微生物處理技術(shù)將甜薯的葉、頂端、須根等不可食部分進(jìn)行生物降解，降解后的基質(zhì)浸提液與植物營養(yǎng)液一起進(jìn)行植物種植，實(shí)現(xiàn)小麥及大豆等作物栽培。艾為黨等［13］研究將植物不可食部分轉(zhuǎn)化為植物營養(yǎng)液供植物生長。Liu等［14-15］對月宮一號艙固體廢物處理進(jìn)行研究，將植物不可食部分好氧發(fā)酵為植物提供固體肥料，采用溫度調(diào)控CO2氣體產(chǎn)生，研究其對小麥生長期的影響。

小麥秸稈中木質(zhì)纖維素含量高，微生物自然發(fā)酵周期長，效率低，且腐熟難度大。在植物不可食部分的處理過程中，引入混合微生物菌劑能有效提高難降解有機(jī)物質(zhì)的降解效率［14］。細(xì)菌、真菌均有具有纖維素分解能力的種屬，其中細(xì)菌主要有芽抱桿菌屬（Bacillus）、瘤胃球菌屬（Run inococcus）、纖維單胞菌屬（Cellolon onas）和假單胞菌屬（Pseudon onas）等，最適生長pH一般偏中性或堿性，生長溫度一般是30～40℃［16］。真菌中的綠色木霉（Trichodern a viride）、康氏木霉（Trichodern a koningii）和黑曲霉（Aspergillus niger）等則被廣泛報道具有較強(qiáng)的纖維素和木質(zhì)素降解能力［17-19］。優(yōu)化植物秸稈好氧生物處理工藝參數(shù)并弄清其過程中的菌群演替規(guī)律，可為提高BLSS中固廢降解速率提供策略，也為高效菌劑篩選和制備提供參考。

本研究采用復(fù)合菌劑對小麥秸稈進(jìn)行好氧生物處理，首先通過搖瓶正交實(shí)驗(yàn)對好氧發(fā)酵的溫度、初始含水率及碳氮比3個因素進(jìn)行優(yōu)化；隨后采用適用于BLSS的固廢生物轉(zhuǎn)化器實(shí)驗(yàn)測試優(yōu)化條件下小麥秸稈的降解效率；最后對固廢生物轉(zhuǎn)化器發(fā)酵過程中發(fā)酵基質(zhì)微生物數(shù)目及群落結(jié)構(gòu)演變規(guī)律進(jìn)行分析。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)原料

小麥秸稈分別來自月宮105實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)種植小麥［20］及江蘇省贛榆市夾山鎮(zhèn)農(nóng)場；微生物菌劑為本實(shí)驗(yàn)室篩選的可降解纖維素的復(fù)合菌劑，該復(fù)合菌劑由食草動物糞便與植物秸稈長期好氧發(fā)酵篩選培養(yǎng)而來。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計

設(shè)置溫度、初始含水率、碳氮比3個因素，每個因素設(shè)置3個水平進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，各因素的水平設(shè)置如表1所示。經(jīng)測試，月宮105實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)種植的小麥秸稈含氮量為2.52%，含碳量為45.9%；而農(nóng)場種植小麥秸稈含氮量為0.48%，含碳量為46.5%，因此可通過計算不同碳氮比小麥秸稈的使用比例，設(shè)置20∶1、25∶1及30∶1的碳氮比。根據(jù)正交試驗(yàn)方法［21］，選用L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計，共設(shè)置9組實(shí)驗(yàn)。

表1 正交因素和水平表Table 1 Orthogonal factors and levels

在9組500mL三角瓶中加入長度約為0.5～1.0 cm的小麥秸稈各20 g（干重），每組按照含水率添加相應(yīng)比例水分并充分混勻，以透氣封口膜封口，高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌20 min。滅菌完成后，冷卻，接種小麥秸稈5%（干重比）的復(fù)合微生物菌劑，恒溫?fù)u床中振蕩（200 r/min）發(fā)酵20天，隨后測試各組小麥秸稈減重率，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果得出最優(yōu)發(fā)酵溫度、初始含水率以及碳氮比。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個平行實(shí)驗(yàn)。

