復(fù)方丹參滴丸通過JAK-STAT 通路對癲癇模型大鼠的保護(hù)機(jī)制研究

趙 宇，劉 洋

(四川大學(xué)華西醫(yī)院特需醫(yī)療中心，四川 成都 614000)

癲癇是臨床常見的慢性、進(jìn)行性、反復(fù)性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，患病率僅次于腦血管疾病，患者大腦神經(jīng)細(xì)胞過度異常放電可導(dǎo)致短暫性大腦功能障礙，造成海馬神經(jīng)元損傷，損害其認(rèn)知功能，并引發(fā)患者焦慮、抑郁等心理障礙，嚴(yán)重威脅其身心健康，給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)[1-2]。目前，臨床主要應(yīng)用丙戊酸鈉、卡馬西平及左乙拉西坦等抗癲癇藥治療該病，但存在療效較差、易形成耐受性和毒副作用大等缺點(diǎn)，而中藥可彌補(bǔ)這些缺陷，在癲癇治療中發(fā)揮著重要作用。復(fù)方丹參滴丸可活血化瘀、理氣止痛，能減輕炎癥反應(yīng)，控制癲癇發(fā)作，改善學(xué)習(xí)記憶功能、修復(fù)海馬神經(jīng)元損傷，在臨床上被廣泛用于治療癲癇，但其藥理機(jī)制目前尚不清楚[3-4]。癲癇的病理機(jī)制復(fù)雜，其中小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化促使炎癥因子產(chǎn)生，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥是其主要發(fā)病機(jī)制[5]。JAK/STAT3信號可介導(dǎo)神經(jīng)炎癥過程，抑制其激活，可減少促炎因子產(chǎn)生，減輕神經(jīng)炎癥，預(yù)防癲癇的發(fā)生，緩解其病情發(fā)展[6-7]。另外，丹參酮 ⅡA可通過抑制JAK/STAT信號逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，且根據(jù)基因表達(dá)譜和分子指紋技術(shù)分析可知，調(diào)控JAK/STAT信號是復(fù)方丹參滴丸治療頸動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制[8-9]。因而，可推測復(fù)方丹參滴丸可能通過調(diào)控JAK-STAT 通路對癲癇模型大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，本研究通過建立癲癇模型大鼠，對此進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級雄性SD大鼠，體重200～240 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，大鼠質(zhì)量合格證號為 2015000504404，許可證號為SC-XK(滬)20082-005。所有大鼠在四川大學(xué)華西醫(yī)院動(dòng)物房中飼養(yǎng)，12 h/12 h交替光照，溫度25 ℃，相對濕度50%，保持環(huán)境整潔、安靜，通風(fēng)良好，大鼠自由飲食、飲水。

1.2 藥品、試劑與儀器

1.2.1 藥品與試劑：復(fù)方丹參滴丸(天士力制藥集團(tuán)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z10950111)；托伐替尼(貨號為HY-40354，美國MCE公司)；戊四氮(貨號為P6500，上海赫果生物科技有限公司)；氯化鋰(貨號為S24112，上海源葉生物科技有限公司)；大鼠TNF-α 及IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、兔源JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3及GAPDH一抗、羊抗兔二抗(貨號分別為ab100785、ab100772、ab39636、ab32101、ab68153、ab76315、ab181602、ab150077，美國Abcam公司)；RIPA裂解液、BCA試劑盒及HE染色試劑盒(貨號分別為P0 013 K、P0011、C0105，上海碧云天公司)等。

1.2.2 儀器：Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XC105)；輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、包埋機(jī)和烤片機(jī)(德國Leica 公司，型號：RM2035、EG1160和HI1220)；光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司，型號：SMZ745)；酶標(biāo)儀(德國Perkin Elmer公司，型號：XElx800)；低溫高速離心機(jī)(德國 Eppendorf 股份公司，型號：Centrifuge 5424R)；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司，型號：1659001、Trans-Blot SD)；凝膠成像儀(Miulab公司，型號：GIS-500)等。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備及分組給藥：參照文獻(xiàn)制備動(dòng)物模型[10]。SD大鼠以127 mg/kg劑量腹腔注射氯化鋰；24 h后以35 mg/kg劑量腹腔注射戊四氮；30 min后，觀察大鼠面肌抽動(dòng)、前肢陣攣、后肢陣攣及跌倒等癥狀。根據(jù)Racine分級評價(jià)癲癇發(fā)作級別，Ⅰ級為面部出現(xiàn)陣攣；Ⅱ級為頸部肌肉痙攣，出現(xiàn)甩尾或節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級為出現(xiàn)單側(cè)前肢抽搐；Ⅳ級為出現(xiàn)雙前肢抽搐；Ⅴ級為出現(xiàn)四肢抽搐、失去平衡、跳躍及跌倒等[11]。如建模大鼠持續(xù)出現(xiàn)Ⅳ級以上癲癇發(fā)作表現(xiàn)，說明建模成功。建模52只，最終成功48只，隨機(jī)分為模型組、復(fù)方丹參滴丸組、托伐替尼組及復(fù)方丹參滴丸+托伐替尼組，每組12只；另取12只SD大鼠腹腔注射等劑量無菌0.9%氯化鈉溶液，設(shè)為對照組。將復(fù)方丹參滴丸[12]、托伐替尼[13]溶于0.9%氯化鈉溶液分別配制為8、0.62 mg/ml溶液，復(fù)方丹參滴丸與托伐替尼均以10 ml/kg劑量灌胃，模型組與對照組以等劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃，各組均1日1次，持續(xù)28 d。

