加熱過程中蝦肌肉組織蛋白酶L的酶活力變化及其動力學(xué)

曹曉杰，孫欽秀，魏 帥，劉書成，吉宏武，邵海艷，郝記明，毛偉杰

加熱過程中蝦肌肉組織蛋白酶L的酶活力變化及其動力學(xué)

曹曉杰，孫欽秀，魏 帥，劉書成，吉宏武，邵海艷，郝記明，毛偉杰

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院//廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室//廣東省海洋食品工程技術(shù)研發(fā)中心//廣東省海洋生物制品工程重點實驗室//水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524088；海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連 116034；南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室，廣東 湛江 524088）

【】研究熱處理溫度和時間對凡納濱對蝦肌肉組織蛋白酶L酶活力的影響，并分析其酶活力變化動力學(xué)。從凡納濱對蝦的肌肉組織提取組織蛋白酶L，研究加熱溫度（35 ~ 60 ℃）和時間（5 ~ 60 min）對其酶活力的影響，采用反應(yīng)動力學(xué)模型擬合酶活力的變化過程。在35 ℃組織蛋白酶L的酶活力變化適合用一級動力學(xué)模型來描述，而在40 ~ 60℃組織蛋白酶L的酶活力變化適合用兩階段動力學(xué)模型來描述；凡納濱對蝦肌肉組織蛋白酶L存在敏感型和穩(wěn)定型兩種同工酶，敏感型的Z和E分別為158.7 ℃和5.5 kJ/mol，穩(wěn)定型的Z和E分別為71.9 ℃和12 kJ/mol。加熱處理可以使組織蛋白酶L發(fā)生變性而失活，采用合理的加熱溫度和速度可以降低組織蛋白酶L引起的凝膠劣化。

組織蛋白酶L；酶活力；熱處理；凡納濱對蝦

魚糜制品是水產(chǎn)品精深加工產(chǎn)品之一，然而魚糜在凝膠化過程中容易發(fā)生凝膠劣化造成凝膠強度下降，魚糜制品品質(zhì)降低。凝膠劣化的原因主要是水產(chǎn)動物肌肉中內(nèi)源蛋白酶在50 ~ 70 ℃范圍內(nèi)降解蛋白質(zhì)的結(jié)果[1]。造成凝膠劣化的內(nèi)源蛋白酶主要分為兩類：熱穩(wěn)定堿性蛋白酶和組織蛋白酶[1-2]。堿性蛋白酶雖然是造成魚糜凝膠劣化的關(guān)鍵酶類，最適溫度為60 ℃，但其主要存在于肌漿蛋白中，通過漂洗可以除去[1-5]。組織蛋白酶在50 ~ 60 ℃時活性最強，也是造成魚糜凝膠劣化的關(guān)鍵酶類[1-3, 6]。水產(chǎn)動物肌肉中組織蛋白酶的種類有很多，主要有組織蛋白酶B、H和L[2]。由于組織蛋白酶L與肌球蛋白結(jié)合緊密，在魚糜漂洗過程中很難除去，因此它在魚糜凝膠劣化中起主導(dǎo)作用[2-3, 6]，研究魚糜加工過程中組織蛋白酶L活力的變化對于改善魚糜凝膠劣化具有重要意義。

本課題組前期利用蝦肉糜（屬于魚糜的一種）開發(fā)蝦肉腸和蝦肉丸等產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)蝦肉糜在兩段式加熱（40 ℃加熱15 min，然后90 ℃加熱30 min）后形成的凝膠強度較低、彈性較差[7-8]，這可能由于組織蛋白酶L降解蛋白而破壞凝膠結(jié)構(gòu)，從而造成凝膠劣化。目前，雖然組織蛋白酶L被認為是導(dǎo)致魚糜凝膠劣化的關(guān)鍵酶，然而關(guān)于傳統(tǒng)加熱條件下組織蛋白酶L活力變化動力學(xué)的研究尚未見報道。因此，本研究在前期工作基礎(chǔ)上，從凡納濱對蝦（）肌肉中提取組織蛋白酶L，研究熱處理溫度和時間對其酶活力的影響，并分析其酶活力變化動力學(xué)，為尋求合理的熱加工方式降低組織蛋白酶L引起的凝膠劣化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮活凡納濱對蝦，規(guī)格36 ~ 40尾/kg，購于湛江市霞山東風(fēng)水產(chǎn)批發(fā)市場，充氧?；钸\至實驗室，用自來水清洗后加冰猝死，去頭、尾、殼、腸線，蝦仁用絞肉機絞碎后用于提取組織蛋白酶L。熒光底物Z-Phe-Arg-AMC購自美國sigma公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、半胱氨酸(L-Cys)、苯甲基磺酰氟（PMSF）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CO2氣體（純度99.9%）購自湛江氧氣廠。

