西瓜ClP5CS基因克隆及其功能研究

楊永超,王中元,楊小振,王永琦,3,張 宇,張 顯

(1 西北農(nóng)林科技大學 園藝學院，陜西 楊凌 712100；2 文山州農(nóng)業(yè)科學院，云南 文山 663099；3 漢中市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西 漢中 723000)

植物在經(jīng)受干旱、鹽、低溫及重金屬等脅迫時會在體內(nèi)合成和積累脯氨酸。脯氨酸除了作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)參與植物的滲透調(diào)節(jié)外，還在穩(wěn)定亞細胞結(jié)構(gòu)、清除自由基、維持細胞內(nèi)氧化-還原平衡、緩沖細胞質(zhì)pH、作為信號分子參與脅迫響應及生長發(fā)育、保持和代謝相適應的NADP+/NADPH等方面發(fā)揮作用[1]。在植物中，脯氨酸合成途徑有2條，即谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑[2]。在谷氨酸途徑中，谷氨酸在Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)作用下還原為谷氨酰半醛(GSA)，然后GSA環(huán)化轉(zhuǎn)變?yōu)镻5C，最后在吡咯啉-5-羧酸還原酶(P5CR)作用下生成脯氨酸。多數(shù)情況下，植物在脅迫條件下主要以谷氨酸途徑合成脯氨酸[3]。

P5CS是谷氨酸合成途徑中的限速酶，在脯氨酸合成和積累過程中發(fā)揮著重要作用[4]。通常植物中有2個P5CS基因。在擬南芥中，AtP5CS由AtP5CS1和AtP5CS2編碼，二者內(nèi)含子的相似性為39%～65%，而且這2個基因在功能上并不冗余[5]。在水稻中，OsP5CS1和OsP5CS2均能被干旱和鹽脅迫誘導表達；敲除OsP5CS2的突變體水稻植株對鹽和低溫脅迫敏感，但在正常生長條件下，突變株能正常生長和結(jié)籽，其產(chǎn)量減少不顯著，這說明OsP5CS2的主要角色為響應脅迫而不參與基礎的脯氨酸合成[6]。在甜高粱中，2個SbP5CS的啟動子中都含有與脅迫響應相關的順式作用元件，如ABRE、MYCCONSENSUSAT、MYBCORE、MeJA-responsive motif等。雖然有相似的順式元件，但SbP5CS1和SbP5CS2的表達量卻不同，在鹽和干旱脅迫下，SbP5CS1的表達量高于SbP5CS2，這可能與啟動子被調(diào)控的時間和空間不一致有關[7]。

P5CS基因受脅迫誘導表達的同時伴隨脯氨酸含量增加，這顯示了P5CS基因在作物改良中的潛力。Su等[8]將VignaaconitifoliaL.(一種豆科植物)的P5CS編碼序列轉(zhuǎn)入水稻發(fā)現(xiàn)，組成性表達和誘導性表達P5CS基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株的P5CS表達量及脯氨酸含量均比野生型植株高；在鹽和干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因水稻苗幼芽和根的生長均快于野生型水稻，且誘導性表達轉(zhuǎn)基因植株的生物產(chǎn)量高于組成性表達轉(zhuǎn)基因植株。Yamada等[9]將擬南芥和水稻的P5CS基因轉(zhuǎn)入牽?；ㄖ?，在正常生長條件下轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸含量比野生型植株提高了1.5～2.6倍，且擁有更強的抗旱能力。Yamchi等[10]將擬南芥的AtP5CS轉(zhuǎn)入煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草受干旱脅迫后其體內(nèi)的脯氨酸積累量高于非轉(zhuǎn)基因植株，并表現(xiàn)出較強的抗旱及抗鹽特性。

M08是一個相對抗旱的西瓜自交系[11]，前期轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，滲透脅迫下M08的2個P5CS基因在根中的表達模式不同[12]。目前針對西瓜ClP5CS基因的研究尚未見報道，因此本研究克隆了西瓜2個ClP5CS基因(Cla017928和Cla006553)，并將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，研究其抗旱抗鹽的功能，以期為抗旱耐鹽西瓜新品種的培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

