基于QbD理念優(yōu)化苦參生物堿的分離工藝

蔣建蘭，單瀟瀟，孫?露，張凱旋

基于QbD理念優(yōu)化苦參生物堿的分離工藝

蔣建蘭1, 2，單瀟瀟1, 2，孫?露1, 2，張凱旋1, 2

(1. 天津大學(xué)系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300350；2. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300350)

質(zhì)量源于設(shè)計(jì)；苦參；純化過程；優(yōu)化

近年來，質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(quality by design，QbD)原則廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)操作當(dāng)中，以確保產(chǎn)品質(zhì)量可?控[1]．這一理念是將質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理理念引入到制藥工業(yè)當(dāng)中，常被用來評(píng)估藥品質(zhì)量[2-4]和優(yōu)化生產(chǎn)過?程[5-7]．QbD原則是在確定關(guān)鍵工藝參數(shù)的前提下，得出工藝指標(biāo)與關(guān)鍵質(zhì)量屬性之間的數(shù)學(xué)模型，通過對(duì)模型參數(shù)的設(shè)定，建立穩(wěn)定可控的設(shè)計(jì)空間[8]，使工藝操作更加靈活．

QbD理念常用于中藥提取[9-10]以及劑型優(yōu)化[11-13]等生產(chǎn)當(dāng)中，而在中藥分離純化過程的相關(guān)研究較少．筆者以苦參甘草提取液中生物堿的分離純化工藝為例，論述將QbD理念引入到中藥分離純化工藝的實(shí)驗(yàn)方法．苦參甘草配伍是一類常見的復(fù)方，其中苦參為主藥，有清熱利尿之功效，對(duì)人類的心臟、大腦、肝臟等有益[14]．苦參中的主要抗菌物質(zhì)是生物堿，包括苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿等[15]，其中苦參堿和氧化苦參堿的含量最高且應(yīng)用最廣，因而使用這兩種生物堿以及苦參總堿的解吸量作為工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)來優(yōu)化分離工藝．

1?試驗(yàn)材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料和儀器

樹脂AB-8(批號(hào)20140618)、樹脂D-101(批號(hào)20150316)、樹脂D3520(批號(hào)20130409)、樹脂NK-109(批號(hào)20160217)，購自南開合成科技有限公司；樹脂XDA-5(批號(hào)20150703)、樹脂S-8(批號(hào)20140505)、樹脂NKA-9(批號(hào)20140607)，購自鄭州勤實(shí)科技有限公司；以上樹脂均用5.0% HCl和 0.2moL/L NaOH分別處理，乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌，最后將它們浸泡在蒸餾水中待用．

玻璃層析柱(10.0mm×350.0mm)，天津市鵬翔天達(dá)玻璃儀器經(jīng)營(yíng)部；高效液相色譜儀(Waters 1525，Waters 2489 紫外檢測(cè)器)、Unitary C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)、紫外-可見分光光度計(jì)(UV6000)，上海元析儀器有限公司．

1.2?樣品前處理

將苦參和甘草放置于45℃的恒溫干燥箱里干燥至恒重，然后將7.50g苦參和10.00g甘草用70.0%的乙醇溶液回流提取2h，提取液以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心，收集上清液作為柱分離試驗(yàn)的上樣液．

1.3?工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定

溴甲酚綠紫外分光光度法用來測(cè)定TASF的含量，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為420nm．MT和OMT的含量采用外標(biāo)法檢測(cè)，液相檢測(cè)系統(tǒng)為：Waters 1525，Waters 2489紫外檢測(cè)器，色譜柱為Unitary C18(4.6mm×250mm，5μm)，在檢測(cè)波長(zhǎng)220nm、柱溫30℃、流動(dòng)相為水(0.1%磷酸，A)-乙腈(B)的條件下，對(duì)樣品進(jìn)行梯度洗脫(0～4min，95%～87%A；4～7min，87%～80%A；7～20min，80%～95%A)，進(jìn)樣量為20μL，流速1.0mL/min[16]．

1.4?樹脂的選擇

1.4.1?靜態(tài)試驗(yàn)

