竹類植物SSR 引物開發(fā)策略及應(yīng)用

蒲永慶, 周建梅

內(nèi)江市東興區(qū)自然資源和規(guī)劃局，四川 內(nèi)江 641100

SSR 即簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeats）又稱為微衛(wèi)星（Microsatellites）[1-2]，是以如（CA）n，（TG）n，（GGC）n 等少數(shù)幾個(gè)核苷酸為單位的串聯(lián)重復(fù)DNA 序列，其中n 代表重復(fù)次數(shù)，重復(fù)次數(shù)從幾個(gè)到幾十個(gè)不等。不同等位基因之間的重復(fù)數(shù)存在著顯著差異，并且重復(fù)序列兩端多是相對(duì)保守的單拷貝序列，可通過設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)基因組總DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度多態(tài)性可用作分子標(biāo)記[3]。SSR 分子標(biāo)記是群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、品種遺傳多樣性研究、品種保護(hù)與純度鑒定、交配系統(tǒng)分析的有效工具，也被認(rèn)為是信息含量高、多態(tài)性高；穩(wěn)定性好，重復(fù)性好；分辨率高、揭示力強(qiáng)的分子標(biāo)記。

竹類植物是禾本科中最大的自然類群，全世界約有88 屬1 400 種，中國有34 屬近550 種，集材用、筍用和觀賞等眾多用途，是重要的園林樹種之一[4-5]。竹類植物作為一類生物學(xué)特性特殊的植物，近年來，雖然SSR 分子標(biāo)記技術(shù)在其種質(zhì)鑒定、種屬分類及系統(tǒng)發(fā)育等方面有所應(yīng)用，但是竹類植物中開發(fā)的SSR 引物較少，檢測(cè)的SSR 位點(diǎn)不足以滿足種質(zhì)鑒定及群體遺傳研究的需要，因而需要開發(fā)更多的竹類植物SSR 引物，來擴(kuò)大竹類植物種質(zhì)鑒定的數(shù)量和范圍及進(jìn)行系統(tǒng)分類、群體遺傳等研究。本文綜述了竹類植物中的SSR 引物開發(fā)方法及研究進(jìn)展，為進(jìn)一步研究竹類植物種質(zhì)資源的群體遺傳學(xué)提供技術(shù)支持。

1 使用近緣種引物

由于SSR 標(biāo)記是根據(jù)微衛(wèi)星兩側(cè)的保守序列設(shè)計(jì)引物的，因此，不同物種之間的有些SSR 引物是可以通用的。在早期的研究中，因沒有開發(fā)出竹類植物SSR 引物，竹類植物SSR 分子標(biāo)記也處于摸索階段，學(xué)者們便利用竹類植物與禾本科其他植物的親緣關(guān)系，將水稻、小麥、高粱等禾本科植物的分子數(shù)據(jù)運(yùn)用到竹類研究中，是研究竹類植物SSR 標(biāo)記的有效途徑之一。在國內(nèi)的研究中，具有代表性的是將水稻SSR 引物數(shù)據(jù)用于竹子中。李淑嫻等[6]通過水稻SSR 引物從分子方面分析青籬竹屬及其相關(guān)屬的親緣關(guān)系，陳淑云等[7]利用水稻和甘蔗SSR引物轉(zhuǎn)移至竹子中，開發(fā)出42 對(duì)SSR 引物（水稻34 對(duì)、甘蔗8 對(duì)）用于竹子的表型和遺傳多樣性分析。國外也有相似的研究，用禾本科植物的SSR 引物檢測(cè)竹子的遺傳變異、竹種鑒定、遺傳多樣性[8-9]。國內(nèi)外文獻(xiàn)表明，禾本科植物的SSR 引物適用于竹類植物研究，說明SSR 引物在同科不同屬或者更近的物種間具有一定的通用性。因此，使用近緣種的引物可以很好地用于竹類植物的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性研究。

2 常用的竹類植物SSR 引物開發(fā)策略

開發(fā)SSR 引物的前提是要知道SSR 位點(diǎn)兩側(cè)的DNA 序列。目前，對(duì)于竹類植物SSR 引物開發(fā)策略，從搜索的文獻(xiàn)資料來看，如圖1 所示，常用主要有3 種：利用生物信息學(xué)搜索數(shù)據(jù)庫、構(gòu)建和篩選基因組文庫、從EST 序列中開發(fā)SSR 引物。

圖 1 竹類植物主要的SSR 引物開發(fā)策略及查閱到的文獻(xiàn)Fig. 1 Main SSR primer exploitation strategies and related literatures in bamboo plants

2.1 利用生物信息學(xué)搜索數(shù)據(jù)庫

在DNA 數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)存在大量的基因組序列，可以先通過SSR 搜索軟件獲得SSR 位點(diǎn)信息，這些搜索軟件包括在線的SSRIT（http://www.gramene.org/ab/searches/ssrtool）Sputnik（http://cbi.labri.fr/outils/Pise/sputnik.html）及可本地下載的軟件比如DNAman、misa、ssrhunter 等[10]。然后根據(jù)SSR 位點(diǎn)兩側(cè)的核酸序列信息，利用軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，常用的引物設(shè)計(jì)軟件有primer premier 5.0 和oligo 6.0，也可以利用在線設(shè)計(jì)軟件如primer 3.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)[11]。

