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    羊口瘡病毒ORFV129錨蛋白在山羊睪丸細胞中的亞細胞定位

    2020-08-29 13:29:46朱江江張煥容
    華北農(nóng)學(xué)報 2020年4期
    關(guān)鍵詞:原代睪丸山羊

    向 華,黃 忍,朱江江,岳 華,湯 承,張煥容

    (1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041;2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用,四川省重點實驗室,四川 成都 610041)

    羊傳染性膿皰皮炎俗稱“羊口瘡”,是由羊口瘡病毒(Orfvirus,ORFV)引起的一種急性、接觸性、嗜上皮性的人獸共患傳染病[1]。該病毒主要感染綿羊及山羊,特別是羔羊,人類接觸也可感染[2]。臨床上主要以感染動物的唇、鼻孔、口腔黏膜、乳房、陰部等部位皮膚形成紅斑、水皰、膿皰、丘疹和疣狀痂皮為特征[3-5]。初生羔羊和幼齡羊感染ORFV后發(fā)病率高達100%,死亡率達93%;雖然成年羊感染ORFV后的死亡率較低,但由此引起的采食困難,會導(dǎo)致機體消瘦、生長緩慢,以及繼發(fā)感染,帶來巨大的經(jīng)濟損失。近年來,隨著我國養(yǎng)羊數(shù)量增加和跨境流通,ORF作為人畜共患的傳染病,對人類的健康也產(chǎn)生了威脅,受到社會的廣泛關(guān)注。然而,由于ORFV特有的免疫機制和免疫逃逸機制,目前的疫苗并不能為羊提供完全的免疫保護。同時,現(xiàn)有的針對羊口瘡的治療藥物大多為“對癥治療”的緩解性藥物,其治療效果不甚理想,且費時費力。羊口瘡難以根治的特點和反復(fù)發(fā)作的現(xiàn)狀已成為制約養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。

    ORFV屬于痘病毒科副痘病毒屬,為雙股DNA病毒,共包含130多個基因[6]。由末端基因區(qū)(ORFVs001-008和ORFVs112-134)和中間核心基因區(qū)(ORFVs009-111)組成,中間核心區(qū)包含眾多保守基因,多與病毒的復(fù)制和形態(tài)相關(guān),末端基因區(qū)多為非保守基因,與病毒毒力和致病性相關(guān)[7-9]。其中末端基因中包括5種編碼錨蛋白的基因,分別為ORFV008、ORFV123、ORFV126、ORFV128和ORFV129。ORFV129蛋白與其他ORFV錨蛋白具有相似的結(jié)構(gòu),包含多個錨蛋白重復(fù)基序(ANKs)和1個F-Box樣結(jié)構(gòu)域[10-11]。ORFV129蛋白的功能目前不清楚,而蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的發(fā)揮往往與該蛋白的亞細胞定位密切相關(guān)[12]。本研究旨在克隆羊口瘡病毒ORFV129基因全長,并對其進行生物信息學(xué)分析。進一步構(gòu)建真核表達載體pEGFP-ORFV129,轉(zhuǎn)染新生山羊睪丸原代細胞研究該蛋白在細胞中的定位特征,為進一步研究ORFV129在誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答中的作用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 毒株、菌株、真核質(zhì)粒和細胞

    羊口瘡病毒JYY-ORFV株、新生山羊睪丸原代細胞和pEGFP-N1載體及大腸桿菌DH5α購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。

    1.2 主要試劑及儀器

    PremixTaq、DL2000 DNA Marker、T4DNA連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa);Hind Ⅲ、PstⅠ購自上海玉博生物科技有限公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自美國Omega公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和OPTI-MEM 1(1X)均購自美國Gibco公司;RAPI裂解液、廣譜蛋白酶抑制劑、廣譜磷酸酶抑制劑、組織固定液、一抗鼠源GFP、一抗兔源GADPH均購自武漢博士德生物工程有限公司;HRP標記的山羊抗鼠IgG購自武漢亞科因生物技術(shù)有限公司;HRP標記的山羊抗兔IgG購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司;DAPI核酸染料、LipoGeneTM2000均購自US Everbright?Inc.(簡稱UE)公司;Triton X-100、DNase Ⅰ均購自廣州賽國生物科技有限公司;熒光倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯(Olympus Corporation);激光共聚焦顯微鏡購自德國卡爾·蔡司公司股份公司(Carl Zeiss AG)。