2.3 固廢生物轉(zhuǎn)化器處理秸稈實(shí)驗(yàn)過程

利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的BLSS固廢生物轉(zhuǎn)化器［10］進(jìn)行上述優(yōu)化條件的發(fā)酵效果驗(yàn)證。根據(jù)三角瓶優(yōu)化的最優(yōu)條件，設(shè)置固廢生物轉(zhuǎn)化器運(yùn)行溫度、小麥秸稈初始含水率及碳氮比。固廢生物轉(zhuǎn)化器攪拌速率設(shè)置為20 Hz，固廢生物轉(zhuǎn)化器中加入2 kg小麥秸稈（干重），接種100 g干重（秸稈干重比例5%）復(fù)合菌劑并連續(xù)發(fā)酵20天。

對固廢生物轉(zhuǎn)化器中發(fā)酵第5天、10天、15天、20天發(fā)酵樣品取樣，測試發(fā)酵第20天時固廢生物轉(zhuǎn)化器中剩余物料含水率、干重、樣品pH值、電導(dǎo)率、碳元素、氮元素以及碳氮比。測試第5天、10天、15天、20天發(fā)酵樣品中的微生物數(shù)目。

固廢生物反應(yīng)器中原始菌劑、發(fā)酵第5天、第10天、第15天、第20天樣品分別標(biāo)記為A1、B1、B2、B3、B4。對A1、B1、B2、B3、B4樣品進(jìn)行DNA提取及PCR純化，純化后的樣品進(jìn)行高通量測序工作。

所有樣品均隨機(jī)取樣3個，各測試指標(biāo)結(jié)果以3份樣品檢測結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2.4 測試方法

1）減重率的測定。分別稱取每組實(shí)驗(yàn)發(fā)酵前的物料干重n、發(fā)酵后的基質(zhì)重量n'。則減重率M的計算見式（1）：

2）微生物數(shù)量檢測。稱取1 g樣品（干重）放入在三角瓶里（內(nèi)置無菌玻璃珠），加入10 mL去離子水，150 r/min搖床上振蕩30 min，制成液體樣品進(jìn)行微生物數(shù)目檢測。通過PROFILE1 3560 10X細(xì)菌快速測定儀（NHD，美國）檢測微生物中的ATP含量，通過換算得到樣品中微生物數(shù)［22］。

3）DNA提取及PCR純化。分別取1 g干重樣品加入10 mL去離子水于150 r/min搖床震蕩30 min，取1 mL浸提液通過E.Z.N.A DNA Isolation Kit（Omega Biotech，USA）提取樣品的全基因組DNA，并使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（AGE）在5 V·cm-1的電壓下檢測30 min。PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因的V3+V4超可變區(qū)，采用515F-907R引物擴(kuò)增，正向引物（5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'）及反向引物（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）。PCR擴(kuò)增真菌18S rDNA基因的ITS1區(qū)，采用的引物為SSU0817FSSU1196R，正向引物（5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3'）及反向引物（5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）。

擴(kuò)增體系采用全式金AP221-02：TransStart Fastpfu DNA聚合酶20μL，反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 4μL，2.5 mM dNTPs 2μL，上游引物0.8引物，下游引物0.8引物，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4μL，BSA 0.2μL，DNA模板10 ng，補(bǔ)ddH2O至20μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：1個循環(huán)（95℃下3min），27個循環(huán) （95℃下30 s；55℃下30 s；72℃下45 s），最后72℃下10 min。通過PCR擴(kuò)增器（ABIGeneAmp 9700，USA）擴(kuò)增DNA分子［23］。

4）高通量測序。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在上海美吉生物科技有限公司的Bio-Pharm Illumina Miseq平臺上進(jìn)行基因組測序。Miseq測序收集熒光信號以讀取DNA片段的序列。根據(jù)97%相似水平的操作分類單位（OTU）的生物信息的相似性水平及統(tǒng)計分析，對所有序列進(jìn)行劃分。然后產(chǎn)生一組代表性的序列，并使用SILVA數(shù)據(jù)庫（Release115，http：//www.arb-silva.de）為這些序列分配分類?；贠TU，構(gòu)建Veen圖，分析屬水平上微生物群落的相對豐度。

