等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物超濾組分免疫調(diào)節(jié)作用

丁霈希，章超樺,2,3,4,5，高加龍,2,3,4,5，秦小明,2,3,4,5，曹文紅,2,3,4,5，鄭惠娜,2,3,4,5，林海生,2,3,4,5

等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物超濾組分免疫調(diào)節(jié)作用

丁霈希1，章超樺1,2,3,4,5，高加龍1,2,3,4,5，秦小明1,2,3,4,5，曹文紅1,2,3,4,5，鄭惠娜1,2,3,4,5，林海生1,2,3,4,5

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034；3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室//4.廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室//5.國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東 湛江 524088）

【】探討等邊淺蛤（）肉的基本營養(yǎng)成分、蛋白質(zhì)氨基酸組成及中性蛋白酶酶解產(chǎn)物超濾組分的免疫活性。采用中性蛋白酶酶解等邊淺蛤肉，利用3 ku超濾膜對等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾分離，通過細(xì)胞實驗和動物實驗評價小于3 ku和大于3 ku兩個超濾組分的免疫調(diào)節(jié)作用。等邊淺蛤肉具高蛋白低脂肪特點，其氨基酸種類和含量豐富。細(xì)胞實驗表明，＜3 ku組分的細(xì)胞相對增殖率及吞噬中性紅能力均顯著高于陽性對照組（＜0.05），其中質(zhì)量濃度為250 μg/mL時細(xì)胞相對增殖率高達(dá)126.22%；動物實驗表明，與空白對照組相比，＜3 ku組分能夠極顯著提高遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）程度、半數(shù)溶血值（HC50）、抗體生成細(xì)胞數(shù)、吞噬指數(shù)及NK細(xì)胞活性（＜0.01）。細(xì)胞實驗和動物實驗均表明＜3 ku組分的免疫調(diào)節(jié)作用優(yōu)于＞3 ku組分。等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物的＜3 ku超濾組分具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

等邊淺蛤；酶解產(chǎn)物；超濾組分；免疫調(diào)節(jié)作用

《中國衛(wèi)生健康統(tǒng)計年鑒2018》統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2017年心腦血管病、癌癥和慢性呼吸系統(tǒng)疾病等慢性疾病是我國城鄉(xiāng)居民主要致死病因，占比超過80%[1]。因此，越來越多人關(guān)注如何提高人群機(jī)體免疫力。食源性免疫活性肽無毒、低敏、安全性高且可以調(diào)節(jié)人和動物機(jī)體免疫能力，在人類營養(yǎng)健康和疾病調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不可替代的作用[2]。而海洋類動物由于生長環(huán)境特殊，因此體內(nèi)氨基酸結(jié)構(gòu)與陸地動物不同，其分離出活性肽帶正電荷與顯負(fù)電性的細(xì)胞因子受體大量結(jié)合，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[3]。海洋貝類中馬氏珠母貝（）[4]、青蛤（）[5-6]、波紋巴非蛤()[7]、文蛤（）[8-10]、牡蠣（）[11-13]、扇貝（）[14]、貽貝（）[15]等均被證明存在免疫活性肽。

等邊淺蛤（）隸屬瓣鰓綱（Lamellibranchia），異齒亞綱（Heterodonta），簾蛤目（Veneroida），簾蛤科（Veneridae），淺蛤?qū)伲ǎ瑒e名“沙蛤”[16]，屬于廣溫廣鹽性種類，在我國南北海岸均分布，是一種棲息于潮間帶中、下潮區(qū)泥砂質(zhì)底營底棲生活的經(jīng)濟(jì)貝類[17]。等邊淺蛤一般以帶殼鮮銷為主，少數(shù)加工為罐頭制品和干制品。近年來等邊淺蛤蝦塘和灘涂養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大[18]，為提高其產(chǎn)品附加值，本研究對等邊淺蛤的基本營養(yǎng)成分和氨基酸組成進(jìn)行分析，并對等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物超濾組分的免疫活性進(jìn)行評價，以期為等邊淺蛤肉高值化開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 等邊淺蛤（），殼長（3.8 ± 0.2）cm，購自汕尾，開殼取肉后-40 ℃貯藏備用。