    1.3 ORFV129基因全長的克隆鑒定及生物信息學(xué)分析

    參照GenBank中登錄的羊口瘡病毒SY 17株ORFV129(登錄號:MG 712417.1),運用Primier Primer 5設(shè)計1對特異性引物。上游引物:5′-AACGCCACGCCATGGACGC-3′;下游引物:5′-GATGGGCAGTCACTCGGGCG-3′,引物由上海生工生物工程有限公司合成。選取接種了ORFV且具有明顯細胞病變的新生山羊睪丸原代細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次,12 000 r/min離心2 min,留上清,使用DNA提取試劑盒提取病毒DNA。以提取的病毒DNA為模板,使用上下游引物進行PCR反應(yīng),特異性擴增全長ORFV129基因。反應(yīng)體系:Pre mix Taq 10 μL,上、下游引物各1 μL,模板1 μL,其余用ddH2O補足20 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán);72 ℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,切膠回收產(chǎn)物連接pMD19-T載體,并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,提取質(zhì)粒后陽性的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序后保存?zhèn)溆茫瑢㈣b定正確的質(zhì)粒命名為pMD19-ORFV129。對測序鑒定正確的ORFV129全基因序列進行相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測:使用SMART(http://smart.emblheidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)軟件進行一級結(jié)構(gòu)分析;使用TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)軟件進行跨膜區(qū)域分析;使用在線軟件SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽分析以及在線軟件WOLF(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行蛋白亞細胞定位的預(yù)測。

    1.4 融合表達ORFV129基因真核重組表達載體的構(gòu)建及鑒定

    參照ORFV SY 17株ORFV129(登錄號:MG 712417.1),運用Primier Primer 5設(shè)計引物。上游引物5′-AAGCTTATGGACGCCGCCGAGATGGAGGAGCTCGACATC-3′(劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點);下游引物5′-CTGCAGCTCGGGCGCGCGGCGGTCGCACGAGCGGCGC-3′(劃線部分為PstⅠ酶切位點),引物由上海生工生物工程有限公司合成。以1.3中質(zhì)粒pMD19-ORFV129為模板,PCR擴增帶酶切位點的129基因,反應(yīng)體系及條件同1.3,1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,切膠回收產(chǎn)物。將膠回收產(chǎn)物和載體pEGFP-N1分別使用Hind Ⅲ、PstⅠ進行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后,T4DNA連接酶16 ℃金屬儀連接過夜,轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細胞,提取質(zhì)粒后經(jīng)PCR、雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序后保存?zhèn)溆茫瑢㈣b定正確的質(zhì)粒命名為pEGFP-ORFV129。

    1.5 pEGFP-ORFV129重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染新生山羊睪丸原代細胞

    將生長良好的新生山羊睪丸原代細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板,待細胞匯合度達70%~90%時,按照LipoGeneTM2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書,通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組表達質(zhì)粒pEGFP-ORFV129轉(zhuǎn)染至生長良好的新生山羊睪丸原代細胞,以空載體pEGFP-N1為轉(zhuǎn)染對照,并以正常生長的細胞為非轉(zhuǎn)染空白對照。

    1.6 檢測pEGFP-ORFV129重組質(zhì)粒在睪丸細胞的mRNA表達

    在轉(zhuǎn)染12~24 h后,將轉(zhuǎn)染空載pEGFP-N1和融合載體pEGFP-ORFV129的細胞培養(yǎng)板置于熒光倒置顯微鏡下,觀察pEGFP-ORFV129融合蛋白在睪丸細胞中的瞬時表達情況。對于檢測轉(zhuǎn)錄動力學(xué),在轉(zhuǎn)染48 h后,用TRIzol法提取細胞總RNA,并用DNase Ⅰ消化殘留于總RNA中的DNA,總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進行PCR擴增,擴增引物和條件同1.4,1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測ORFV129基因在細胞中ORFV復(fù)制期間的mRNA表達。