3 結(jié)果與討論

3.1 小麥秸稈好氧發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

通過20天的正交實(shí)驗(yàn)，以基質(zhì)的減重率為評價指標(biāo)，考察溫度、初始含水率和碳氮比3個因素的優(yōu)化結(jié)果，如表2所示。計算實(shí)驗(yàn)結(jié)果之極差R后進(jìn)行比較，可以看出，溫度R＞含水率R＞碳氮比R，三因素中影響最大的因素是溫度，其次是初始含水率，最后是碳氮比。根據(jù)減重率K1j、K2j及K3j在溫度、含水率、碳氮比因素下對應(yīng)的最大值分別是120.6，111.69，109.77，得出對應(yīng)的最優(yōu)發(fā)酵條件分別是含水率60%，溫度55℃，碳氮比30∶1。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

圖1為正交結(jié)果極差圖，由圖1可知，實(shí)驗(yàn)中溫度設(shè)計范圍分別為35℃（低溫）、45℃（中溫）和55℃（高溫），減重率隨溫度的變化逐漸增高，說明在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)菌劑的最適生長溫度是55℃。有文獻(xiàn)表明，絕大部分嗜熱性真菌的最適生長溫度為40～55℃之間［24］，而嗜熱性細(xì)菌的最適生長溫度為55～70℃［25］。該研究中溫度為55℃時減重率最高，該溫度適宜嗜熱性細(xì)菌和嗜熱真菌繁殖。隨著溫度升高減重率提高，但溫度高于60℃時，微生物活性會顯著降低［26］，因此，選擇55℃作為最佳反應(yīng)溫度。Strom［27］研究表明，嗜熱性細(xì)菌及嗜熱性真菌在高溫好氧生物轉(zhuǎn)化過程中，主要降解基質(zhì)中的纖維素及木質(zhì)素。這些嗜熱菌在高溫環(huán)境下新陳代謝迅速、代謝時間短、且酶的熱穩(wěn)定性高，因此在菌劑中加入此類菌有助于增加生物轉(zhuǎn)化的代謝率及縮短生物轉(zhuǎn)化周期。

圖1 正交優(yōu)化結(jié)果極差圖Fig.1 Range graph of orthogonal optim ization results

隨著初始含水率升高，減重率則呈現(xiàn)先升高后降低趨勢（圖1）。初始含水率為60%時小麥秸稈減重率最高。在生物轉(zhuǎn)化過程中，微生物每消耗1 g揮發(fā)性固體會產(chǎn)生0.6 g的新陳代謝水［28］。實(shí)驗(yàn)中微生物利用小麥秸稈過程中產(chǎn)生的水分會導(dǎo)致基質(zhì)中含水率升高，生物轉(zhuǎn)化過程中基質(zhì)含水率超過70%可導(dǎo)致基質(zhì)厭氧反應(yīng)，不利于植物秸稈的降解［29］。固體廢物生物轉(zhuǎn)化過程中最適含水率為65%，在該條件下基質(zhì)中有機(jī)質(zhì)降解率最高［30］，鑒于含水率會在生物轉(zhuǎn)化過程中升高，即初始含水率為65%時可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化過程中含水率高于70%而不利于生物轉(zhuǎn)化。因此，選取初始含水率60%為最優(yōu)初始含水率。

當(dāng)碳氮比分別為20∶1及25∶1時，基質(zhì)的平均減重率分別為35.30%及34.85%，而碳氮比為30∶1時，減重率達(dá)到最高，為36.59%（圖1）。發(fā)酵過程中，60%～70%的碳水化合物都被微生物以CO2的形式降解，剩余部分被作為細(xì)菌體的細(xì)胞成分利用掉［31］。碳素是微生物生長繁殖過程中，不可缺少的一種元素，高碳氮比的實(shí)驗(yàn)條件有利于刺激微生物活性，堆肥中最佳的碳氮比為25～35［32］，且高碳氮比有機(jī)質(zhì)的降解率高于低碳氮比有機(jī)質(zhì)降解率［33］。小麥秸稈降解過程選取碳氮比30∶1為最適碳氮比，該碳氮比不僅可以保證碳元素的供應(yīng)，而且該碳氮比下小麥秸稈的降解率最高。若碳氮比高于40可供消耗的碳元素多，氮素養(yǎng)料相對缺乏，細(xì)菌和其他微生物的生長受到限制，有機(jī)物分解速度慢，發(fā)酵過程就長；若碳氮比低于20，可供消耗的碳素少，氮素相對過剩，則氮極易變成氨態(tài)氮而揮發(fā)，導(dǎo)致氮素營養(yǎng)大量損失［34］。