1.1.2 試劑 中性蛋白酶（3.2 × 104U/g），購自廣西龐博生物科技有限公司；中性紅，購自天津市天新精細(xì)化工有限公司；脂多糖（LPS）、噻唑藍(lán)(MTT)，購自美國Sigma公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、胎牛血清、1640無血清培養(yǎng)基(RPMI-1640)、青/鏈霉素雙抗、dulbecco's modified eagle medium培養(yǎng)基（DMEM），購自美國Gibco公司；20%綿羊紅細(xì)胞，購自蕊特生物技術(shù)有限公司；印度墨汁、乳酸脫氫酶（LDH）、水楊酸緩沖液（SA緩沖液）、碘硝基氯化四氮唑藍(lán)(INT)、乳酸鋰，購自上海源葉生物有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，購自北京索萊寶科技有限責(zé)任公司；聚乙二醇辛基苯基醚(TRITONX-100)，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；都氏試劑，購自雨朵生物技術(shù)有限公司；吩嗪硫酸甲酯 (PMS)，美侖生物技術(shù)有限公司；豚鼠血清，購自鴻泉生物技術(shù)有限公司公司；紅細(xì)胞裂解液，購自白鯊易生物有限公司；鹽酸左旋咪唑片，購自南國藥業(yè)有限公司；其余試劑，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 細(xì)胞 RAW264.7巨噬細(xì)胞、小鼠淋巴瘤細(xì)胞（YAC-1）購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.4 動物 SPF級昆明種雄性小鼠，4周齡，體質(zhì)量（20 ± 2）g，合格證號SCXKL（魯）20140007，購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁殖有限公司；飼養(yǎng)于廣東海洋大學(xué)SPF級動物房，許可證號SYXK（粵）2019-0204。

1.2 儀器與設(shè)備

VULCAN 3-550 PD馬福爐，美國Vulcan公司；VAPODEST450全自動凱氏定氮儀，德國Gerhardt公司；WTM-CM-01陶瓷膜分離設(shè)備（杭州沃騰膜有限公司）；FA2104A電子分析天平（上海天平儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀Ｒ-1005 （鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；HHT4-LX-C50L型立式壓力蒸汽滅菌器（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）；CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州凈化有限公司）；Forma370型CO2恒溫箱、Multiskan FC型酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國）；TDL-5-A低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 等邊淺蛤肉基本成分分析 水分測定：常壓干燥法(GB/T5009.3－2016)；粗蛋白、非蛋白氮測定：凱氏定氮法(GB/T5009.5－2016)；灰分測定：高溫灼燒法( GB/T5009.4－2016)；粗脂肪測定：索氏提取法( GB/T5009.6－2016)；總糖含量測定：苯酚硫酸法。

1.3.2 等邊淺蛤肉氨基酸組成分析 等邊淺蛤肉水解后用氨基酸自動分析儀測定除色氨酸（Trp）、半胱氨酸（Cys）以外的16種氨基酸[19]。

1.3.3 等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物超濾組分的制備 凍藏等邊淺蛤肉解凍后加適量水用組織攪碎機(jī)勻漿，勻漿液中加水調(diào)最終料水比為1∶3（g/mL），加入原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的中性蛋白酶，50 ℃下酶解3 h后沸水浴滅酶15 min，酶解液于8 000 r/min離心20 min（4 ℃），收集上清。利用200 μm無機(jī)陶瓷膜微濾裝置過濾除去大分子物質(zhì)、膠體顆粒及雜質(zhì)后選擇3 ku超濾膜對其進(jìn)行分級處理。