    1.7 檢測ORFV129蛋白在羊睪丸細胞中的蛋白表達

    將生長良好的睪丸細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板上,設(shè)3組,每組2個重復(fù),分別為空白對照組、pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組(4.0 μg)、pEGFP-ORFV129轉(zhuǎn)染組(4.0 μg)。轉(zhuǎn)染36 h后,將貼壁細胞刮取到1.5 mL的離心管,將廣譜蛋白酶抑制劑:RAPI細胞裂解液按照1∶100的比例混勻的細胞裂解液加入裝有細胞的離心管,在超聲波破碎儀作用下破碎,離心,收集蛋白。隨后,將提取的細胞總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,經(jīng)5%(m/V)脫脂奶中,4 ℃封閉過夜。隨后分別加入鼠源GFP(1∶400)和兔源GADPH(1∶1 000),室溫孵育2 h,10 min/次TBST(3次)的洗膜。利用HRP標記山羊抗鼠IgG(1∶400)和HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶400),室溫孵育2 h。TBST洗膜3次,隨后使用ECL試劑顯色,成像。

    1.8 融合蛋白ORFV129的亞細胞定位

    將睪丸細胞培養(yǎng)于含有蓋玻片的6孔細胞培養(yǎng)板,待細胞匯合度達70%~90%時,轉(zhuǎn)染重組表達質(zhì)粒pEGFP-ORFV129,以空載體pEGFP-N1為對照,重組表達質(zhì)粒組和空載體組每組設(shè)2個平行。轉(zhuǎn)染48 h后吸盡培養(yǎng)液,預(yù)冷PBS洗3次,4%的多聚甲醛室溫孵育15 min,預(yù)冷PBS洗3次;0.1%的Triton X-100室溫孵育10 min,預(yù)冷PBS洗3次;加入10~50 μmol/L DAPI核酸染料,室溫孵育15 min,預(yù)冷PBS洗2次;取出蓋玻片,將其貼于含有封片劑的載玻片上,于激光共聚焦顯微鏡下觀察ORFV129在細胞內(nèi)的分布情況,分析其亞細胞定位。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ORFV129基因的PCR擴增、克隆鑒定及生物信息學(xué)分析

    成功擴增ORFV129基因片段,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測可見與預(yù)期大小(1 551 bp)相符的目的片段(圖1-A)。膠回收克隆轉(zhuǎn)化后,進行菌落PCR,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,與預(yù)期ORFV129基因的大小相符(圖1-B)。測序結(jié)果顯示,與NCBI上收錄的同一病毒的不同毒株基因序列相似性均在99%以上。利用DNAStar軟件分析發(fā)現(xiàn),ORFV129基因共編碼516個氨基酸。SMART分析顯示,ORFV129基因共含有8個ANK基序,分別位于49-80 aa,85-117 aa,123-157 aa,161-192 aa,196-227 aa,231-262 aa,266-297 aa,302-331 aa(圖2-A)??缒^(qū)域分析顯示,ORFV129蛋白不存在跨膜區(qū)域,推測其可能作為胞內(nèi)蛋白而起作用(圖2-B)。通過WoLFPSORT在線比對軟件預(yù)測ORFV129蛋白的亞細胞定位,結(jié)果顯示蛋白質(zhì)主要定位于細胞質(zhì)(圖2-C)。

    M. 相對分子質(zhì)量標準(2 000 bp DNA ladder);P. 陽性對照;N. 陰性對照;1-5. ORFV129基因;A. ORFV129基因的PCR擴增;B. 重組質(zhì)粒pMD-19T-ORFV129 的PCR擴增。

    A. ORFV129蛋白的一級結(jié)構(gòu)分析;B. ORFV129蛋白的跨膜區(qū)域分析;C. ORFV129蛋白的亞細胞定位分析。A. Predicted primary-structure of ORFV129 protein;B. Predicted transmembrane region of ORFV129 protein;C. Predicted subcellular localization of ORFV129 protein.

    2.2 融合表達ORFV129基因真核重組表達載體的構(gòu)建及鑒定

    使用帶Hind Ⅲ、PstⅠ酶切位點的引物進行PCR擴增,結(jié)果顯示片段大小約為1 600 bp,與預(yù)期的片段大小(1 560 bp)相符合。隨后,膠回收后定向克隆至pEGFP-N1構(gòu)建融合重組質(zhì)粒pEGFP-ORFV129,經(jīng)雙酶切鑒定表明構(gòu)建的質(zhì)粒正確(圖3)。

    M. 相對分子質(zhì)量標準(1 kb DNA ladder);1. pEGFP-ORFV129的Hind Ⅲ、Pst Ⅰ雙酶切鑒定。M. Relative molecular mass (1 kb DNA ladder);1. pEGFP-ORFV129 digested by Hind Ⅲ and Pst Ⅰ.

