野生樹鼩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化過程中糞便菌群的多樣性及組成

張飛燕，金潔，馬玉華，陳佳琪，謝麗分，張曉迪，鄔繼文，呂龍寶,2

野生樹鼩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化過程中糞便菌群的多樣性及組成

張飛燕1，金潔1，馬玉華1，陳佳琪1，謝麗分1，張曉迪1，鄔繼文1，呂龍寶1,2*

(1.中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，云南 昆明 650000；2.中國科學(xué)院昆明靈長類研究中心，云南 昆明 650223)

從云南昆明西郊野外捕捉6只成年野生樹鼩，于中國科學(xué)院昆明靈長類研究中心人工馴養(yǎng)6個(gè)月。于剛捕捉回(野生組)和人工馴養(yǎng)6個(gè)月(馴養(yǎng)組)時(shí)，收集新鮮糞便樣本，共12份，運(yùn)用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，以16S rRNA的V3–V4區(qū)域?yàn)槟繕?biāo)進(jìn)行高通量測(cè)序，比較分析樹鼩在人工馴養(yǎng)前后糞便菌群的多樣性及組成。結(jié)果表明：樹鼩糞便菌群的OTU多樣性Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，野生組樹鼩糞便菌群的OTU豐富度Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Sobs指數(shù)均顯著高于馴養(yǎng)組的；PCoA主成分分析結(jié)果顯示，野生樹鼩與人工馴養(yǎng)樹鼩的糞便菌群具有明顯的差異，但同組內(nèi)個(gè)體間的菌群差異不明顯；在門水平上，樹鼩糞便的優(yōu)勢(shì)菌門主要有厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門，但其在不同組樹鼩糞便菌群的相對(duì)豐度不同；在綱水平上，野生組菌群主要有芽孢桿菌綱和擬桿菌綱，馴養(yǎng)組菌群主要有擬桿菌綱、梭菌綱和厭氧菌綱，γ–變形菌綱、厭氧菌綱相對(duì)豐度在2組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)；在目水平上，野生組菌目主要有乳桿菌目和擬桿菌目，馴養(yǎng)組菌目主要有擬桿菌目和梭菌目，馴養(yǎng)組的Selenomonadales相對(duì)豐度顯著高于野生組的(<0.05)；在科水平上，野生組菌科主要有鏈球菌科和普雷沃氏菌科，馴養(yǎng)組菌科主要有普雷沃氏菌科和韋榮氏球菌科，馴養(yǎng)組的韋榮氏球菌科相對(duì)豐度顯著高于野生組的(<0.05)；在屬水平上，野生組菌屬主要有鏈球菌屬和乳球菌屬，馴養(yǎng)組菌屬主要有普雷沃菌屬和巨單胞菌屬，野生組的鏈球菌屬相對(duì)豐度極顯著高于馴養(yǎng)組的(<0.01)，馴養(yǎng)組的巨單胞菌屬相對(duì)豐度顯著高于野生組的(<0.05)?？梢?，野生樹鼩經(jīng)過人工馴養(yǎng)后，糞便微生物區(qū)系中的一些菌群發(fā)生了變化，菌群結(jié)構(gòu)與野生組有差異，但不顯著，糞便菌群結(jié)構(gòu)變化呈簡單化的趨勢(shì)。

樹鼩；人工馴養(yǎng)；糞便；菌群組成

寄生在動(dòng)物消化系統(tǒng)中的微生物種群數(shù)量繁多，種類龐大。一般來說，細(xì)菌占糞便干重的40%~45%，總數(shù)可以達(dá)到1011cfu/g[1–3]。腸道微生物在宿主的能量代謝中起重要作用，并影響宿主的免疫系統(tǒng)[4-5]。相反，腸道菌群的組成也受宿主基因型、飲食、年齡、社會(huì)環(huán)境、抗生素使用情況、宿主消化道結(jié)構(gòu)及不同發(fā)育階段等多種因素的影響[6]。根據(jù)微生物與宿主的關(guān)系，可以將微生物分為有益微生物、條件致病微生物、病原微生物3大類[7]。其中，有益微生物對(duì)動(dòng)物機(jī)體具有生理作用，是機(jī)體正常生命活動(dòng)必不可少的組成部分[8-9]。特別是腸道中的雙歧桿菌，不產(chǎn)生毒素，無侵襲性，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的對(duì)人體具有生理作用而無致病作用的細(xì)菌[10]。