1.2 儀器與設(shè)備

DTT-A1000型電子天平（美國康州HZ電子科技有限公司）；JYL-C022絞肉機（山東九陽股份有限公司）；T18 ULTRA-TURRAX IKA 高速均質(zhì)機（德國）；XW 80A漩渦混合器（上海醫(yī)大儀器有限公司）；PHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠）；GZX-9240MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）；Varioskan Flash全自動酶標儀（THERMO FISHER SCIENTIFIC）。

1.3 試驗方法

1.3.1 組織蛋白酶L粗酶的提取 參考顏龍杰等[9]的方法。稱取新鮮蝦肉糜60 g，加入480 mL預(yù)冷的40 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 6.0，含6 mmol/L L-Cys、0.4 mmol/L PMSF），用組織搗碎機充分勻漿，在4 ℃下8 500 r/min冷凍離心20 min，上清液即為組織蛋白酶L的粗酶液。

1.3.2 組織蛋白酶L活力的測定 參考Barrett等[10]的方法。取100 μL粗酶液于試管中，先后加入250 μL乙酸鈉-乙酸緩沖液（pH 4.0，50 mmol/L）和50 μL的底物Z-Phe-Arg-AMC（10 μmol/L），用漩渦混合器混勻后在60 ℃下孵育20 min，再加入400 μL反應(yīng)終止液（pH 4.55，含0.1 mol/L乙酸鈉，0.1 mol/L乙酸，0.1 mol/L氯乙酸鈉）混勻終止反應(yīng)，采用全自動酶標儀測定其熒光強度。測定所用的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為344 nm和436 nm?？瞻讓φ眨合燃尤?00 μL終止液，使酶失活，再加50 μL底物，其他操作均與上述描述相同。

酶活力單位（U）定義為：在最適反應(yīng)溫度（60 ℃）和最適pH（pH 4.0）條件下，每分鐘水解底物并釋放1 ng 7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）所需的酶量（1 ng AMC/min）。計算公式如下：

式中：為組織蛋白酶L酶活力， U/(min/mL)；為樣品熒光值；為反應(yīng)體系總體積，mL；V為反應(yīng)體系粗酶液加入量，mL；為反應(yīng)時間，min。

加熱后組織蛋白酶L的相對酶活力計算如下：

式中：(%)為組織蛋白酶L相對酶活力；為加熱后組織蛋白酶L的酶活力，0為加熱前組織蛋白酶L的酶活力。

1.3.3 組織蛋白酶L的最適溫度和熱穩(wěn)定性 蛋白酶最適溫度測定按照1.3.2的方法，其中孵育條件為不同溫度（4、10、20、30、40、50、60、70 ℃）保溫10 min，測定酶活力，通過酶活力大小確定組織蛋白酶L的最適溫度。

熱穩(wěn)定性的測定是將酶液加入乙酸鈉-乙酸緩沖液（pH 4.0，50 mmol/L）中，分別置于多個溫度（4 ~ 70 ℃）下保溫30 min，立即冰浴冷卻至室溫，測定其剩余酶活力。

1.3.4 組織蛋白酶L的熱處理 取3 mL組織蛋白酶L粗酶液于10 mL離心管中，放置于水浴鍋中進行加熱處理一定時間，處理好的樣品立即用冰浴冷卻至室溫。采用雙因素等重復(fù)試驗設(shè)計，處理溫度水平設(shè)置為35、40、45、50、55、60 ℃，處理時間水平設(shè)置為5、10、20、30、40、50、60 min。

1.3.5 組織蛋白酶L酶活力變化動力學(xué) 加熱過程中酶活力變化的動力學(xué)通常可以用一級反應(yīng)動力學(xué)模型來描述[11-12]，表達式如下：

式中：為加熱處理后組織蛋白酶L的酶活力，0為加熱處理前組織蛋白酶L的酶活力；0即為加熱處理后組織蛋白酶L的相對酶活力，%；為在一定溫度條件下反應(yīng)速率常數(shù)，min-1；為處理時間，min；為指數(shù)遞減時間，即在設(shè)定的溫度下組織蛋白酶L酶活力降低90 %所需的時間，min。