1.3.4 細(xì)胞實驗

1.3.4.1 MTT法檢測細(xì)胞活性 RAW264.7巨噬細(xì)胞濃度調(diào)整為1 × 105個/mL后接種到96孔板，100 μL/孔。培養(yǎng)16 h后加藥，設(shè)空白對照組，陽性對照組 (20 μg/mL LPS) 和加藥組A、B、C、D、E（濃度為4倍梯度稀釋，從小到大依次為50、100、250、500、1 000 μg/mL），每個組設(shè)6個平行孔。24 h后每孔加20 μL 5%MTT溶液，孵育4 h后去除上清，加入200 μL的DMSO，充分震蕩10 min，于酶標(biāo)儀490 nm處檢測吸光值，計算相對增殖率。

1.3.4.2 中性紅法檢測細(xì)胞吞噬能力 RAW264.7巨噬細(xì)胞濃度調(diào)整為5 × 105個/mL后接種到96孔板，100 μL/孔。培養(yǎng)16 h后加藥，24 h后每孔加20 μL 10%中性紅溶液，孵育2 h后去除上清，PBS洗板后加入200 μL的裂解液，充分震蕩10 min，于酶標(biāo)儀540 nm處檢測吸光值。

1.3.5 動物實驗

1.3.5.1 分組、給藥 經(jīng)過7 d適應(yīng)期后，330只昆明小鼠隨機(jī)分11組，每組30只（包括A、B組）每天定時灌胃，每周稱質(zhì)量，連續(xù)30 d。分為空白組（蒸餾水）、陽性組（左旋咪唑40 mg·kg-1·d-1）、酶解產(chǎn)物低（40 mg·kg-1·d-1）中（80 mg·kg-1·d-1）高（160 mg·kg-1·d-1）劑量組、＞3 ku低（40 mg·kg-1·d-1）中（80 mg·kg-1·d-1）高（160 mg·kg-1·d-1）劑量組、＜3 ku低（40 mg·kg-1·d-1）中（80 mg·kg-1·d-1）高（160 mg·kg-1·d-1）劑量組。

1.3.5.2 碳廓清指數(shù)法檢測吞噬指數(shù) 按體質(zhì)量從小鼠尾靜脈注入稀釋4倍的印度墨汁（100 mL/kg）后立即計時。注入墨汁后2、10 min，分別從小鼠的內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并立即加入0.1% Na2CO3溶液2 mL，在600 nm處檢測吸光值，以Na2CO3做空白對照。將老鼠處死后，取肝臟和脾臟，分別稱質(zhì)量。

= (lg1-lg2) ÷ (2-1)， （1）

其中，1表示第1次取血測的吸光度；2表示第2次取血測得的吸光度，1表示注入墨汁后第1次從內(nèi)眥靜脈叢取血的時間；2表示注入墨汁后第2次從內(nèi)眥靜脈叢取血的時間。表示吞噬指數(shù)，身體表示體質(zhì)量，肝表示肝質(zhì)量，脾表示脾質(zhì)量。

1.3.5.3 乳酸脫氫酶法（LDH）檢測自然殺傷（NK）細(xì)胞活性 脾細(xì)胞懸液制備方法：無菌處死小鼠后取脾臟置盛有Hank’s液的平皿中，用注射器活塞研磨，使單個細(xì)胞游離出來；1 000×離心10 min，棄上清液，用Hank’s液洗滌后將細(xì)胞懸浮于RPMI1640完全培養(yǎng)液，臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在95%以上），調(diào)整細(xì)胞濃度為2 × 107個/mL。制備細(xì)胞濃度為2 × 107個/mL脾細(xì)胞懸液（效應(yīng)細(xì)胞）和細(xì)胞濃度為4 × 105個/mL YAC-1細(xì)胞懸液（靶細(xì)胞）。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL（效靶比50∶1），加入96孔板中，細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞及培養(yǎng)液各100 μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1% NP40各100 μL；上述各項均設(shè)3個平行孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后將96孔板1 500 r/min離心5 min，每孔取上清100 μL于96孔板中，同時加入LDH基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)3 ~ 10 min，加入1 mol/L HCl 30 μL，在490 nm處檢測吸光值。