樹鼩是生長于熱帶和亞熱帶地區(qū)的低等靈長類動(dòng)物。由于樹鼩體型小，孕期短，解剖學(xué)和生理學(xué)較其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物更接近于人，正日益受到國內(nèi)外科技人員的關(guān)注，將其應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中。隨著生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，樹鼩作為新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廣泛用于生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)及生命科學(xué)的諸多領(lǐng)域，尤其是作為人類重大疾病的動(dòng)物模型。然而，目前只有實(shí)驗(yàn)樹鼩微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)的地方和團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，還沒有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化研究滯后，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)用樹鼩發(fā)展緩慢[11-12]。制定出完善的人工馴養(yǎng)環(huán)境中樹鼩攜帶微生物的國家標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫。雖然已有對(duì)樹鼩腸道菌群的研究報(bào)道，但這些研究多采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)及分子指紋圖譜的方法。這些方法的局限性使獲得的信息量少且不夠深入。高通量測(cè)序技術(shù)因其準(zhǔn)確性高、快速和信息量大等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物的微生物研究。利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樹鼩腸道微生物的研究具有重要的意義，可為樹鼩微生物學(xué)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。樹鼩腸道菌群的多樣性受飲食和生活環(huán)境等多種因素的影響。本研究中，從云南昆明野外捕捉6只樹鼩，并于中國科學(xué)院昆明靈長類研究中心人工馴養(yǎng)6個(gè)月，采集剛捕回和馴養(yǎng)后的樹鼩的新鮮糞便，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)糞便內(nèi)細(xì)菌的多樣性進(jìn)行分析，比較野生樹鼩在人工馴養(yǎng)前后糞便菌群的變化，探討其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　樣品采集

從云南昆明西郊野外捕捉6只成年野生樹鼩，飼養(yǎng)于中國科學(xué)院昆明靈長類研究中心的普通級(jí)環(huán)境中。飼喂全價(jià)顆粒飼料，并輔以水果。于剛捕捉回(野生組)和人工馴養(yǎng)6個(gè)月(馴養(yǎng)組)時(shí)，收集新鮮糞便樣本。樣品置于液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室，于–80 ℃冰箱保存，備用。野生樹鼩獲得的途徑和方法保證了動(dòng)物的福利，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2　文庫構(gòu)建及測(cè)序

按照OMEGA EZNA試劑盒說明書提取樹鼩糞便樣本的細(xì)菌基因組。針對(duì)16sRNA的V3–V4區(qū)擴(kuò)增引物合成帶有barcode的特異引物。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN)切膠回收PCR產(chǎn)物；純化后的樣品使用Thermofisher的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建；構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測(cè)合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL測(cè)序。測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥有限公司利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)完成。

1.3　生物信息分析流程

測(cè)序后的數(shù)據(jù)先運(yùn)用Cutadapt(V1.9.1，http:// cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)處理得到有效數(shù)據(jù)；再利用Uparse(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/ uparse/)對(duì)所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為分類單元(OTU)。通過聚類操作，基于樣品OTUs數(shù)與測(cè)試的深度變化的關(guān)系，分析α多樣性，并繪制稀釋曲線；基于unweighted UniFrac distances的PCoA，分析β多樣性。對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur法與SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋分析，獲得在各個(gè)分類水平(門、綱、目、科、屬)上各樣本的群落組成。運(yùn)用Student檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對(duì)2組樣本微生物群落之間的物種進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，評(píng)估物種豐度差異的顯著性水平，獲得2組間具有顯著性差異的物種；進(jìn)行LEfSe多級(jí)物種差異判別分析，采用線性判別分析(LDA)來估算每個(gè)組分(物種)豐度對(duì)差異效果影響的大小。