組織蛋白酶L對溫度的敏感性可用值（℃）和活化能（kJ/mol）表示[11-12]。溫度值是值降低90 %所需溫度的增加量，其方程表示如下：

活化能可由Arrhenius方程表示：

1和2表示1和2、1和2對應(yīng)的溫度，；為氣體常數(shù)8.314 J·mol-1·-1。

如果試驗數(shù)據(jù)不符合一級動力學(xué)模型，可進一步利用兩段式雙指數(shù)模型進行擬合[11-12]。該模型假設(shè)凡納濱對蝦肌肉組織蛋白酶L有兩類同工酶[19]，即敏感型和穩(wěn)定型，而這兩類酶又分別符合一級動力學(xué)模型，其方程表示如下：

A/0＝L×exp(-L×)＋S×exp(-S×)，（5）

式中：L和S分別表示敏感型和穩(wěn)定型酶活力在總酶活力中占有的比率；L和S分別表示敏感型和穩(wěn)定型酶的反應(yīng)速率常數(shù)（min-1）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 每個試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示；采用JMP10.0軟件進行酶活力變化動力學(xué)模型模擬和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織蛋白酶L的最適溫度和熱穩(wěn)定性

從圖1酶活力曲線可以看出，組織蛋白酶L的相對酶活力隨溫度的變化符合鐘形曲線，在60 ℃時表現(xiàn)出對熒光底物Z-Phe-Arg-AMC最強的分解能力。因此，組織蛋白酶L的最適溫度為60 ℃。凡納濱對蝦肌肉組織蛋白酶L的最適溫度顯著高于鰱魚（，55 ℃）[14]、藍圓鲹（，55 ℃）[15]和海參（，50 ℃）[16]等水產(chǎn)動物，這可能主要是物種差異的原因[13]。

從圖1的熱穩(wěn)定性曲線可以看出，當溫度低于35 ℃時，組織蛋白酶L的穩(wěn)定性較好，相對酶活力保持在80%以上；當溫度超過35 ℃時，組織蛋白酶L的酶活力顯著下降，在50 ℃保溫30 min后組織蛋白酶L的相對酶活力僅為35%，在60 ℃保溫30 min后組織蛋白酶L的相對酶活力僅為4%。這與顏龍杰等從凡納濱對蝦肝胰腺中提取的組織蛋白酶L的熱穩(wěn)定性比較相似[9]。因此，凡納濱對蝦肌肉組織蛋白酶L在30 ~ 35 ℃保存相對比較穩(wěn)定。

圖1 溫度對組織蛋白酶L相對酶活力的影響

2.2 組織蛋白酶L的酶活力變化

從圖2可以看出，組織蛋白酶L在35 ℃下處理5 ~ 60 min，其相對酶活力的變化較小，仍可保持在80%以上，這也再次說明凡納濱對蝦組織蛋白酶L在35 ℃下是比較穩(wěn)定的。在40 ~ 60 ℃范圍內(nèi)，當處理時間在0 ~ 10 min時，組織蛋白酶L的相對酶活力快速下降；當處理時間在10 ~ 60 min時，組織蛋白酶L的相對酶活力下降速度變緩。例如：在40 ℃處理10 min，組織蛋白酶L的相對酶活力下降了48.76%，從10 min到60 min，相對酶活力下降了32.94%；在60 ℃處理10 min，組織蛋白酶L的相對酶活力下降了80.05%，從10 min到60 min，相對酶活力下降了16%。雖然凡納濱對蝦肌肉組織蛋白酶L的最適溫度是60℃，但在60℃時酶活不穩(wěn)定，酶蛋白易發(fā)生變性而逐漸失活。這些現(xiàn)象符合酶的基本生化特征，即隨著溫度升高和處理時間延長，酶活逐漸喪失。蝦中其他酶在熱處理時也表現(xiàn)出同樣的現(xiàn)象，Huang等[17]利用熱處理凡納濱對蝦（）的多酚氧化酶，Verhaeghe等[18]利用熱處理褐蝦（）的蛋白酶和多酚氧化酶，其酶活力也都是隨著溫度升高和處理時間延長先迅速下降而后趨于變緩。

2.3 組織蛋白酶L的酶活力變化動力學(xué)

依據(jù)一級反應(yīng)動力學(xué)方程（1）和（2）對圖2中的數(shù)據(jù)進行線性化處理和計算動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見圖3和表1。