西瓜自交系M08種子經(jīng)質(zhì)量分數(shù)2%的次氯酸鈉消毒10 min，再經(jīng)過55 ℃溫湯浸種20 min，浸種8 h后于30 ℃下催芽，種子露白后播于營養(yǎng)缽中，并置于日光溫室中培養(yǎng)。待2葉1心時控水進行干旱脅迫，植株出現(xiàn)蔫萎時取幼葉用于總RNA的提取。

基礎培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基(MS粉4.33 g/L、蔗糖20 g/L、瓊脂粉8 g/L)，LB培養(yǎng)基(胰化蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L)。大腸桿菌液體培養(yǎng)基：LB+50 mg/L卡那霉素；大腸桿菌固體培養(yǎng)基：LB+100 mg/L氨芐青霉素+15 g/L瓊脂粉；藍白斑篩選培養(yǎng)基：LB+100 mg/L氨芐青霉素+24 μg/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)+40 μg/L 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)+15 g/L瓊脂粉;農(nóng)桿菌固體培養(yǎng)基：LB+50 mg/L利福平+50 mg/L硫酸卡那霉素+50 mg/L慶大霉素+15 g/L瓊脂粉；農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基：LB+50 mg/L利福平+50 mg/L硫酸卡那霉素；擬南芥陽性苗篩選培養(yǎng)基：MS+50 mg/L硫酸卡那霉素。

RNA PlantPlus Reagent試劑盒、EasyGeno快速重組克隆試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)TOP10、反轉(zhuǎn)錄用FastQuant RT Kit(with gDAase)和2×TaqPCR MasterMix，均購自北京天根生化科技有限公司；高保真酶PrimeSTAR MAX Premix(2×)、克隆載體pMD-19T,均購自TaKaRa公司；EcoRⅠ、Hind Ⅲ，購自美國Thermo Fisher Scientific公司；IPTG、X-Gal、利福平、氨芐青霉素、慶大霉素、卡那霉素，均購自Solarbio公司；Silwet L-77、MS粉、瓊脂、蔗糖、酵母提取物、胰化蛋白胨、氯化鈉、甘露醇、脫落酸(ABA)等，均購自上海源葉生物科技有限公司；GV3101菌株、野生型擬南芥(Columbia生態(tài)型)及pBI221、pCAMBIA2300載體，均由西北農(nóng)林科技大學瓜類種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良實驗室保存。引物合成及克隆產(chǎn)物測序由上海生工生物完成。

1.2 方 法

1.2.1Cla017928及Cla006553的克隆及過表達載體構(gòu)建 用RNA PlantPlus Reagent試劑盒提取葉片總RNA，采用FastQuant RT Kit (with gDAase)進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將擬南芥AtP5CS1和AtP5CS2序列與西瓜基因組進行比對，發(fā)現(xiàn)其分別與西瓜Cla006553及Cla017928序列相近。以Cla017928及Cla006553的CDS序列為模板，設計引物Cla017928 CDS和Cla006553 CDS(表1)。Cla017928及Cla006553的CDS序列克隆體系為：高保真酶PrimeSTAR MAX Premix(2×) 25 μL，上下游引物各2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 22 μL。反應條件為：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s共30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物電泳并回收，在序列的3端添加A堿基后連接pMD-19T克隆載體，藍白斑篩選后進行菌落PCR，每個序列挑5個陽性菌株測序，同時提取質(zhì)粒。

將pCAMBIA2300載體使用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，電泳回收大片段。使用特異引物(35GN-23)克隆pBI221上的35S-GFP-NOS序列，并連接到線性化的pCAMBIA2300載體，構(gòu)建中間載體pCAMBIA2300-GFP。用XbaⅠ、KpnⅠ雙酶切將pCAMBIA2300-GFP線性化，電泳回收大片段備用。