2　結(jié)果與分析

2.1　測(cè)序收獲水平

檢測(cè)的12個(gè)樣本共獲得671 994條序列，平均每個(gè)樣本獲得55 999條序列。這些序列屬于10個(gè)門、17個(gè)綱、32個(gè)目、58個(gè)科、129個(gè)屬和188個(gè)種。通過物種韋恩圖分析顯示，野生組樹鼩糞便樣本和馴養(yǎng)組的樣本共享115個(gè)OTUs，野生組獨(dú)有57個(gè)OTUs，馴養(yǎng)組獨(dú)有16個(gè)OTUs。

2.2　樹鼩糞便菌群的多樣性

2.2.1α多樣性和豐富度指數(shù)

從表1可知，樹鼩糞便菌群的OTU豐富度Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Sobs指數(shù)組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)；樹鼩糞便菌群的OTU多樣性Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明野生樹鼩經(jīng)人工馴養(yǎng)后，糞便菌群的多樣性變化不明顯，而豐富度顯著下降。

表1　樹鼩糞便菌群的α多樣性和豐富度指數(shù)

隨著測(cè)序深度的增加，2組樣本的稀釋曲線(圖1)都趨于平緩，且2組樣本的覆蓋度分別達(dá)99.97%、99.96%，說明對(duì)糞便樣本微生物群落的檢測(cè)比率接近飽和，目前的測(cè)序量能覆蓋樣本中的絕大部分物種。同時(shí)也反映了在樹鼩人工馴養(yǎng)繁殖過程中，腸道微生物豐富度逐漸下降。

圖1　樹鼩糞便菌群的物種稀釋曲線

2.2.2β多樣性

PCoA分析中，第1個(gè)主坐標(biāo)(PC1)捕獲了54.30%的變異，第2個(gè)主坐標(biāo)(PC2)捕獲了24.25%的變異，野生組聚在一邊，人工馴養(yǎng)6個(gè)月后的聚在一邊(圖2)。可見，人工馴養(yǎng)后樹鼩和野生樹鼩糞便的細(xì)菌群落組成存在明顯差異，但同組內(nèi)6個(gè)樣本間差異不大。

圖2　樹鼩糞便菌群的PCoA分析結(jié)果

2.3　不同分類水平上的樹鼩糞便菌群的物種組成

2.3.1門水平上的物種差異

如表2所示，在門水平上，野生組糞便中厚壁菌門(Firmicutes)的平均相對(duì)豐度最高(68.57%)，占主要地位，其次是擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)，此3個(gè)門的平均相對(duì)豐度和為96.82%；馴養(yǎng)組糞便中擬桿菌門的平均相對(duì)豐度最高(52.69%)，占主要地位，其次是厚壁菌門(42.76%)，此2個(gè)門的相對(duì)豐度和為95.45%；野生組鑒定出Saccharibacteria，馴養(yǎng)組鑒定出Deinococcus–Thermus?？梢?，在門水平上，2組樣本的優(yōu)勢(shì)物種相同，但相對(duì)豐度不同。

表2　門水平上樹鼩糞便菌群的相對(duì)豐度

2.3.2綱水平上的物種差異

如表3所示，在綱水平上，野生組糞便菌群主要有芽孢桿菌綱(Bacilli)和擬桿菌綱(Bacteroidia)，平均相對(duì)豐度分別為54.76%和20.13%；馴養(yǎng)組糞便菌群主要有擬桿菌綱，其次是梭菌綱(Clostridia)和厭氧菌綱(Negativicutes)，平均相對(duì)豐度分別為52.61%、18.07%和16.67%；野生組的γ–變形菌綱(Gammaproteobacteria)的平均相對(duì)豐度顯著高于馴養(yǎng)組的(＜0.05)，馴養(yǎng)組的厭氧菌綱的平均相對(duì)豐度顯著高于野生組的(＜0.05)，野生組的芽孢桿菌綱的平均相對(duì)豐度(54.76%)高于馴養(yǎng)組的(7.08%)，但二者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3　綱水平上樹鼩糞便菌群的相對(duì)豐度