NK細(xì)胞活性=(反應(yīng)孔-自然釋放孔)÷

(最大釋放孔-自然釋放孔)。（3）

1.3.5.4 半數(shù)溶血值（HC50）法檢測血清中溶血素 取用SA緩沖液200倍稀釋的血清1 mL，依次加入體積分?jǐn)?shù)為10% SRBC 0.5 mL，和用SA緩沖液稀釋9倍的補(bǔ)體1 mL。另設(shè)不加血清的對照管。置37 ℃恒溫水浴鍋中水浴15 ~ 30min后，冰浴終止反應(yīng)。2 000 r/min 離心10 min后取上清1 mL，加都氏試劑3.75 mL，體積分?jǐn)?shù)為10% SRBC 0.25 mL。充分混勻后，放置10 min，于540 nm處檢測吸光值。

1.3.5.5 抗體生成細(xì)胞測定 小鼠采血后，迅速摘取脾臟，用生理鹽水沖洗干凈，處理并配制成4 × 106個/mL濃度的脾細(xì)胞懸液。在離心管中依次加入0.5 mL的體積分?jǐn)?shù)為2% SRBC細(xì)胞懸液和10%補(bǔ)體，另設(shè)不加補(bǔ)體的空白對照管，置于37 ℃水浴中溫育1 h，3 000×離心10 min，取上清液于413 nm 處檢測吸光值。

1.3.5.6 足趾增厚法檢測遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH） 使用體積分?jǐn)?shù)為2% SRBC腹腔注射免疫四天后測量左后足趾厚度，然后再測量部位皮下注射體積分?jǐn)?shù)為20% SRBC，注射24 h后測量左后足趾厚度，同一部位測量3次，取平均值。以攻擊前后足趾的厚度差表示DTH的程度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 等邊淺蛤肉基本營養(yǎng)成分及蛋白質(zhì)氨基酸組成分析

等邊淺蛤肉基本營養(yǎng)成分含量（干基）如表1所示，其粗蛋白占53.80%，略高于文蛤（51.53%）和近江牡蠣（50.63%）；粗脂肪含量占1.88%，明顯低于文蛤（6.78%）與近江牡蠣（6.95%）[20-21]?？梢?，等邊淺蛤是一種高蛋白低脂肪的水產(chǎn)品。

表1 等邊淺蛤肉基本營養(yǎng)成分分析（干基）

注：試驗數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)表示。

Note: the test data are expressed as Mean standard deviation (Mean ± SD).

由表2可知，等邊淺蛤檢測的16種氨基酸中谷氨酸含量最高，天冬氨酸次之，精氨酸、亮氨酸、甘氨酸、賴氨酸和丙氨酸含量也比較高，其中人體必需氨基酸含量較高，占總氨基酸比例為35.17%。谷氨酸和天冬氨酸不僅是鮮味氨基酸，還是腦營養(yǎng)劑，是人類消耗最大的氨基酸，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞興奮，對大腦功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正?；顒泳哂兄匾饬x[22]。有研究表明，補(bǔ)充外源性谷氨酰胺能有效預(yù)防運動導(dǎo)致的免疫抑制[23]。精氨酸能夠保護(hù)胸腺、提高巨噬細(xì)胞的活性和對腫瘤細(xì)胞的殺傷功能、刺激機(jī)體IL-2升高和抑制腫瘤細(xì)胞的生長[24]。

表2 等邊淺蛤蛋白質(zhì)的氨基酸組成

注：*為必需氨基酸。表中疏水性氨基酸含量是指 Phe、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Gly 7種氨基酸總和占氨基酸總量的值；堿性氨基酸含量是指His、Arg、Lys 3種氨基酸總和占氨基酸總量的值;支鏈氨基酸含量是指 Val、Leu、Ile 3種氨基酸總和占氨基酸總量的值。

Note: essential amino acid marked with *. The hydrophobic amino acid content in the table refers to the total amino acid content of Phe, Val, Leu, Ile, Pro, Ala and Gly. Basic amino acid content refers to the total amino acid value of His, Arg and Lys. Branched chain amino acid content refers to the total amino acid content of Val, Leu and Ile.