3.2 固廢生物轉(zhuǎn)化器處理小麥秸稈降解結(jié)果

根據(jù)正交優(yōu)化得出的最優(yōu)發(fā)酵結(jié)果以及實(shí)際情況考慮，采取溫度55℃、初始含水率60%、碳氮比30∶1進(jìn)行固廢生物轉(zhuǎn)化器驗(yàn)證。物料發(fā)酵前后測試指標(biāo)見表3。

表3 發(fā)酵前后物料測試值Tab le 3 Test value ofmaterial before and after fermentatio n

發(fā)酵20天，2.1 kg（干重）物料最終剩余0.918 kg（干重），減重率為56.3%，該減重率高于三角瓶正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在最優(yōu)發(fā)酵條件下固廢生物轉(zhuǎn)化器降解率比最優(yōu)條件下三角瓶中降解率高13.8%，主要原因是固廢生物轉(zhuǎn)化器中通風(fēng)條件采用泵入式，而三角瓶實(shí)驗(yàn)中通風(fēng)主要采用搖床震蕩式，固廢生物轉(zhuǎn)化器中秸稈降解過程中溶氧更加均勻，微生物反應(yīng)速度更快，降解率更高。發(fā)酵20天后的物料為堿性，物料中離子濃度偏高，碳氮比還沒達(dá)到腐熟的標(biāo)準(zhǔn)（C∶N小于20∶1）［35］，根據(jù)腐熟物料pH值顯弱堿性為8～9［36］，該物料發(fā)酵20天時pH值符合腐熟物料pH值標(biāo)準(zhǔn)。且有研究表明發(fā)酵物料電導(dǎo)率低于9 ms/cm，物料對種子發(fā)芽率沒有抑制作用［37］，該研究中物料發(fā)酵20天后的電導(dǎo)率低于9 ms/cm，說明該電導(dǎo)率條件下物料不會抑制種子發(fā)芽，且該電導(dǎo)率也符合Garcia給出的腐熟物料電導(dǎo)率值［38］。pH值與電導(dǎo)率值雖然符合腐熟標(biāo)準(zhǔn)，但這兩個指標(biāo)只是物料腐熟的必要條件而不是充分條件。