2.3.3目水平上的物種差異

如表4所示，在目水平上，野生組糞便菌目主要有乳桿菌目(Lactobacillales)和擬桿菌目(Bacteroidales)，平均相對(duì)豐度分別為49.68%和20.13%；馴養(yǎng)組糞便菌目主要有擬桿菌目和梭菌目(Clostridiales)，平均相對(duì)豐度分別為52.61%和18.07%；馴養(yǎng)組的Selenomonadales的相對(duì)豐度顯著高于野生組的(<0.05)。

表4　目水平上樹鼩糞便菌群的相對(duì)豐度

2.3.4科水平上的物種差異

如表5所示，在科水平上，野生組樹鼩糞便菌科主要有鏈球菌科(Streptococcaceae)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)，平均相對(duì)豐度分別為40.02%和12.01%；馴養(yǎng)組樹鼩糞便菌科主要有普雷沃氏菌科和韋榮氏球菌科(Veillonellaceae)，平均相對(duì)豐度分別為42.08%和15.47%；馴養(yǎng)組的韋榮氏球菌科的相對(duì)豐度顯著高于野生組的(<0.05)。

表5　科水平上樹鼩糞便菌群的相對(duì)豐度

2.3.5屬水平上的物種差異

如表6所示，在屬水平上，野生組樹鼩糞便的主要菌屬有鏈球菌屬()和乳球菌屬()，平均相對(duì)豐度分別為19.84%和19.35%；馴養(yǎng)組樹鼩糞便的主要菌屬有普雷沃菌屬()和巨單胞菌屬()，平均相對(duì)豐度分別為40.45%和15.38%；野生組的鏈球菌屬相對(duì)豐度極顯著高于馴養(yǎng)組的(<0.01)，馴養(yǎng)組的巨單胞菌屬的相對(duì)豐度顯著高于野生組的(<0.05)。

表6　屬水平上樹鼩糞便菌群的相對(duì)豐度

2.4　LEfSe多級(jí)物種差異判別分析結(jié)果

從圖3可知，當(dāng)LDA閾值為4時(shí)，野生組和馴養(yǎng)組糞便內(nèi)分別發(fā)現(xiàn)12個(gè)和7個(gè)相對(duì)豐度差異的分類群；野生組中芽孢桿菌綱、乳桿菌目(Lactobacillales)鏈球菌科、乳球菌屬顯著富集，馴養(yǎng)組中厭氧菌綱、Selenomonadales、韋榮氏球菌科、巨單胞菌屬顯著富集。

圖3　組間菌群差異線性分析(LEfSe)結(jié)果

3　結(jié)論與討論

本研究中，稀釋曲線及樣品檢測(cè)的覆蓋度達(dá)99.97%，說明對(duì)所取樣本微生物群落的檢測(cè)比率接近飽和，測(cè)序量能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種。野生組OTU豐富度(Chao指數(shù)、Sobs指數(shù)、Ace指數(shù))顯著高于馴養(yǎng)組的，這可能是由于馴養(yǎng)組樹鼩長期生活在人工定制的環(huán)境中，飼料、飲水、飼養(yǎng)籠具、墊料飼養(yǎng)工具、室內(nèi)外及周圍長期使用各種消毒劑或滅菌等，導(dǎo)致馴養(yǎng)組樹鼩生活的環(huán)境存在的微生物豐富度降低。樹鼩糞便中的微生物與微生物存在的環(huán)境有密切的關(guān)系，樹鼩生存環(huán)境中存在的微生物也影響著樹鼩糞便微生物的組成。另外，從飲食的角度來看，馴養(yǎng)組樹鼩的飼料主要是全價(jià)飼料、水果、面包蟲、雞蛋等，而野外樹鼩主要以蟲類為主，還食用一些幼鳥、鳥蛋、谷類、果類、樹葉等，推測(cè)由于飲食的變化也影響了糞便菌群的組成。2組樣本檢測(cè)到的菌群多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一般環(huán)境改變1個(gè)月，即可形成穩(wěn)定的菌群[13]。本研究選擇人工馴養(yǎng)6個(gè)月后進(jìn)行采樣，發(fā)現(xiàn)野生組樹鼩經(jīng)過人工馴養(yǎng)后，糞便微生物區(qū)系中的一些菌群發(fā)生變化，菌群結(jié)構(gòu)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明人工馴養(yǎng)6個(gè)月后的樹鼩糞便菌群已趨于穩(wěn)定，可以適應(yīng)環(huán)境一定的改變，同時(shí)也說明中國科學(xué)院昆明靈長類研究中心提供的飼料能滿足其生活要求。