2.2 等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物超濾組分的體外免疫活性評價

2.2.1 對小鼠RAW264.7細(xì)胞增殖能力的影響 巨噬細(xì)胞是體內(nèi)主要抗原遞呈細(xì)胞，在機(jī)體中不僅執(zhí)行非特異性免疫應(yīng)答的效應(yīng)功能，而且通過遞呈抗原啟動特異性免疫應(yīng)答[25]。因此，本實驗采用RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞模擬體內(nèi)巨噬細(xì)胞參與免疫調(diào)節(jié)過程。如圖1所示，在質(zhì)量濃度為50 ~ 1 000 μg/mL的范圍內(nèi)等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物的＞3 ku和＜3 ku這兩個超濾組分對RAW264.7細(xì)胞增殖作用，均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，且均在質(zhì)量濃度為250 μg/mL時具有最大值，其中＜3 ku超濾組分的相對增殖率為126.22%（＜0.05）。與LPS陽性對照組相比，＞3 ku超濾組分僅在質(zhì)量濃度為250 μg/mL時，對RAW264.7細(xì)胞的增殖作用更顯著（＜0.05）。而＜3 ku超濾組分在質(zhì)量濃度為50、100、250及500 μg/mL時均顯著高于＞3 ku超濾組分及LPS陽性對照組。說明等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物的＞3 ku超濾組分各質(zhì)量濃度對RAW264.7細(xì)胞無毒性，且能不同程度地促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖作用。根據(jù)研究表明[26]綠豆肽可促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖。與綠豆肽比較，等邊淺蛤酶解產(chǎn)物超濾組分對于增強(qiáng)RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖作用有較好效果。

凡含一個相同字母者表示差異不顯著（P > 0.05）

2.2.2 對小鼠RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響 活化巨噬細(xì)胞最顯著的特征之一是吞噬作用激增，這是巨噬細(xì)胞對病原體和癌細(xì)胞反應(yīng)的第一步，也是至關(guān)重要的一步[27]。如圖2所示，隨著質(zhì)量濃度增加，兩個超濾組分對RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅能力均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在質(zhì)量濃度為250 μg/mL時達(dá)到最大值，且＜3 ku超濾組分效果最好。在質(zhì)量濃度為100、250及500 μg/mL時，＜3 ku超濾組分的吸光值均顯著高于＞3 ku超濾組分（＜0.05）。與陽性對照組相比，＞3 ku超濾組分在質(zhì)量濃度為250 μg/mL時與LPS對照組無顯著性差異，其余情況均低于陽性對照組。＜3 ku組分在質(zhì)量濃度為250 μg/mL時對RAW264.7細(xì)胞的吞噬作用均顯著高于LPS陽性組（＜0.05），且在質(zhì)量濃度為100及500 μg/mL時，與LPS陽性對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（＞0.05）。與韋懿芳等[28]實驗結(jié)果相比，等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物的超濾組分促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞吞噬抗原的能力更好，說明＜3 ku超濾組分能有效促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞吞噬抗原。研究人員發(fā)現(xiàn)，文蛤[8]、牡蠣[12]、青蛤[29]中存在小分子肽能促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬活性。有文獻(xiàn)報道[30]巨噬細(xì)胞的非炎性吞噬作用受到抗炎細(xì)胞因子的調(diào)控。因此，＜3 ku超濾組分可能是通過抗炎因子對巨噬細(xì)胞的吞噬作用進(jìn)行調(diào)控。