分別稱取7種樹脂8.00g和40mL提取液混合放置于搖床當(dāng)中，30℃、120r/min的條件下吸附24h．當(dāng)吸附完成后，將吸附完成的樹脂用10mL的蒸餾水洗滌兩次，置換出樹脂層中殘留的提取液，然后再用45mL、70.0%的乙醇靜態(tài)洗脫，解吸條件與吸附過程相同．各物質(zhì)吸附量a與解吸量d計(jì)算式分別為

1.4.2?數(shù)據(jù)處理

使用“歸一值”法對(duì)多量綱的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理．

根據(jù)7種樹脂的靜態(tài)吸附和靜態(tài)洗脫過程中的OD值大小，選擇最優(yōu)的樹脂作為柱層析動(dòng)態(tài)洗脫試驗(yàn)中的吸附劑．

1.5?關(guān)鍵工藝參數(shù)的識(shí)別

1.5.1?單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)實(shí)際工作中的經(jīng)驗(yàn)，選取合適的因素，采用單一變量法來研究各參數(shù)對(duì)NK-109樹脂動(dòng)態(tài)吸附與洗脫提取工藝的影響，每組試驗(yàn)進(jìn)行3次．

1.5.2?多因素顯著試驗(yàn)設(shè)計(jì)

多因素顯著試驗(yàn)(Plackeet-Burmann design，PBD)由design-expert 8.0軟件完成．根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合考量各因素對(duì)3種工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響，在單因素試驗(yàn)結(jié)果中呈上升趨勢(shì)的區(qū)間內(nèi)，選擇各因素的高低水平(高：1，低：-1)，根據(jù)試驗(yàn)指導(dǎo)原則[17]，在Plackeet-Burmann中設(shè)計(jì)12組5因素2水平的試驗(yàn)，得出相應(yīng)工藝下的工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)值，然后對(duì)5種因素進(jìn)行顯著性分析，篩選出關(guān)鍵工藝參數(shù)．

1.6?中心點(diǎn)復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

中心點(diǎn)復(fù)合試驗(yàn)(central composite designed，CCD)由design-expert 8.0軟件完成．根據(jù)PBD試驗(yàn)結(jié)果確定顯著因素，即為關(guān)鍵工藝參數(shù)(critical process parameters，CPPs)．試驗(yàn)選取上樣液pH值、洗脫劑乙醇濃度和洗脫流速為關(guān)鍵影響因素進(jìn)一步優(yōu)化．在Central-Composite中設(shè)計(jì)20組3因素5水平的中心點(diǎn)復(fù)合試驗(yàn)，得到相應(yīng)工藝下的3種工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)值，進(jìn)行回歸分析．

2?結(jié)果與討論

2.1?大孔樹脂篩選結(jié)果

吸附是一種物理過程，吸附效果與吸附劑性能和吸附劑與被吸附物質(zhì)之間的分子相互作用有關(guān)．試驗(yàn)考察了7種樹脂靜態(tài)吸附和解吸的效果，試驗(yàn)結(jié)果如表1、表2所示．比較OD值，NK-109型大孔樹脂對(duì)于此次優(yōu)化試驗(yàn)來說性能最優(yōu)，因此選其為分離過程中的吸附劑．

2.2?關(guān)鍵工藝參數(shù)的確定

2.2.1?單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1和圖2可知各因素對(duì)TASF、MT和OMT 吸附量和解吸量的影響差別較大，且同一因素對(duì)3種工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響也不盡相同．隨著上樣流速增大，提取液中的生物堿類物質(zhì)不能與吸附劑充分接觸，導(dǎo)致物質(zhì)不能很好地被吸附，吸附量降低．在提取液呈酸性時(shí)，隨著pH值增大，苦參中的生物堿由離子態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，增強(qiáng)了物質(zhì)與樹脂間的作用力，使吸附量增大，但當(dāng)提取液pH值呈堿性時(shí)，部分生物堿與甘草中的酸性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，降低了提取液中的生物堿總量，導(dǎo)致吸附量減少．稀釋倍數(shù)越大，相同體積的提取液中生物堿含量越少，導(dǎo)致各生物堿的吸附量也因此減少．隨著洗脫液體積增大，更多的生物堿類物質(zhì)被洗脫，導(dǎo)致解吸量升高．與上樣流速相似，當(dāng)洗脫流速增大時(shí)，洗脫劑與物質(zhì)之間的接觸時(shí)間較短，導(dǎo)致解吸量降低．隨著乙醇濃度升高，各生物堿的解吸量呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)，TASF和MT的解吸量隨著乙醇濃度的升高而增大，而OMT為弱極性物質(zhì)，在高濃度乙醇溶液中的溶解度逐漸降低，因此其解吸量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)．根據(jù)圖1和圖2中數(shù)據(jù)結(jié)果，結(jié)合生產(chǎn)成本，選定洗脫劑體積用量為60mL，在此基礎(chǔ)上確定其他參數(shù)的高低水平為上樣流速：20.0mL/h、40.0mL/h；上樣液pH值：4.5、6.5；上樣液稀釋濃度：不稀釋、稀釋2倍；洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)：70.0%、90.0%；洗脫流速：20.0mL/h、40.0mL/h；設(shè)計(jì)PBD試驗(yàn)，篩選出關(guān)鍵工藝參數(shù)見表3．