通過比較不同分類水平上的物種組成發(fā)現(xiàn)，在門水平上，優(yōu)勢(shì)菌門主要為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門，但2組間的相對(duì)豐度不同，野生樹鼩經(jīng)人工馴養(yǎng)6個(gè)月后，擬桿菌門的相對(duì)豐度明顯升高。有研究[13]報(bào)道，長期食用高動(dòng)物蛋白、高脂肪的人，其腸道內(nèi)擬桿菌數(shù)量較多。野生樹鼩經(jīng)人工馴養(yǎng)飼喂的是全價(jià)飼料，全價(jià)飼料含的粗蛋白和脂肪都比較高，推測(cè)擬桿菌門的相對(duì)豐度升高可能是由于飲食的改變所致。在綱水平上，野生組γ–變形菌綱的相對(duì)豐度顯著高于馴養(yǎng)組的(＜0.05)，馴養(yǎng)組厭氧菌綱的相對(duì)豐度顯著高于野生組的。芽孢桿菌綱在2組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但野生組的芽孢桿菌綱相對(duì)豐度為54.76%，明顯高于馴養(yǎng)組的7.08%。在目和科水平上，馴養(yǎng)組Selenomonadales、韋榮氏球菌科的相對(duì)豐度顯著高于野生組的(<0.05)。在屬水平上，野生組鏈球菌屬的相對(duì)豐度極顯著高于馴養(yǎng)組的(<0.01)，而馴養(yǎng)組中巨單胞菌屬的相對(duì)豐度顯著高于野生組的(<0.05)。乳球菌屬為野生組的優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度為19.35%，而馴養(yǎng)組的乳球菌屬相對(duì)豐度僅為0.29%。乳球菌屬細(xì)菌比較常見，無致病性，是腸道內(nèi)正常菌群之一。馴養(yǎng)組的乳球菌屬所占的比例明顯降低，這是否是人工馴養(yǎng)樹鼩的飼養(yǎng)環(huán)境或飲食的改變所致，還值得進(jìn)一步的探討。通過LEfSe分析(LDA閾值為4)發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌綱、乳桿菌目鏈球菌科、乳球菌屬在野生組樣本顯著富集，厭氧菌綱和Selenomonadales、韋榮氏球菌科、巨單胞菌屬在馴養(yǎng)組樣本富集。高家紅等[14]、邢進(jìn)等[15]、劉麗君等[16]、王曉娟等[17]關(guān)于樹鼩腸道菌群的研究顯示，腸道菌群以腸桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬為主。本研究結(jié)果與他們的結(jié)果差異較大，這可能是本研究的樣本為樹鼩糞便，分離出一些厭氧菌，與采的活體樹鼩肛拭子和盲腸內(nèi)容物還是有區(qū)別所致。

綜上所述，野生樹鼩經(jīng)過人工馴養(yǎng)后，糞便微生物區(qū)系中的一些菌群發(fā)生了變化，菌群結(jié)構(gòu)有差異，但不顯著。人工馴養(yǎng)后糞便菌群結(jié)構(gòu)變化呈簡單化的趨勢(shì)。

[1] AKIN D E．Biological structure of lignocellulose and its degradation in the rumen[J]．Animal Feed Science and Technology，1988，21(2/3/4)295–310．

[2] BARTOSCH S，F(xiàn)ITE A，MACFARLANE G T，et al. Characterization of bacterial communities in feces from healthy elderly volunteers and hospitalized elderly patients by using real-time PCR and effects of antibiotic treatment on the fecal microbiota[J]．Applied and Environmental Microbiology，2004，70(6)：3575–3581．