3.3 利用固廢生物轉(zhuǎn)化器處理小麥秸稈的微生物數(shù)目及多樣性分析

3.3.1 微生物數(shù)量分析

固廢生物轉(zhuǎn)化器運(yùn)行過程中，所處理植物秸稈在不同時期的微生物總數(shù)變化如圖2所示。

圖2 微生物總數(shù)變化趨勢Fig.2 Trend of totalm icroorganism s

由圖2可知，發(fā)酵5天后基質(zhì)中微生物的數(shù)量達(dá)到1.23×105個/mL，之后在5～15天發(fā)酵過程中微生物的總數(shù)變化均不大，表明隨著實(shí)驗(yàn)環(huán)境的變化，以及基質(zhì)中碳源的限制，呈現(xiàn)出微生物的總數(shù)變化不明顯。但微生物組成可能會有比較大的變化。一方面是因?yàn)橹参锝斩捊Y(jié)構(gòu)是木質(zhì)素包被纖維素與半纖維素，微生物要破壞這種微觀結(jié)構(gòu)并分泌相關(guān)酶以適應(yīng)環(huán)境，可能存在較長的遲滯期［39］；另一方面，在這個過程中，可能存在不能夠利用物料的微生物被淘汰，而適應(yīng)的環(huán)境的微生物大量增殖，因此呈現(xiàn)出微生物的總數(shù)變化不明顯。隨后，當(dāng)發(fā)酵至20天時，微生物總數(shù)大幅增加，達(dá)3.27×107個/mL，可能是由于微生物對物料與環(huán)境條件已經(jīng)適應(yīng)，可降解木質(zhì)纖維素的微生物成為優(yōu)勢菌群大量繁殖，特別是嗜熱細(xì)菌及嗜熱真菌大量繁殖，促進(jìn)了小麥秸稈降解，因?yàn)槭葻嵴婢墚a(chǎn)生熱穩(wěn)定性的纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶［40］。嗜熱細(xì)菌能較容易地利用半纖維素，并在一定程度上改變木質(zhì)素的分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而分解溶解的木質(zhì)素［41］。

3.3.2 微生物群落變化

1）Venn圖

根據(jù)OTUs聚類分析統(tǒng)計的結(jié)果，構(gòu)建了Venn圖［42］，如圖3所示。A1為原始菌劑、B1至B4對應(yīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)酵后第5天、第10天、第15天以及第20天時采集的樣品。5個樣品中，細(xì)菌共有的OTUs達(dá)到41個，真菌的共有OTUs只有5個。表明原始菌劑中的可以在發(fā)酵過程中一直存活的細(xì)菌及真菌種類分別是41種和5種。原始菌劑的細(xì)菌OTU數(shù)一共有225個，而發(fā)酵5天后的OTU下降至155個，在實(shí)驗(yàn)中后期即10天、15天時OTU數(shù)又升到198個、185個，并在發(fā)酵20天后OTU達(dá)196個。原始菌劑中真菌的OTU有13個，發(fā)酵5天后上升至30個，并維持到15天后下降至27個，發(fā)酵結(jié)束后真菌OTU有23個。微生物OTU數(shù)目的變化表明在發(fā)酵前期原始菌劑中的部分細(xì)菌及真菌因不適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境而被慢慢淘汰。發(fā)酵中期后適應(yīng)環(huán)境的細(xì)菌及真菌大量繁殖，細(xì)菌及真菌種類又開始慢慢增加。發(fā)酵過程中5天，10天，15天及20天樣品中含有的原始菌劑以外的細(xì)菌及真菌數(shù)目分別是76、132，116、131和21、22，18、17。樣品中出現(xiàn)了原始樣品中不含有的微生物可能是因?yàn)榇瞬糠治⑸镌谠季鷦┲泻刻貏e低，沒有檢測出來，而在發(fā)酵過程中，該部分微生物適應(yīng)發(fā)酵條件，開始慢慢大量繁殖，最終在樣品中檢測出來，另外小麥秸稈本身帶有微生物，并且在取樣及實(shí)驗(yàn)操作中，環(huán)境中及操作人員身上有一部分微生物也可能進(jìn)入固廢生物轉(zhuǎn)化器中。

2）微生物群落結(jié)構(gòu)變化分析

根據(jù)樣品所測得序列結(jié)果，對比Silva數(shù)據(jù)庫對各個細(xì)菌OTU進(jìn)行物種注釋。通過注釋結(jié)果可知，5個樣品總共檢測到來自404個不同屬（genus）的細(xì)菌，原始菌劑中含有225個、發(fā)酵后的樣品分別含有155個、198個、185個和196個。其中原始菌劑中豐度最高的細(xì)菌主要分布在Pedobacter（地桿菌屬）、Phyllobacteriaceae（葉桿菌屬）、Sanguibacter（血桿菌屬）等。發(fā)酵5天的基質(zhì)中豐度較高的細(xì)菌主要分布在Cellvibrio（纖維弧菌屬）、Pedobacter（地桿菌屬）、Sanguibacter（血桿菌科）。發(fā)酵10天及15天的基質(zhì)樣品中細(xì)菌物種主要分布在Sphingobacteriun（鞘脂桿菌科鞘氨醇桿菌屬）、Thern obacillus（熱芽胞桿菌屬）、Bacillales（芽孢桿菌目）等。在基質(zhì)發(fā)酵20天后豐度最高的細(xì)菌物種分布在Ureibacillus（尿素芽胞桿菌屬）、Bacillus（芽胞桿菌屬）、Thern olactis（熱乳芽胞桿菌屬）等。Sphingobacteriun（鞘脂桿菌科鞘氨醇桿菌屬）是堆肥中溫度下降階段的一種優(yōu)勢菌，可以產(chǎn)生蛋白酶，幾丁質(zhì)酶及纖維素酶［43］。Thern obacillus（熱芽胞桿菌屬）及Thern olactis（熱乳芽胞桿菌屬）可以有效降解木質(zhì)纖維素［44-45］。Bacillus為厚壁菌屬中廣泛存在于糞便堆肥中的微生物，可以降解有機(jī)物，對木質(zhì)纖維素降解有一定的作用，具有木質(zhì)纖維素降解活性［46］。