已開發(fā)出相關(guān)基因組數(shù)據(jù)庫有很多種，如國際三大核苷酸數(shù)據(jù)庫Gene Bank/NCBI、EMBL 以及DDBJ 等。也有專門的微衛(wèi)星DNA 引物數(shù)據(jù)庫如Molecular Ecology Notes。盧江杰等[12,13]通過搜索Gen Bank 毛竹序列，開發(fā)了19 對(duì)SSR 引物，并用這些引物研究了毛竹11 個(gè)變型的遺傳多樣性。通過搜索Gen Bank 中的毛竹序列，毛竹已成為SSR 引物開發(fā)最多的竹種。

2.2 構(gòu)建和篩選DNA 文庫

2.2.1 構(gòu)建基因組文庫

構(gòu)建基因組文庫發(fā)篩選SSR 引物是最傳統(tǒng)，也是最經(jīng)典的方法。它首先需要構(gòu)建所研究對(duì)象的一個(gè)小片段插入的基因組文庫，然后用含有微衛(wèi)星序列的探針與之雜交篩選文庫，然后挑選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，再根據(jù)SSR 兩端的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，最后用該引物對(duì)相應(yīng)的SSR 座位作定性分析[14]。這種方法需要進(jìn)行多次篩選，并且需要測(cè)序，具有工作量大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)。

在竹類植物中，最早的研究是Nayak 和Rout等[15]對(duì)簕竹屬的印度刺竹（Bambusa arundinacea）采用傳統(tǒng)的基因組文庫構(gòu)建和Southern 雜交的傳統(tǒng)方法，獲得了6 對(duì)SSR 引物，其中僅3 對(duì)具有多態(tài)性，分析了18 個(gè)親緣竹種間的遺傳多樣性。Kaneko等[16]利用構(gòu)建文庫法，針對(duì)澳大利亞北部特有竹種Bambusa arnhemica開發(fā)了9 對(duì)SSR 引物，分析了該種4 個(gè)群體95 個(gè)體的開花現(xiàn)象。

2.2.2 構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫

為了提高篩選工作效率，人們開發(fā)了利用富集步驟篩選微衛(wèi)星標(biāo)記的方法—建立和篩選微衛(wèi)星富集文庫法。其方法主要有兩種：一種是利用含微衛(wèi)星序列的PCR 引物進(jìn)行PCR 富集。另一種是用含微衛(wèi)星序列的探針進(jìn)行雜交富集。實(shí)質(zhì)上，也就是在篩選小插入片段基因組文庫的基礎(chǔ)上再增加一次篩選?；蛘呦扔肞CR 富集，再用探針雜交篩選；或者兩次都用雜交篩選，總之，經(jīng)過這樣兩次篩選，獲得SSR 克隆的效率大大提高。富集文庫的建立，有效避免了克隆的篩選，縮短了篩選時(shí)間，適宜于大規(guī)模的開發(fā)，可以在不同程度上降低開發(fā)成本。在竹類植物中，利用磁珠富集法來開發(fā)SSR 引物應(yīng)用較為廣泛。

從圖1 可知，從已發(fā)表的文獻(xiàn)資料來看，采用構(gòu)建基因組文庫開發(fā)SSR 引物的文獻(xiàn)較多。其中，利用磁珠富集法所開發(fā)的毛竹SSR 引物的文章就有5 篇[12,17-20]。另外，董玉然等[21]在磁珠富集法的基礎(chǔ)之上，采用基于AFLP 技術(shù)的磁珠富集快速分離技術(shù)（FIASCO）（即按照AFLP 的方法進(jìn)行酶切、連接、擴(kuò)增后再利用磁珠雜交富集含有微衛(wèi)星的DNA片段）開發(fā)了16 對(duì)巨龍竹SSR 引物，并用這些引物分析了巨龍竹的遺傳多樣性。

2.2.3 從EST 序列中開發(fā)SSR 引物

傳統(tǒng)的基因組SSR 標(biāo)記開發(fā)過程較慢，需要進(jìn)行基因組文庫的構(gòu)建、重復(fù)序列克隆的識(shí)別和篩選、測(cè)序、引物設(shè)計(jì)等環(huán)節(jié)，不僅費(fèi)時(shí)耗力，成本也很高。近年來通過cDNA 文庫測(cè)序得到的表達(dá)序列標(biāo)簽EST（Expressed sequence tag，EST）發(fā)展十分迅速，在GenBank 中平均每天都有上萬個(gè)EST 公布，因而從EST 序列中可迅速尋找到EST-SSR 標(biāo)記[22]。由于EST 代表具有一定功能基因或基因的一部分，使得EST-SSR 具有較強(qiáng)的種屬通用性。