[3] ZHU H，ZENG D，WANG N，et al．Microbial community and diversity in the feces of Sichuan takin() as revealed by Illumina Miseq sequencing and quantitative real-time PCR[J]．AMB Express，2018，8：68．

[4] 時(shí)云朵，孫豪，曾東，等．腸道菌群與腸道免疫系統(tǒng)相互作用研究進(jìn)展[J]．飼料博覽，2017(9)：7–10． SHI Y D，SUN H，ZENG D，et al．Interaction between gut microbiota and intestinal immune system[J]．Feed Review，2017(9)：7–10．

[5] 李菊，張日俊．動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)與代謝化學(xué)成分的相互關(guān)系[J]．中國微生態(tài)學(xué)雜志，2008，20(2)：189–190． LI J，ZHANG R J．Interaction between intestinal flora structure and metabolic chemical components in animals [J]．Chinese Journal of Microecology，2008，20(2)：189–190．

[6] 周雪雁，劉翊中，陳軼霞，等．動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)分析方法進(jìn)展[J]．微生物學(xué)雜志，2013，33(5)：81–86． ZHOU X Y，LIU Y Z，CHEN Y X，et al．Advanced in analysis methods of animal intestinal flora structure[J]. Journal of Microbiology，2013，33(5)：81–86．

[7] 李凡，劉晶星．醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[M]．7版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2008． LI F，Liu J X．Medical microbiology[M]．7th ed．Beijing：People’s Medical Publishing House，2008．

[8] 王進(jìn)波，初佳麗，齊莉莉，等．益生菌與動(dòng)物腸道自由基的關(guān)系[J]．動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，26(12)：3545–3549． WANG J B，CHU J L，QI L L，et al．The relationship between probiotics and animal intestinal free radical[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition，2014，26(12)：3545–3549．

[9] 王美伶．益生菌在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]．飼料與畜牧，2015(9)：42–44． WANG M L．Application of probiotics in animal production[J]．Journal of Feed and Animal Husbandry，2015(9)：42–44．

[10] 郭云霞，王樹香，郝慶紅，等．動(dòng)物腸道微生態(tài)系統(tǒng)及益生菌的營養(yǎng)功能[J]．飼料研究，2009(6)：24–25． GUO Y X，WANG S X，HAO Q H，et al．Nutritional functions of animal intestinal microecosystem and probiotics[J]．Feed Research，2009(6)：24–25．

[11] 張飛燕，金潔，馬玉華，等．利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)分析野生樹鼩糞便微生物多樣性[J]．中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2018，26(6)：786–792． ZHANG F Y， JIN J， MA Y H，et al．Diversity of fecal microbiota in the wild tree shrew assessed using the Illumina MiSeq sequencing platform[J]．Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica，2018，26(6)：786–792．

[12] 沈培清，鄭紅，劉汝文，等中國樹鼩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究進(jìn)展和展望[J]．動(dòng)物學(xué)研究，2011，32(1)：109–114． SHEN P Q，ZHENG H，LIU R W，et al．Progress and prospect in research on laboratory tree shrew in China[J]. Zoological Research，2011，32(1)：109–114．

[13] 劉燕，王曦，劉學(xué)鋒，等．北京動(dòng)物園3只亞成體大熊貓糞便菌群比較分析[J]．野生動(dòng)物學(xué)報(bào)，2018，39(1)：19–23． LIU Y，WANG X，LIU X F，et al．Fecal bacteria diversity of three sub-adult giant panda of the Beijing zoo[J]. Chinese Journal of Wildlife，2018，39(1)：19–23．

[14] 高家紅，江勤芳，羅志武，等．樹鼩正常腸道細(xì)菌的培養(yǎng)分離鑒定及其藥敏試驗(yàn)研究[J]．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(12)：24–26． GAO J H，JIANG Q F，LUO Z W，et al．Culture，isolation and identification of normal intestinal bacterial flora and their antibiotic susceptibility in tree shrew[J]. Chinese Journal of Comparative Medicine，2009，19(12)：24–26．