表1?7種樹脂的吸附量

Tab.1?Absorption capacities of seven resins

表2?7種樹脂的解吸量

Tab.2?Desorption capacities of seven resins

圖1?吸附過程中各因素對(duì)生物堿吸附量的影響

圖2?洗脫過程中各因素對(duì)生物堿解吸量的影響

表3?PBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

Tab.3?PBD experimental design results

2.2.2?PBD試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)各因素進(jìn)行回歸分析，試驗(yàn)結(jié)果見表4．表中數(shù)據(jù)給出了各因素對(duì)工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響順序，值越低，影響越顯著．綜合考察各因素影響的顯著水平，選取上樣液pH值、洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)和洗脫流速為優(yōu)化過程中CPPs，在洗脫液體積60mL、上樣流速30.0mL/h、上樣液不稀釋的基礎(chǔ)上進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)．

表4?PBD試驗(yàn)結(jié)果分析

Tab.4?Analysis of PBD experiment results

注：TASF、MT和OMT的2分別為0.9381、0.9235和0.8874；上標(biāo)“*”表示顯著．

2.3?CCD試驗(yàn)結(jié)果

利用design-expert軟件設(shè)計(jì)CCD試驗(yàn)并進(jìn)行回歸分析，試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，CPPs與工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)間的最佳模型為二次多項(xiàng)式函數(shù)，d1、d2、d3分別表示TASF、MT和OMT解吸量對(duì)上樣液pH值(1)、洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)(2)和洗脫流速(3)的響應(yīng)值，回歸方程如下：

表5?CCD試驗(yàn)結(jié)果分析

Tab.5?Analysis of CCD experiment results

對(duì)3個(gè)回歸方程進(jìn)行方差分析，方程的2值分別為0.8957、0.9271、0.8874，值分別為0.0008、0.0001、0.0011，均小于0.05(顯著)，失擬項(xiàng)值分別為0.0726、0.0734、0.1104，均大于0.05(不顯著)，表明回歸方程顯著，模型擬合度高，且隨機(jī)誤差對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小，CPPs與3種工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)之間可用此模型函數(shù)化．

2.4?設(shè)計(jì)空間的建立

圖3?分離純化過程中的設(shè)計(jì)空間

黃色區(qū)域表示相應(yīng)參數(shù)條件下，工藝指標(biāo)值滿足要求

表6?設(shè)計(jì)空間的驗(yàn)證

Tab.6?Verification of design space

注：上標(biāo)“*”表示預(yù)測(cè)值．

3?結(jié)?語

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Application of a Quality by Design Approach to Optimize Separation of Alkaloids in

Jiang Jianlan1, 2，Shan Xiaoxiao1, 2，Sun Lu1, 2，Zhang Kaixuan1, 2

(1. Key Laboratory of Systems Bioengineering of Ministry of Education，Tianjin University，Tianjin 300350，China；2. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300350，China)

quality by design；；purification process；optimization

R932

A

0493-2137(2020)11-1204-07

10.11784/tdxbz201910032

2019-10-21；

2020-01-02.

蔣建蘭（1972—??），女，博士，研究員.

蔣建蘭，jljiang@tju.edu.cn.

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81102900).

Supported by the Young Scientists Fund in the National Natural Science Foundation of China(No. 81102900).

(責(zé)任編輯：田?軍)