圖2 組織蛋白酶L在加熱過程中相對酶活力的變化

圖3 組織蛋白酶L相對酶活力變化的一級動力學(xué)模型

表1 組織蛋白酶L相對酶活力變化的一級動力學(xué)參數(shù)

在一級動力學(xué)模型中，相對酶活力的對數(shù)與時間的關(guān)系應(yīng)呈線性相關(guān)，在線性擬合圖中表現(xiàn)為數(shù)據(jù)點的位置接近于一條直線上，模型的決定系數(shù)（2）應(yīng)達到較高的水平[11-12]。從圖3可以看出，組織蛋白酶L相對酶活力的對數(shù)與加熱時間具有一定的線性相關(guān)。

從表1可以看出，隨著加熱溫度升高，速率常數(shù)增加，而指數(shù)遞減時間值下降，說明溫度越高，組織蛋白酶L越容易失活。從表1還可以看出，在35 ℃時組織蛋白酶L相對酶活力的對數(shù)與加熱時間的線性模型的決定系數(shù)2達到了0.99，而在40 ~ 60℃時其線性模型的決定系數(shù)2偏低。因此，35 ℃下組織蛋白酶L的酶活力變化可能適合用一級動力學(xué)模型來描述，而40 ~ 60℃下組織蛋白酶L的酶活力變化不適合用一級動力學(xué)模型來描述，需要用其他動力學(xué)模型來描述。

依據(jù)兩段式動力學(xué)方程（5）對圖2的數(shù)據(jù)進行模擬處理和計算動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見圖4和表2。

圖4 組織蛋白酶L相對酶活力變化的兩段式動力學(xué)模型

表2 組織蛋白酶L相對酶活力變化的兩段式動力學(xué)參數(shù)

L和S分別表示敏感型和穩(wěn)定型酶活力在總酶活力中占有的比率；L和S分別表示敏感型和穩(wěn)定型酶的反應(yīng)速率常數(shù)（min-1）。

從圖4看出，40 ~ 60 ℃的試驗數(shù)據(jù)經(jīng)擬合處理呈現(xiàn)出較好的兩段式模型，這可能是因為凡納濱對蝦肌肉組織蛋白酶L可能存在敏感型和穩(wěn)定型兩種同工酶。關(guān)于組織蛋白酶L具有同工酶已有相關(guān)報道。崔昱清等從牛胰臟中分離獲得了組織蛋白酶L的同工酶[19]，李樹紅等從鰱魚背肌中分離獲得了組織蛋白酶L的同工酶[20]。35 ℃的試驗數(shù)據(jù)擬合呈現(xiàn)出一條直線，說明在35 ℃只有部分敏感型酶失活；在40 ~ 60 ℃敏感型酶幾乎立即失活，穩(wěn)定型酶逐漸失活。

從表2看出，在35 ~ 60 ℃時兩段式動力學(xué)模型能很好地擬合實驗數(shù)據(jù)，決定系數(shù)（2）均達到了0.99；但是在35 ℃擬合的模型系數(shù)A（敏感型組織蛋白酶L酶活力占總酶活力的比例）為負值，這不符合實際。因此，40 ~ 60 ℃組織蛋白酶L的酶活力變化適合用兩段式動力學(xué)模型描述，而35℃時組織蛋白酶L的酶活力變化不適合用兩段式動力學(xué)模型描述。

從表2還可以看出，在40 ~ 60 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，k和k值均呈增加趨勢，即溫度越高，敏感型和穩(wěn)定型組織蛋白酶L的失活越快，說明提高溫度能顯著增強對酶的鈍化效果；在同一溫度下，k值顯著大于k值，說明在敏感型組織蛋白酶L失活較快，而穩(wěn)定型組織蛋白酶L失活較慢，說明穩(wěn)定型組織蛋白酶L的熱穩(wěn)定性顯著好于敏感型的。