以測序后的克隆載體為模板，用C9-23a和C5-23a引物擴增Cla017928及Cla006553序列，反應體系同上。產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后，與線性化的pCAMBIA2300-GFP進行重組連接，構(gòu)建Cla017928-GFP和Cla006553-GFP過表達載體。過表達載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。重組連接采用EasyGeno快速重組克隆試劑盒進行，反應體系為：線性化載體1 μL，目的序列4 μL，2×EasyGeno Assembly Mix 5 μL，ddH2O 10 μL，將混合物于50 ℃反應15 min。將獲得的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布于含卡那霉素的LB固體平板上，12 h后挑單菌落進行PCR檢測，挑選陽性菌落測序。

表1 試驗所用引物的序列及信息Table 1 Sequences and information of primers used for cloning in this study

將獲得的2個ClP5CS與擬南芥AtP5CS1、AtP5CS2(GenBank登錄號分別為：NM_129539、NM_115419.4)進行比對和保守功能域預測。利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

Ⅰ.中間載體;Ⅱ.Cla017928-GFP或Cla006553-GFP過表達載體Ⅰ .Indicates transitional vector；Ⅱ.Over expression vector for Cla017928-GFP or Cla006553-GFP圖1 Cla017928和Cla006553過表達載體結(jié)構(gòu)Fig.1 Overexpression vector construction of Cla017928 or Cla006553

1.2.2 過表達載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 將測序正確的中間載體及Cla006553-GFP和Cla017928-GFP過表達載體通過凍融法轉(zhuǎn)入感受態(tài)農(nóng)桿菌(GV3101菌株)中。具體方法為：向50 μL感受態(tài)農(nóng)桿菌中加入5 μL目的質(zhì)粒，混勻后于冰上靜置30 min，然后在液氮中速凍3 min，28 ℃水浴5 min，最后加入1 mL的LB液體培養(yǎng)基28 ℃振蕩培養(yǎng)5 h。取60 μL上述菌液涂布含利福平(50 mg/L)、慶大霉素(50 mg/L)和卡那霉素(50 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～72 h后挑取單菌落進行PCR檢測，陽性菌液加甘油(最終質(zhì)量分數(shù)25%)于-80 ℃保存。

1.2.3 農(nóng)桿菌侵染擬南芥及陽性植株篩選 將野生型擬南芥(Columbia生態(tài)型)種子放在鋪有潤濕濾紙的培養(yǎng)皿中，放入4 ℃冰箱中春化2 d后播種于營養(yǎng)缽中，基質(zhì)為市售育苗基質(zhì)。播種后覆蓋保鮮膜至15 d后揭去。苗期培養(yǎng)條件為：22 ℃下光照10 h/20 ℃下黑暗14 h。3～4周后培養(yǎng)條件調(diào)為：22 ℃下光照16 h/20 ℃下黑暗8 h，以促進擬南芥開花。待擬南芥大量開花時參考Zhang等[13]的方法將農(nóng)桿菌侵染擬南芥，步驟為：將含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌加入500 mL含卡那霉素(50 mg/L)和慶大霉素(50 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)16～24 h，待菌液在600 nm處吸光度(D600 nm)為1.5～2.0，于室溫下4 000g離心10 min，然后用500 mL新配制質(zhì)量分數(shù)為5%的蔗糖溶液重懸農(nóng)桿菌，加入100 μL的Silwet L-77表面活性劑(最終體積分數(shù)為0.02%)，立刻混勻。將擬南芥已開的花除去，然后倒轉(zhuǎn)營養(yǎng)缽，將擬南芥花序浸沒于農(nóng)桿菌懸浮液中10 s，在此過程中輕輕攪動。使用保鮮袋將浸過農(nóng)桿菌的擬南芥植株罩住，平放，在較低的光照條件下于22 ℃培養(yǎng)16～24 h后，揭去保鮮袋，放入培養(yǎng)室中正常培養(yǎng)。每隔6 d浸染1次，共浸染3次。1個月后收種子(即T0代種子)，并將T0代種子播種于含卡那霉素的MS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因陽性苗，同時分別以植株的DNA和cDNA為模板進行DNA-PCR和RT-PCR檢測陽性苗，PCR反應體系為：2×TaqPCR MasterMix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA/cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應條件為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，共30個循環(huán)。按照此方法篩選直到T2代，分析分離比，確定純合轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，選擇純合的T2代種子進行下一步試驗。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗?jié)B透脅迫能力 種子發(fā)芽率試驗：將轉(zhuǎn)基因T2代及野生型擬南芥種子播于含不同濃度NaCl(150，250 mmol/L)和甘露醇(150，300 mmol/L)的MS培養(yǎng)基上，以MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的種子為對照，春化2 d后放入光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為光照16 h，黑暗8 h，溫度22 ℃。10 d后統(tǒng)計不同滲透脅迫處理對種子相對發(fā)芽率的影響。以野生型為對照。發(fā)芽率統(tǒng)計參照陳吉寶等[14]的方法，即相對發(fā)芽率=處理發(fā)芽率/對照發(fā)芽率×100%。