[15] 邢進(jìn)，馮育芳，付瑞，等．野生樹鼩可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌攜帶情況的調(diào)查[J]．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2012，29(3)：34–38． XING J，F(xiàn)ENG Y F，F(xiàn)U R，et al．The survey of culturable bacteria and fungi in wild tree shrews[J]．Laboratory Animal Science，2012，29(3)：34–38．

[16] 劉麗君，余柄廷，胡凝珠，等．樹鼩糞便細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定[J]．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2015，25(10)：64–68． LIU L J，YU B T，HU N Z，et al．Isolation，culture and identification of bacterial strains from tree shrews feces[J] Chinese Journal of Comparative Medicine，2015，25(10)：64–68．

[17] 王曉娟，楊春，蘇建家．樹鼩在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中的新進(jìn)展[J]．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(2)：67–70． WANG X J，YANG C，SU J J．Development of application of' tree shrew in experimental to medical research[J]．Chinese Journal of Comparative Medicine，2010，20(2)：67–70．

Microbial community and diversity in the feces of wild tree shrew as laboratory animal

ZHANG Feiyan1, JIN Jie1, MA Yuhua1, CHEN Jiaqi1, XIE Lifen1, ZHANG Xiaodi1, WU Jiwen1, LYU Longbao1,2*

(1.Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming, Yunnan 650000, China; 2.Kunming Primate Research Center, Chinese Academy of Sciences, Kunming,Yunnan 650223, China)

To analyze the feces microbial diversity differences between the tree shrews captured from the wild in Kunming and those after six months of feeding at Kunming Primate Research Center, Chinese Academy of Sciences. Twelve fresh samples of feces were collected to extract total bacterial DNA and used Illumina Miseq platform. The α diversity index analysis showed that there Shannon and Simpson index were no significant difference between the wild and the captive groups(＞0.05), while the Chao and Ace index were significant different. The PCoA analysis could distinguish the wild group from the captive group, bacterial populations were similar among six tree shrews. At phylum level, the wild tree shrew possessed similar community structure to the captive tree shrews. Firmicutes, Bacteroidetes and Proteobacteria were dominant. At class level, Bacilli and Bacteroidiawere dominant in the wild groups, while Bacteroidia, Clostridia and Negativicutes were dominant in the captive groups. Gammaproteobacteria and Negativicutes were found significantly different between two groups(＜0.05). At order level, Lactobacillales and Bacteroidales were dominant in the wild groups, Bacteroidales and Clostridiales were dominant in the captive groups.Selenomonadales was found significantly differnte between two groups(＜0.05). At family level, Streptococcaceae and Prevotellaceae were dominant in the wild groups, Prevotellaceae and Veillonellaceae were dominant in the captive groups. Veillonellaceae was found significantly different between two groups. At genus level,andwere dominant in the wild groups,andwere dominant in the captive groups.was found significantly different between two groups(＜0.01),was found significantly different between two groups(＜0.05).in the wild tree shrews was significantly higher than the captive tree shrews. Bacterial populations were similar among the 6 tree shrews. The results prove that the feace flora structure was difference but not significant, indeed the structure of flora has a tendency to complicate in the captive groups.

tree shrew; captive; feces; microbial composition

S852.61

A

1007-1032(2020)04-0449-07

10.13331/j.cnki.jhau.2020.04.011

張飛燕，金潔，馬玉華，陳佳琪，謝麗分，張曉迪，鄔繼文，呂龍寶．野生樹鼩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化過程中糞便菌群的多樣性及組成[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2020，46(4)：449–455．

ZHANG F Y, JIN J, MA Y H, CHEN J Q, XIE L F, ZHANG X D, WU J W, LYU L B. Microbial community and diversity in the feces of wild tree shrew as laboratory animal[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(4): 449–455.

http://xb.hunau.edu.cn

2019–04–17

2019–06–14

張飛燕(1993—)，女，云南陸良人，碩士，主要從事動(dòng)物質(zhì)量控制與檢測(cè)研究，1175905001@qq.com；

，呂龍寶，研究員，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究，lvlongbao@mail.kiz.ac.cn

責(zé)任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正