依據(jù)方程（3）和（4）對表2中的數(shù)據(jù)進行處理，分別計算出兩個階段的敏感溫度Z和活化能E值。Z值是值下降90%時溫度的增加量，表示值對溫度的敏感性，Z值越大表示反應(yīng)對溫度的依賴性越大；E值與速率常數(shù)和溫度有關(guān)，E值越小表示反應(yīng)越容易發(fā)生[11-12]。敏感型組織蛋白酶L的Z, L和E, L分別為158.7 ℃和5.5 kJ/mol，穩(wěn)定型組織蛋白酶L的Z, s和E, s分別為71.9 ℃和12 kJ/mol。敏感型組織蛋白酶L的Z值大于穩(wěn)定型組織蛋白酶L的Z值，說明穩(wěn)定型組織蛋白酶L的熱穩(wěn)定性大于敏感型組織蛋白酶L，對溫度的依賴性大于敏感型組織蛋白酶L；敏感型組織蛋白酶L的E, L值小于穩(wěn)定型組織蛋白酶L的E, s值，說明敏感型組織蛋白酶L更容易失活。Verhaeghe等[18]利用熱處理褐蝦（）的蛋白水解酶，也發(fā)現(xiàn)在40 ~ 80℃范圍內(nèi)下適合用兩階段動力學(xué)模型擬合試驗數(shù)據(jù)，計算了60 ℃時的動力學(xué)參數(shù)，兩階段的失活速率常數(shù)分別為k= 0.94 min-1和k= 0.02 min-1，活化能分別為E, L=178 kJ/mol和E=155 kJ/mol。通過比較發(fā)現(xiàn)，兩者的研究結(jié)果基本一致，尤其酶的失活速率常數(shù)比較接近；但是兩階段的活化能有較大差異，這可能是物種或酶種類差異造成，因為Verhaeghe等[18]是利用蝦頭胸部提取的混合蛋白酶，而本研究是從蝦肌肉組織中提取的組織蛋白酶L。

3 結(jié)論

凡納濱對蝦肌肉組織蛋白酶L的最適溫度在60 ℃左右，在30 ~ 35℃保存相對比較穩(wěn)定；在35 ℃組織蛋白酶L的酶活力變化適合用一級動力學(xué)模型來描述，而在40 ~ 60℃組織蛋白酶L的酶活力變化適合用兩階段動力學(xué)模型來描述；蝦肌肉組織蛋白酶L存在敏感型和穩(wěn)定型兩種同工酶，穩(wěn)定型酶的熱穩(wěn)定性大于敏感型，對溫度的依賴性也大于敏感型，敏感型酶加熱更容易失活。

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Changes and Kinetics Activity of Cathepsin L from Shrimp Muscle During Heating

CAO Xiao-jie, SUN Qin-xiu, WEI Shuai, LIU Shu-cheng, JI Hong-wu, SHAO Hai-yan, HAO Ji-ming, MAO Wei-jie

（,////////,524088,;,,116034,;,524088,）

The enzyme activity changes and kinetics of cathepsin L frommuscle were studied during heating.Cathepsin L was extracted from the muscle and the effects of temperature (35 – 60 ℃) and time (5 – 60 min) on cathepsin L activity were studied. The reaction kinetics models were used to monitor the changes in cathepsin L activity.The change of cathepsin L activity at 35 ℃ can be considered as a first-order kinetic model, while change of cathepsin L activity at 40 – 60 ℃ can be explained by a biexponential kinetic model. Cathepsin L frommuscle consists of sensitive and stable isozymes.ZandEof the sensitive cathepsin L were 158.7 ℃ and 5.5 kJ/mol, respectively, andZandEof the stable cathepsin L were 71.9 ℃ and 12 kJ/mol.Heating can denature and inactivate cathepsin L. An optimal heating temperature and rate can reduce gel degradation caused by cathepsin L.

Cathepsin L; enzyme activity; heating;

TS254.1

A

1673-9159（2020）03-0108-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.014

2020-01-16

國家重點研發(fā)計劃資助（2019YFD0902003）；國家自然科學(xué)基金面上項目（31771997）；南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室（湛江）資助（ZJW-2019-06）；廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新強校重大培育項目（GDOU2017052603）；國家蝦蟹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（G-48）；廣東普通高等學(xué)校海洋食品綠色加工技術(shù)研究團隊

曹曉杰（1993－），女，碩士研究生，研究方向為海洋食品加工新技術(shù)。E-mail: 349057481@qq.com

孫欽秀（1986－），女，博士，講師，研究方向為海洋食品加工新技術(shù)。E-mail: sunqinxiugo@163.com

劉書成（1977－），男，博士，教授，研究方向為海洋食品加工新技術(shù)。E-mail: Lsc771017@163.com

曹曉杰，孫欽秀，魏帥，等. 加熱過程中蝦肌肉組織蛋白酶L的酶活力變化及其動力學(xué)[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2020，40（3）：108-113.