苗期滲透脅迫試驗：將轉(zhuǎn)基因T2代和野生型擬南芥種子播于MS培養(yǎng)基上，6 d后轉(zhuǎn)移到含不同濃度脫落酸(25，50 μmol/L)、甘露醇(150，250 mmol/L)和NaCl(100，150 mmol/L)的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)6 d后統(tǒng)計根長，拍照。

苗期NaCl及干旱脅迫試驗：當營養(yǎng)缽中的轉(zhuǎn)基因及野生型擬南芥植株長至4片真葉時進行干旱和鹽脅迫處理，鹽脅迫處理每隔4 d澆300 mmol/L NaCl溶液1次，處理15 d后調(diào)查成活率；干旱脅迫處理采用自然干旱的方式進行，處理20 d后復水，2 d后統(tǒng)計成活率。每個株系每處理12株，重復3次。待植株出現(xiàn)蔫萎(干旱處理)和葉片發(fā)黃(鹽處理)時，按照陳吉寶等[14]的方法檢測各處理的脯氨酸含量。以正常培養(yǎng)的擬南芥為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜ClP5CS基因CDS序列的克隆

本試驗從西瓜幼葉cDNA中擴增出目的條帶Cla006553和Cla017928 CDS序列(圖2)，經(jīng)測序和拼接，Cla006553序列長2 166 bp，編碼721個氨基酸；Cla017928序列長2 145 bp，編碼714個氨基酸。二者核苷酸和氨基酸序列相似性分別為74.19%和77.12%。Cla006553及Cla017928 CDS序列與西瓜基因組數(shù)據(jù)庫中相對應的基因相似性分別為93.06%和96.64%。2個基因序列及氨基酸序列見圖3和圖4。

1.Cla006553的CDS序列；2.Cla017928的CDS序列；M.DNA Marker1.Coding sequence of Cla006553;2.Coding sequence of Cla017928;M.DNA Marker圖2 西瓜Cla006553和Cla017928 CDS序列的克隆Fig.2 Coding sequence of Cla006553 and Cla017928

圖3 西瓜Cla006553 CDS序列及推定的氨基酸序列Fig.3 Coding sequence of Cla006553 and its putative amino acids sequence

圖4 西瓜Cla017928 CDS序列及推定的氨基酸序列Fig.4 Coding sequence of Cla017928 and its putative amino acids sequence

將2個ClP5CS與擬南芥AtP5CS1(GenBank登錄號:AY150430.1)和AtP5CS2(GenBank登錄號:Y09355.1)進行比對分析，結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)各P5CS氨基酸序列長度相近，而且都包含ATP結(jié)合位點、亮氨酸拉鏈、谷氨酰激酶結(jié)構(gòu)域、NAD(P)H結(jié)合位點、亮氨酸結(jié)構(gòu)域、谷氨酸半醛脫氫酶結(jié)構(gòu)域等保守功能域。在2個ClP5CS的129位點上均為苯丙氨酸(圖5中箭頭處)，此位點是脯氨酸反饋抑制位點。