李桃等[23]搜索了NCBI、EMBL 中的竹類EST序列，通過比對(duì)和SSR 搜索后設(shè)計(jì)了35 對(duì)引物，并將16 個(gè)屬的39 種竹類植物分為叢生竹和散生竹兩大類群。Sharma 等[24]基于NCBI 中Bambusa oldhamii的EST 序列開發(fā)了13 對(duì)EST-SSR 引物，其中能擴(kuò)增目的片段的10 對(duì)引物在 25 個(gè)竹種中的通用性進(jìn)行了研究，通用率為30% ～ 100%不等，多態(tài)信息含量（PIC）約0.54，由于SSR 位點(diǎn)代表轉(zhuǎn)錄區(qū)域及種間高通用性，均表明EST-SSR 可用于竹種功能及遺傳分析。目前，在竹類植物研究中，從EST 序列中獲得的SSR 標(biāo)記在系統(tǒng)分類、竹種間的通用性[25]、竹種鑒定[26-27]、遺傳多樣性[28]等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。

圖 2 SSR 分子標(biāo)記在竹類植物中的應(yīng)用Fig. 2 Applications of SSR molecular markers in bamboo plants

3 SSR 分子標(biāo)記在竹類植物中的應(yīng)用

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，SSR 分子標(biāo)記因其操作簡(jiǎn)單和共顯性，在竹類植物中已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用。如圖2 所示，從現(xiàn)有已發(fā)表的國內(nèi)外文獻(xiàn)來看，SSR 分子標(biāo)記在竹類植物中的應(yīng)用主要集中遺傳多樣性分析和種屬間的通用性研究，分別占所搜集文獻(xiàn)的37.5%和25%；竹子分類系統(tǒng)和種質(zhì)鑒定次之，均占12.5%；親緣關(guān)系分析、遺傳變異、遺傳結(jié)構(gòu)等領(lǐng)域的應(yīng)用較少，分別占4.16%、4.17%、4.17%。

在植物遺傳育種研究中，葉綠體SSR 標(biāo)記、細(xì)胞核SSR 標(biāo)記已在遺傳結(jié)構(gòu)分析[29]、遺傳多樣性和親緣關(guān)系[30]等研究中有了廣泛應(yīng)用，對(duì)于竹類植物來說，開發(fā)這些SSR 標(biāo)記任重而道遠(yuǎn)，仍然需要致力于竹類植物研究的學(xué)者們?nèi)ゲ粩嗵剿鳌?/p>

4 研究展望

隨著分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展和改進(jìn)，SSR分子標(biāo)記已得到了廣泛應(yīng)用，新的SSR 標(biāo)記開發(fā)策略也不斷地被提出。上述所提到的幾種SSR 引物開發(fā)策略，各有各的優(yōu)勢(shì)，因此，在進(jìn)行SSR 引物時(shí)，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和材料要求，選擇合適的開發(fā)策略是成功開發(fā)SSR 引物的關(guān)鍵所在。

目前，SSR 標(biāo)記在植物中的應(yīng)用主要包括通用性研究、遺傳多樣性與種質(zhì)鑒定研究、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、基因定位與克隆等，通用性、遺傳多樣性與種質(zhì)鑒定研究在竹類植物中已經(jīng)有所應(yīng)用，且從目前的文獻(xiàn)資料來看，以遺傳多樣性研究為主。在竹類植物中構(gòu)建遺傳圖譜、基因定位與克隆發(fā)展相對(duì)較慢，然而，國內(nèi)外學(xué)者們，利用SSR 構(gòu)建遺傳連鎖圖譜在水稻[31-32]、小麥[33]、棉花[34]等農(nóng)作物中已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展，主要作物的遺傳圖譜的成功構(gòu)建，也將為基因的精細(xì)定位與圖位克隆奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。例如：控制玉米種子含油量和胚含油量的基因DGAGl-2 在初步定位時(shí)，就是被定位在兩個(gè)SSR 標(biāo)記之間，最終通過圖位克隆獲得了功能基因[35]。根據(jù)毛竹基因組序列草圖，60%的毛竹基因組為重復(fù)序列所覆蓋[36]，說明SSR 標(biāo)記在竹類植物研究中有著巨大的潛力。因此，相信隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展與不斷創(chuàng)新，構(gòu)建竹類植物的遺傳圖譜及基因定位與克隆也只是時(shí)間的問題。

竹類植物是比較特殊的一類，其染色體數(shù)目較多且不穩(wěn)定，普遍存在多倍性、非整倍性、混倍性和染色體結(jié)構(gòu)變異的現(xiàn)象。竹類植物染色體結(jié)構(gòu)和基因組特性方面的研究尚未見報(bào)道，如果能夠了解竹類植物染色體上SSR 序列的分布情況，從而探索微衛(wèi)星在竹類植物染色體上的變化，將有利于進(jìn)一步推斷竹類植物的染色體結(jié)構(gòu)和進(jìn)化過程，為竹類植物的遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。