凡含一個相同字母者表示差異不顯著（P > 0.05）

2.3 等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物超濾組分體內(nèi)免疫活性評價

2.3.1 對小鼠碳廓清實驗及NK細(xì)胞活性的影響 巨噬細(xì)胞是一類非特異性免疫細(xì)胞，活化后可通過對異物的吞噬、向機(jī)體免疫系統(tǒng)提呈抗原以及釋放炎性細(xì)胞因子，清除病原微生物與衰老細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，誘發(fā)特異性免疫反應(yīng)，在非特異免疫中起重要作用，因此可以通過單核吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)及NK細(xì)胞活性指標(biāo)來評價等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物超濾組分對小鼠非特異性免疫的影響[31]。如圖3A所示，與空白組相比，陽性組、酶解產(chǎn)物及兩超濾組分的高、中、低劑量組的吞噬指數(shù)均顯著高于空白組（＜0.05），且＜3 ku超濾組分的高劑量組吞噬指數(shù)最大，說明＜3 ku超濾組分能有效提高體內(nèi)碳顆粒被清除的速率，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。NK細(xì)胞活性實驗中，如圖3B所示，與空白組相比，陽性組、酶解產(chǎn)物及兩超濾組分的高中低劑量組均顯著高于空白組（＜0.05），且＜3 ku超濾組分中劑量組的NK細(xì)胞活性最大，說明＜3 ku超濾組分能有效提高NK細(xì)胞的活性。因此，酶解產(chǎn)物及兩個超濾組分都能提高小鼠機(jī)體非特異性免疫功能，但＜3 ku超濾組分效果最明顯。NK細(xì)胞的功能是由NK細(xì)胞自身以及其他細(xì)胞如T細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞共同產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子介導(dǎo)和調(diào)節(jié)的。IL-2和IFN-γ是介導(dǎo)NK活性最重要的細(xì)胞因子[32]。因此，等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物超濾組分可能是通過調(diào)控NK細(xì)胞本身和單核吞噬細(xì)胞等分泌IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子來提高NK細(xì)胞的免疫能力。

凡含一個相同字母者表示差異不顯著（> 0.05）

The data with a same letter mean no significant difference at 0.05 level

圖3 不同組分對單核吞噬細(xì)胞吞噬指數(shù)（A）和NK細(xì)胞活性（B）的影響

Fig. 3 Effects of different components on the phagocytosis index of mononuclear phagocytes(A) and NK cell activity(B)

2.3.2 對血清溶血素含量及抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響 體液免疫是通過 B 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)產(chǎn)生抗體來達(dá)到保護(hù)目的的免疫機(jī)制。SRBC免疫小鼠后，B淋巴細(xì)胞分泌溶血素，血清中溶血素的含量和抗體生產(chǎn)細(xì)胞數(shù)量可用于評估體液免疫功能的狀態(tài)[33]。一般用半數(shù)溶血值來表示血清溶血素的含量，如圖4A所示，與空白組相比，陽性組、酶解產(chǎn)物及兩個超濾組分的高、中、低劑量組均顯著高于空白組（＜0.05），且＜3 ku組分的中、高劑量組半數(shù)溶血值最大，說明＜3 ku組分的中、高劑量組能夠有效促進(jìn)漿細(xì)胞分泌抗體?？贵w生成細(xì)胞的數(shù)量通過定量溶血分光光度計法檢測，如圖4B所示，與空白組相比，陽性組、酶解產(chǎn)物及兩超濾組分的高、中、低劑量組均顯著高于空白組（＜0.05），其中＜3 ku超濾組分低、中劑量組的抗體生成細(xì)胞最多，說明該組份能有效促進(jìn)小鼠機(jī)體的B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞。因此，酶解產(chǎn)物及兩超濾組分都能提高小鼠機(jī)體特異性免疫中的體液免疫功能，但＜3 ku超濾組分效果最明顯。

凡含一個相同字母者表示差異不顯著（> 0.05）

The data with a same letter mean no significant difference at 0.05 level

圖4 不同組分對抗體生產(chǎn)細(xì)胞數(shù)量的影響（A）和不同組分對血清溶血素的影響（B）

Fig. 4 Effect of different components on the number of cells producing antibodies(A) and serum hemolysin(B)