系統(tǒng)進化分析結(jié)果(圖6)發(fā)現(xiàn)，選定物種的P5CS可以依據(jù)單子葉植物和雙子葉植物分為兩類，其中Cla006553與甜瓜CmP5CS關系較近，而Cla017928與黃瓜CsP5CS的關系較近。

2.2 轉(zhuǎn)西瓜ClP5CS基因擬南芥陽性植株的篩選

以純合的T2代種子供下一步試驗,共獲得23A株系2個(23A-1、23A-2)，轉(zhuǎn)Cla006553和Cla017928的株系分別為4個(圖7),即Cla006553-1～Cla006553-4和Cla017928-1～Cla017928-4。

黑色區(qū)域示完全相同的氨基酸殘基，灰色區(qū)域示相似度在50%以上的氨基酸殘基The black region represents the exactly same amino acid residues and the gray region represents more than 50% similarity圖5 西瓜ClP5CS與擬南芥AtP5CS的氨基酸序列比對Fig.5 Comparison of ClP5CSs with AtP5CS

圖6 不同植物P5CS的系統(tǒng)進化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of P5CS from different plants

A.DNA-PCR；B.RT-PCR。1～2.23A轉(zhuǎn)基因株系；3～6.轉(zhuǎn)Cla006553基因株系Cla006553-1、-2、-3、-4；7～10.轉(zhuǎn)Cla017928基因株系Cla17928-1、-2、-3、-4；11.野生型擬南芥DNA(A圖)和cDNA(B圖)；12.空白對照；M.DNA MarkerA.DNA-PCR；B.RT-PCR.1-2.23A transgenic lines;3-6.Cla006553 transgenic lines Cla006553-1,-2,-3,-4;7-10.Cla017928 transgenic lines Cla017928-1,-2,-3,-4;11.DNA (Fig.A) and cDNA (Fig.B) of wild type Arabidopsis plants;12.Black control;M.DNA Marker

2.3 滲透脅迫下轉(zhuǎn)西瓜ClP5CS基因擬南芥的發(fā)芽率檢測

選取23A-1株系及2個Cla006553和Cla017928轉(zhuǎn)基因株系(Cla006553-1，Cla006553-3，Cla017928-1，Cla017928-2)為研究材料，將其T2代及野生型擬南芥種子播于含NaCl和甘露醇的MS培養(yǎng)基上，研究轉(zhuǎn)基因株系在滲透脅迫下的發(fā)芽率。結(jié)果表明，在250 mmol/L NaCl和300 mmol/L甘露醇上，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均未發(fā)芽。在150 mmol/L NaCl和150 mmol/L甘露醇上，轉(zhuǎn)Cla006553及Cla017928基因擬南芥的發(fā)芽率均顯著高于野生型和23A-1植株，其中Cla017928-1株系在150 mmol/L甘露醇和Cla006553-3株系在150 mmol/L NaCl處理下，發(fā)芽率顯著高于其他株系(圖8)。

1～6分別代表野生型、23A-1、Cla006553-1、Cla006553-3、Cla017928-1及Cla017928-2擬南芥株系；圖柱上標不同小寫字母表示同一處理不同株系間差異顯著(P<0.05)。下圖同1-6 indicate wild type,23A-1,Cla006553-1,Cla006553-3,Cla017928-1,and Cla017928-2 Arabidopsis,respectively；Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05).The same below

2.4 轉(zhuǎn)西瓜ClP5CS基因擬南芥幼苗的抗?jié)B透性鑒定

將T2代及野生型擬南芥種子播于MS培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因植株和野生型擬南芥均能正常生長。在含不同濃度脫落酸、甘露醇和NaCl的MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因植株和野生型擬南芥的生長都受到了不同程度的抑制，抑制程度隨濃度的增大而加劇。