    2.3 pEGFP-ORFV129重組質(zhì)粒在睪丸細胞ORFV復(fù)制期間的mRNA表達分析

    轉(zhuǎn)染12~24 h后,將融合載體pEGFP-ORFV129和空載體pEGFP-N1置于熒光倒置顯微鏡下,均能觀察到綠色熒光(圖4)。mRNA表達檢測發(fā)現(xiàn),細胞總RNA經(jīng)RT-PCR擴增后,可見與預(yù)期ORFV129基因大小相似的目的條帶(圖5),表明ORFV129基因在細胞中ORFV復(fù)制期間發(fā)生了轉(zhuǎn)錄。

    A. 轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載的新生山羊睪丸原代細胞;B. 轉(zhuǎn)染pEGFP-ORFV129的新生山羊睪丸原代細胞。A. Testis cells of newborn goat transfected with pEGFP-N1;B. Testis cells of newborn goat transfected with pEGFP-ORFV129.

    M.相對分子質(zhì)量標準(2 000 bp DNA ladder);P.陽性對照;N.無模板對照;1.ORFV129基因。M.Relative molecular mass (2 000 bp DNA ladder);P.Positive product;N.No template control;1.ORFV129 gene.

    2.4 融合蛋白ORFV129在羊睪丸細胞中的表達

    將 pEGFP-N1和pEGFP-ORFV129重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染羊睪丸原代細胞36 h后,Western Blot 結(jié)果顯示,空白對照組中沒有GFP蛋白的表達,而轉(zhuǎn)染了pEGFP-ORFV129重組質(zhì)粒的山羊睪丸原代細胞中檢測到了ORFV129-GFP蛋白(75 ku

    圖6 ORF129蛋白表達的Western Blot鑒定Fig.6 Western Blot identification of ORF129 protein

    2.5 融合蛋白ORFV129-GFP的亞細胞定位

    將 pEGFP-N1和pEGFP-ORFV129重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染羊睪丸原代細胞24 h后,經(jīng)染料DAPI對細胞核進行藍染,激光共聚焦顯微鏡下分析ORFV129蛋白在細胞內(nèi)的定位情況。結(jié)果顯示,在表達pEGFP-N1的細胞內(nèi),綠色熒光彌散性分布于整個細胞;而在表達pEGFP-ORFV129的睪丸細胞中,綠色熒光呈點狀地分布于細胞質(zhì)(圖7)。

    A. 轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的睪丸細胞明場觀察;B.轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的睪丸細胞綠色熒光觀察;C. DAPI 染色后細胞核;D. 圖B和C的合并;E. 轉(zhuǎn)染pEGFP-ORFV129的睪丸細胞明場觀察;F. 轉(zhuǎn)染pEGFP-ORFV129的睪丸細胞綠色熒光觀察;G. DAPI 染色后細胞核;H. 圖F和G的合并。