2.3.3 對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響 檢測遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度（DTH）可以評估小鼠機(jī)體特異性免疫中的細(xì)胞免疫的影響，DTH一般用被攻擊部位的腫脹程度來表示[34]。如圖5所示，與空白組相比，陽性組、酶解產(chǎn)物及兩個超濾組分的高中低劑量組的足趾厚度差值均顯著高于空白組（＜0.05），且＜3 ku超濾組分的高中低劑量組足趾厚度差值最大，無顯著性差異。說明＜3ku超濾組分可有效促進(jìn)小鼠機(jī)體T細(xì)胞分化為效應(yīng)T細(xì)胞。李婉等[12]在對牡蠣免疫活性成分研究中發(fā)現(xiàn)，牡蠣的酶解產(chǎn)物超濾組分能夠增強(qiáng)正常小鼠的DTH，有效增強(qiáng)由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)。而Yu等[6]對青蛤中的多肽對免疫缺陷小鼠的免疫增強(qiáng)作用研究中發(fā)現(xiàn)，SCSP可增強(qiáng)免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫功能，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的異常分布并改善免疫受損小鼠的細(xì)胞免疫狀態(tài)。因此，等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物及兩個超濾組分能提高小鼠機(jī)體特異性免疫中的細(xì)胞免疫功能，尤其＜3 ku超濾組分效果較明顯。

凡含一個相同字母者表示差異不顯著（P > 0.05）

3 結(jié)論

等邊淺蛤具有高蛋白低脂肪的特點，其氨基酸種類和含量豐富，且谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸等與免疫功能有關(guān)的氨基酸含量豐富。細(xì)胞實驗表明，等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物＜3 ku超濾組分具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞增殖和吞噬作用，有增強(qiáng)非特異性免疫反應(yīng)的潛力。動物實驗表明，等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物＜3 ku超濾組分能增強(qiáng)肝單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用，促進(jìn)NK細(xì)胞活性、抗體生成、抗體產(chǎn)生細(xì)胞生成和遲發(fā)型超敏反應(yīng)，有增強(qiáng)特異性免疫反應(yīng)的潛力。因此等邊淺蛤酶解產(chǎn)物的＜3 ku超濾組分具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。

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Immunomodulatory effects of the ultrafiltration fractions of enzymatic hydrolysates from the edible part of

DING Pei-xi1, ZHANG Chao-hua1,2,3,4,5, GAO Jia-long1,2,3,4,5, QIN Xiao-ming1,2,3,4,5,CAO Wen-hong1,2,3,4,5, ZHENG Hui-na1,2,3,4,5, LIN Hai-sheng1,2,3,4,5

（1.,,524088,；2.,116034,；3.//4.,524088,//5.,524088,）

This study investigated the essential nutrients, amino acid composition of protein and the immunoactivity of the ultrafiltrated enzymatic hydrolysis products ofmeat.A 3 ku ultrafiltration membrane was used to separate the neutral protease hydrolyzate of the，and then cell and in vivo experiments were conducted to test the immunomodulatory effects of ultrafiltration components.meat has high contents of protein and low fat level. Its amino acid species and content are rich. Result of cell experiments showed that the relative proliferation rate and the ability to devour neutral red of ultrafiltration component with MW <3 ku were higher than those of the positive control group (＜0.05). When the mass concentration is 250 μg/mL the relative proliferation rate was as high as 126.2%. In vivo data showed that the degree of delayed allergic reaction (DTH), hemolytic value (HC50), the number of antibody-producing cells, phagocytic index and NK cell activity were higher than these of controls (<0.01). Both cell culture and in vivo results showed that the immunomodulatory effect of the ultrafiltration component with molecular weight <3 ku was better than that of >3 ku.The <3 ku hydrolyzate fraction from the ofhas immunomodulatory effects.

; Enzymatic hydrolysate; Ultrafiltration fractions; Immunomodulatory effects

TS254.1

A

1673-9159（2020）03-0114-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.015

2019-12-31

廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新強(qiáng)校工程重大科研成果培育計劃（GDOU2017052606）；國家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-49）；廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品高值化加工與利用創(chuàng)新團(tuán)隊項目（GDOU2016030503）

丁霈希（1994－），女，碩士研究生，主要研究方向為水產(chǎn)品高值化利用。E-mail：18320274250@163.com

章超樺，教授。E-mail：zhangch2@139.com

丁霈希，章超樺，高加龍，等. 等邊淺蛤肉酶解產(chǎn)物超濾組分免疫調(diào)節(jié)作用[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2020，40（3）：114-121.

（責(zé)任編輯：劉嶺）