對擬南芥植株的主根長度進行測量，結(jié)果(圖9)發(fā)現(xiàn)，在各脅迫條件下，轉(zhuǎn)ClP5CS基因擬南芥株系的根長均顯著優(yōu)于32A-1和野生型株系。在50 μmol/L脫落酸和250 mmol/L甘露醇處理下，Cla006553-1、Cla006553-3株系與Cla017928-1、Cla017928-2株系之間根長差異不明顯；在150 mmol/L NaCl處理中，Cla006553-1與Cla006553-3株系根長差異顯著。

圖9 苗期滲透脅迫對野生型及轉(zhuǎn)西瓜ClP5CS基因擬南芥根生長的影響Fig.9 Effects of various stresses on root length of WT and ClP5CS transgenic Arabidopsis

2.5 轉(zhuǎn)西瓜ClP5CS基因擬南芥株系的耐鹽耐旱能力檢測

干旱處理和鹽處理7 d后，擬南芥植株出現(xiàn)了蔫萎及發(fā)黃的現(xiàn)象。由圖10可以看出，在CK中，轉(zhuǎn)ClP5CS基因株系脯氨酸含量顯著高于野生型及23A-1株系(P<0.05),其中含量最高的Cla017928-1株系分別是野生型和23A-1植株的2.6和2.9倍，并顯著高于轉(zhuǎn)Cla006553的2個株系(P<0.05)，另外Cla006553-3、Cla017928-1和Cla017928-2株系的脯氨酸含量均顯著高于Cla006553-1株系。鹽處理7 d后，轉(zhuǎn)ClP5CS基因株系的脯氨酸含量高于野生型及23A-1株系，但各株系差異并不顯著，同樣的情況也發(fā)生在干旱處理中，這可能與P5CS的反饋抑制有關。

干旱處理20 d，參試的擬南芥植株均出現(xiàn)了嚴重蔫萎(圖1)，復水2 d后，Cla006553-1、Cla006553-3、Cla017928-1、Cla017928-2、23A-1及野生型植株的存活率分別為54%，47%，39%，42%，23%和15%。300 mmol/L NaCl處理15 d的擬南芥生長明顯被抑制，野生型和23A-1植株出現(xiàn)死亡(圖12)，Cla006553-1、Cla006553-3、Cla017928-1、Cla017928-2、23A-1及野生型的平均存活率分別為71%，83%，87%，85%，21%和18%。

圖10 野生型及轉(zhuǎn)西瓜ClP5CS基因擬南芥植株體內(nèi)脯氨酸的積累情況Fig.10 Accumulation of proline in WT and ClP5CS transgenic plants

圖11 干旱脅迫下轉(zhuǎn)西瓜ClP5CS基因擬南芥苗的生長情況Fig.11 Growth of ClP5CS transgenic and wild type Arabidopsis seedlings under drought stress

圖12 300 mmol/L NaCl脅迫處理轉(zhuǎn)西瓜ClP5CS基因擬南芥的生長情況Fig.12 Growth of ClP5CS transgenic and wild type Arabidopsis thaliana seedlings under 300 mmol/L NaCl stress