圖3 不同發(fā)酵時間的基質(zhì)OTU分布Venn圖對比Fig.3 Comparison of Venn diagrams ofmatrix OTU distribution at different fermentation tim es

在真菌方面，根據(jù)測序結(jié)果對比Unite數(shù)據(jù)庫后，成功對55個不同屬的真菌完成注釋。原始菌劑中只測得13個不同屬，豐度最高的真菌主要分布在Scopulariopsis（帚霉屬）、Saccharon ycetales（酵母菌屬）、Galacton yces（地霉屬白地霉）等?；|(zhì)發(fā)酵5天后，測得30個不同的屬，其中優(yōu)勢真菌為Bron eliothrix（鳳梨菌屬）、Sordarion ycetes-incertae-sedis（硫霉菌科未知屬）、Cryptosporidiun（隱孢子蟲屬）等。發(fā)酵10天、15天以及20天后，基質(zhì)中測得的屬分別有30個、27個以及23個，但基質(zhì)從發(fā)酵第10天起直到基質(zhì)發(fā)酵結(jié)束，優(yōu)勢真菌維持在Scopulariopsis（帚霉屬）、Aspergillus（曲霉屬）、Cryptosporidiun（隱孢子蟲屬）、Basidion ycotaincertae-sedis（擔(dān)子菌科未知屬）、Sordarion ycetesincertae-sedis（硫霉菌科未知屬）等。圖4所示為具體樣品中的微生物組成與相對豐度。

圖4 在屬水平的樣品微生物群落結(jié)構(gòu)柱狀圖Fig.4 Histogram ofm icrobial community structure of samples at genus level

在發(fā)酵5天后的樣品中發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)中微生物的復(fù)雜度明顯降低，一些即使在原始菌劑中豐度比較高的菌種如Devosia（德沃斯氏菌屬）、Brevundin onas（短波單胞菌屬）、Sanguibacter（血桿菌屬）、Galacton yces（地霉屬白地霉）等都在發(fā)酵反應(yīng)開始后就逐漸被淘汰，可能是因?yàn)榘l(fā)酵環(huán)境中缺乏這些菌種生長條件。細(xì)菌群落的變化結(jié)果中基質(zhì)發(fā)酵5天后的樣品中，出現(xiàn)大量的Cellvibrio（纖維弧菌屬），這是一種纖維素降解細(xì)菌，富含于礦化垃圾中［47］。發(fā)酵10天后的基質(zhì)中Bacillus（芽胞桿菌屬）的豐度呈指數(shù)性增多。有研究表明，Bacillus（芽胞桿菌屬）是固體廢物生物轉(zhuǎn)化過程中的優(yōu)勢菌種，并能將基質(zhì)中的木質(zhì)纖維素分解利用［48］。5～10天時微生物數(shù)目變化不大，但微生物組成變化很大，說明微生物在適應(yīng)基質(zhì)，不適應(yīng)基質(zhì)的微生物被淘汰，適應(yīng)的基質(zhì)的微生物大量繁殖。發(fā)酵10天至發(fā)酵20天期間，樣品中的微生物物種組成差別不大。比較原始菌劑與發(fā)酵20天后的樣品中，原始菌劑中有160個屬的細(xì)菌在發(fā)酵過程中逐漸被淘汰，如Roseon onas（玫瑰單胞菌）、Flavobacteriun（黃桿菌）、Rhizobiun（根瘤菌）等，因?yàn)樵擃愇⑸锊贿m應(yīng)發(fā)酵條件被慢慢淘汰。另外還有131個屬的菌種是原始菌劑中沒有的，但在發(fā)酵20天以后基質(zhì)中出現(xiàn)的，包括Ureibacillus（尿素芽胞桿菌屬）、Bacillus（芽胞桿菌屬）、Thern obifida（高溫雙歧菌）等會產(chǎn)生纖維素酶和木聚糖酶利于植物不可食生物量生物轉(zhuǎn)化的微生物［46］。