    3 討論與結(jié)論

    錨蛋白重復(fù)序列 (Ankyrinrepeat,ANKs )是普遍存在于生物體中的一種由33個氨基酸殘基基序組成的蛋白質(zhì)序列模體,由2個α螺旋和1個Loop區(qū)構(gòu)成,在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞骨架完整性、細胞周期調(diào)控、免疫應(yīng)答、蛋白轉(zhuǎn)運等過程中均具有重要作用[13-14]。ANKs不僅存在生物體,也存在于痘病毒編碼的蛋白,而其他病毒幾乎不編碼錨蛋白。錨蛋白作為痘病毒編碼的蛋白中最大的家族,其特征是具有ANKs的N末端和1個F-Box樣的C末端結(jié)構(gòu)域[15-17]。已有研究報道,痘病毒編碼的錨蛋白主要功能是可通過多層次的方式來影響NF-κB信號通路。例如,天花病毒(Variola,VARV)編碼的蛋白G1R,痘苗病毒(Vacciniavirus,VACV)編碼的蛋白CP77,兩者均可通過其N端的ANK重復(fù)基序,分別與NF-κB1/p105、NF-κB p65蛋白直接或間接結(jié)合抑制宿主NF-κB的活化[18-20]。2004年,Shisler等[21-22]發(fā)現(xiàn)VACV編碼的蛋白K1L可通過競爭與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的結(jié)合,阻止IκBα的降解,從而抑制NF-κB的活化。同時,該團隊也證實K1L蛋白能通過阻礙IKK的磷酸化從而抑制NF-κB的活化。因此,KIL蛋白準確的抑制機制仍然需進一步的研究。VACA A52和K7蛋白均能與腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子6(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6)相互作用,間接抑制NF-κB的激活[23]。羊口瘡病毒編碼的蛋白ORFV119,能通過與視網(wǎng)膜瘤蛋白相互作用抑制IKK的活化,從而抑制NF-κB信號通路的活化[24]。2014年,Lamb等[25]發(fā)現(xiàn),黏液瘤病毒(Myxomavirus,MYXV)編碼的錨蛋白M-T 5、M148R、M149R和M150R均能抑制NF-κB p65蛋白從細胞質(zhì)遷移到細胞核,減少細胞核內(nèi)NF-κB p65的聚集,抑制或者降低NF-κB信號通路的活性。同樣VACV編碼的錨蛋白K1L可通過對NF-κB信號途徑不同位點的作用而調(diào)控宿主的天然抗病毒免疫應(yīng)答[26]。

    對于ORFV編碼的5種錨蛋白,ORFV008蛋白可通過阻止IκBα蛋白磷酸化降解過程而抑制細胞NF-κB p65蛋白核移位,從而減弱細胞NF-κB信號通路的活化[27]。ORFV128蛋白在病毒感染早期表達且定位于宿主的細胞核,通過抑制IκBα蛋白磷酸化降解過程,阻止NF-κB p65蛋白核移位,進而抑制宿主NF-κB信號通路的活化[28]??梢姡徊《緝?nèi)具有ANKs基序的錨蛋白,能通過對NF-κB信號途徑的不同位點的作用而調(diào)控宿主的天然抗病毒免疫應(yīng)答。羊口瘡病毒ORFV129基因編碼的錨蛋白具有典型的N末端多個ANK重復(fù)序列和1個F-Box的C末端結(jié)構(gòu)域。2013年,白剛等[10]利用真核表達系統(tǒng)對ORFV129基因編碼的蛋白進行表達并篩選出穩(wěn)定表達ORFV129基因的細胞株,為研究ORFV129蛋白調(diào)控宿主天然免疫應(yīng)答的作用機制奠定了基礎(chǔ)。2016年,葛士坤等[29]對ORFV129基因序列及其編碼蛋白進行生物信息學(xué)分析,該結(jié)果為深入研究ANK在ORFV致病過程中的作用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。對于ORFV編碼的129錨蛋白功能目前不清楚,這也正是本研究選擇ORFV129蛋白作為研究切入點的重要原因。本研究克隆了羊口瘡病毒ORFV129基因全序列,對其進行生物信息學(xué)分析;進一步構(gòu)建真核表達載體pEGFP-ORFV129,并將其轉(zhuǎn)染新生山羊睪丸原代細胞,以空載體pEGFP-N1作為陰性對照,借助激光共聚焦顯微鏡觀察了ORFV129在細胞中的定位;亞細胞定位發(fā)現(xiàn)ORFV129分布于細胞質(zhì)中。ORFV編碼的其他錨蛋白,如ORFV126蛋白表達后靶向定位于線粒體內(nèi),且ORFV126編碼的AR8和AR9對錨蛋白定位于線粒體內(nèi)起著關(guān)鍵性的作用[30]。ORFV128蛋白表達后靶向定位于細胞核中[17]。ORFV129蛋白是否類似于ORFV126,定位于細胞質(zhì)內(nèi)的線粒體,或者其蛋白功能是否與ORFV128的不一致,目前仍不清楚,需要進一步的研究。

    本研究成功克隆得到羊口瘡病毒ORFV129基因的全長,定位在新生山羊睪丸原代細胞細胞質(zhì)中,這些結(jié)果為進一步研究ORFV129在誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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