3 討 論

脯氨酸作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、蛋白穩(wěn)定劑和自由基清除劑，在植物抗逆中具有重要的作用[15]。P5CS是植物體內(nèi)脯氨酸生物合成的關鍵酶，也是植物在遭受脅迫時脯氨酸合成的限速酶[16]。許多植物中有2個基因編碼P5CS蛋白，如擬南芥[5]、水稻[6]等。P5CS酶是雙功能酶，具有谷氨酰-γ-半醛脫氨酶和谷氨酸激酶活性，故其既能催化谷氨酸磷酸化為谷氨酸半醛，又能催化谷氨酸半醛還原[17]。本研究在西瓜自交系材料M08中，也克隆到了2個P5CS基因，即Cla006553和Cla017928，其核酸序列長度分別為2 166和2 145 bp，編碼721和714個氨基酸。經(jīng)保守結(jié)構(gòu)域分析，這2個酶中都包含ATP結(jié)合位點、亮氨酸拉鏈、谷氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、NAD(P)H結(jié)合位點、亮氨酸結(jié)構(gòu)域、谷氨酸半醛脫氫酶結(jié)構(gòu)域，故西瓜P5CS酶可能也是雙功能酶。西瓜的2個P5CS基因核酸序列及其氨基酸序列的相似性分別為74.19%和77.12%，除亮氨酸結(jié)構(gòu)域差別較大外，其他保守結(jié)構(gòu)域基本一致，由于亮氨酸結(jié)構(gòu)域具有維持蛋白四級結(jié)構(gòu)的功能，故推測Cla006553和Cla017928基因的空間結(jié)構(gòu)可能有較大差異。

為了了解Cla006553和Cla017928基因的抗旱抗鹽脅迫功能，本研究采用35S啟動子驅(qū)動這2個基因，通過卡那霉素篩選及PCR驗證，得到這2基因過表達擬南芥轉(zhuǎn)基因后代，并取Cla006553-1、Cla006553-3、Cla017928-1和Cla017928-2株系進行后續(xù)試驗。發(fā)芽試驗及苗期滲透脅迫試驗結(jié)果表明，Cla006553和Cla017928均能顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)芽率，緩解滲透脅迫對根生長的抑制作用。在正常生長的Cla006553和Cla017928轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中，其脯氨酸含量顯著高于野生型及對照23A-1，說明轉(zhuǎn)ClP5CS植株能引起脯氨酸的積累。在轉(zhuǎn)ClP5CS基因擬南芥株系中，Cla017928-1株系脯氨酸含量顯著高于Cla006553-1及Cla006553-3，而Cla006553-3株系含量顯著高于Cla006553-1，同樣的現(xiàn)象也發(fā)生在轉(zhuǎn)AtP5CS和OsP5CS的矮牽?；ㄖ晗瞪蟍9]，這可能與ClP5CS蛋白的空間結(jié)構(gòu)及其基因在擬南芥染色體上的位置和拷貝數(shù)不同有關。轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥經(jīng)300 mmol/L NaCl和干旱處理7 d后，脯氨酸含量均保持較高水平，其中轉(zhuǎn)ClP5CS基因植株葉片中脯氨酸含量略高，但差異不顯著。在脯氨酸積累過程中，由于P5CS的反饋抑制作用，導致P5CS酶活性降低，這可能是后期脯氨酸含量差異不大的原因。轉(zhuǎn)ClP5CS基因植株的耐鹽耐旱性較強的原因可能是由于其脯氨酸基礎含量高，在脅迫前期就能對細胞就起到保護作用，故幼苗根的生長及苗的成活率教好。Zhang等[18]將豇豆VaP5CS酶的129位苯丙氨酸突變?yōu)楸彼?VaP5CSF129A)后，其在大腸桿菌中的活性是野生型的200多倍。轉(zhuǎn)VaP5CSF129A的煙草植株可耐200 mmol/L NaCl脅迫，其脯氨酸含量是對照的11～19倍[19]。同樣，轉(zhuǎn)VaP5CSF129A的蒙農(nóng)雜種冰草植株用質(zhì)量分數(shù)1.5% 的NaCl溶液脅迫后，植株中的脯氨酸含量逐漸增加，14 d后轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量超過2 000 μg/g[20]。但過量的脯氨酸對植物生長有負面的影響，如外源施用過量的脯氨酸(40～50 mmol/L)能抑制水稻的生長[21]。另外，將擬南芥中編碼PDH(脯氨酸降解反應第一步所涉及的酶)的基因插入突變后，突變植株對脯氨酸非常敏感，在含10 mmol/L脯氨酸的培養(yǎng)基上不能生長，而野生型植株卻能正常生長[22]。