在真菌群落結(jié)果的變化分析中，Scopulariopsis（帚霉屬）是發(fā)酵過程中重要的一類真菌，其能分解木質(zhì)纖維素并對腐殖酸的形成有一定的作用［49］。發(fā)酵5天后，基質(zhì)中Scopulariopsis（帚霉屬）含量低，不是基質(zhì)中的優(yōu)勢菌種，基質(zhì)中主要以Bron eliothrix（鳳梨菌屬）和Sordarion ycetes-incertae-sedis（硫霉菌科未知屬）為主，主要原因可能是固廢生物轉(zhuǎn)化器中加入的秸稈沒有經(jīng)過滅菌，秸稈本身帶有這兩種微生物，而原始菌劑中的Scopulariopsis（帚霉屬）因?yàn)榘l(fā)酵前期秸稈降解困難，Scopulariopsis（帚霉屬）營養(yǎng)補(bǔ)充不夠充分，導(dǎo)致該菌種繁殖緩慢。隨著發(fā)酵進(jìn)行到第10天，Bron eliothrix（鳳梨菌屬）與Sordarion ycetes-incertae-sedis（硫霉菌科未知屬）因?yàn)椴贿m應(yīng)55℃高溫條件而被淘汰，此時秸稈降解可以為Scopulariopsis（帚霉屬）提高充足營養(yǎng)，并且Scopulariopsis（帚霉屬）適應(yīng)55℃高溫條件而快速繁殖成為基質(zhì)中的優(yōu)勢菌，同時基質(zhì)中Aspergillus（曲霉屬）大量繁殖成為優(yōu)勢菌，Aspergillus（曲霉屬）真菌可以具有降解木質(zhì)纖維素的功能［50］。從第10天開始到發(fā)酵結(jié)束基質(zhì)中Aspergillus（曲霉屬）微生物相對含量不斷增加，基質(zhì)中具有木質(zhì)纖維素降解功能的微生物增加對小麥秸稈的降解具有一定的促進(jìn)作用，也表明小麥秸稈的降解與微生物有關(guān)。

通過微生物分析可見，固廢生物轉(zhuǎn)化器中主要的優(yōu)勢微生物是木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的微生物，所以在BLSS中關(guān)于固體廢物處理菌劑制備可以采用具有木質(zhì)纖維素降解功能的嗜熱微生物，包括嗜熱細(xì)菌，真菌等。嗜熱微生物的大量繁殖可以加快木質(zhì)纖維素的降解，從而提高固體廢物的降解效率。

4 結(jié)論

1）經(jīng)三角瓶正交優(yōu)化及固廢生物轉(zhuǎn)化器擴(kuò)大化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得出，利用復(fù)合微生物菌劑降解小麥秸稈的最優(yōu)條件為溫度55℃，物料初始含水率為60%及碳氮比為30∶1。

2）利用固廢生物轉(zhuǎn)化器發(fā)酵20天秸稈降解率達(dá)到56.3%。

3）群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，種屬多樣性有下降趨勢，與木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的優(yōu)勢菌群Bacillus（芽胞桿菌屬）、Thern olactis（熱乳芽胞桿菌屬）、Scopulariopsis（帚霉屬）及Aspergillus（曲霉屬）多樣性顯著提高。

4）該研究提供了一種BLSS中固體廢物的生物處理的方法，并為固體廢物處理菌劑制備提供參考。