1.3.2 大鼠癲癇發(fā)作情況檢測：結(jié)束用藥24 h后，觀察各組大鼠癲癇發(fā)作情況，記錄其1 d內(nèi)發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時(shí)間。

1.3.3 大鼠認(rèn)知功能檢測：大鼠癲癇發(fā)作情況檢測結(jié)束后，參照文獻(xiàn)進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[14]，測定平均逃避潛伏期及大鼠在1 min內(nèi)穿越平臺原位置的次數(shù)，以此評定大鼠認(rèn)知功能。

1.3.4 大鼠海馬神經(jīng)元病理變化檢測及標(biāo)本采集：大鼠認(rèn)知功能檢測結(jié)束后，經(jīng)尾靜脈取血2 ml，靜置后離心收集上清液，血清儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆?。將大鼠處死，解剖取出大腦，以PBS沖洗干凈后，剪取約0.5 g腦組織，加入蛋白裂解液后制備為勻漿液，離心收集上清液，提取得到總蛋白樣品液；剩余組織置于4%多聚甲醛中固定，以梯度酒精(由低到高)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，最后以切片機(jī)做病理切片；選取含有海馬組織的病理切片脫蠟后，使用由高濃度到低濃度酒精浸泡處理；參照說明書的步驟以HE試劑盒進(jìn)行染色，再次脫水、透明后封片，采用顯微鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)元病理變化，任選5個(gè)視野拍照。

1.3.5 大鼠血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)水平測定：取“1.3.4”項(xiàng)下凍存的血清置于4 ℃解凍，使用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定其中TNF-α、IL-6含量，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.3.6 免疫印跡法：“1.3.4”項(xiàng)下凍存的蛋白樣品液置于4 ℃凍融，參照說明書的步驟以BCA試劑盒測定其濃度；各組取含相同質(zhì)量總蛋白樣品液電泳分離蛋白，并將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，截取目的蛋白條帶置于小盒中，以兔源JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3及GAPDH一抗于4 ℃冰箱中孵育過夜，經(jīng)TBST漂洗后，加入羊抗兔二抗，室溫置于搖床上孵育2 h，以TBST再次漂洗，以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，采用凝膠成像儀拍攝蛋白條帶，以Image Lab軟件對其進(jìn)行分析，得出蛋白相對表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 五組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時(shí)間比較

與對照組相比，模型組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)明顯增多，持續(xù)時(shí)間明顯延長；與模型組相比，復(fù)方丹參滴丸組、托伐替尼組及復(fù)方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)明顯減少，持續(xù)時(shí)間明顯縮短；與復(fù)方丹參滴丸組、托伐替尼組分別相比，復(fù)方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)明顯減少，持續(xù)時(shí)間明顯縮短，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 五組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時(shí)間比較Tab 1 Comparison of the frequency and duration of seizure

2.2 五組大鼠海馬神經(jīng)元病理變化

對照組大鼠海馬神經(jīng)元呈帶狀分布，細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，胞漿透明，胞核規(guī)則呈圓形或橢圓形，核膜、核仁明顯，染色質(zhì)分布均勻，無病理變化；模型組大鼠海馬神經(jīng)元排列紊亂、疏松且失去正常結(jié)構(gòu)，胞體變?yōu)槿切位虿灰?guī)則圖形，胞質(zhì)濃縮、深染，胞核固縮，核膜、核仁不明顯，胞漿呈空泡樣改變，細(xì)胞凋亡，數(shù)量顯著減少等病理損傷；與模型組相比，復(fù)方丹參滴丸組、托伐替尼組及復(fù)方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷減輕；與復(fù)方丹參滴丸組、托伐替尼組相比，復(fù)方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷進(jìn)一步減輕，見圖1。

A.對照組；B.模型組；C.復(fù)方丹參滴丸組；D.托伐替尼組；E.復(fù)方丹參滴丸+托伐替尼組A.control group; B.model group; C.compound Danshen dripping pill group; D.tofacitinib group; E.compound Danshen dropping pill+tofacitinib group圖1 HE染色檢測五組大鼠海馬神經(jīng)元病理變化(×400)Fig 1 Pathological changes of hippocampal neurons in five groups of rats by HE staining (×400)

2.3 五組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺原位置次數(shù)比較

與對照組相比，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺原位置次數(shù)明顯減少；與模型組相比，復(fù)方丹參滴丸組大鼠穿越平臺原位置次數(shù)明顯增多，托伐替尼組及復(fù)方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺原位置次數(shù)明顯增多；與復(fù)方丹參滴丸組、托伐替尼組分別相比，復(fù)方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠穿越平臺原位置次數(shù)明顯增多，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 五組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺原位置次數(shù)比較Tab 2 Comparison of escape latency and times of traversing the original platform position among five groups

2.4 五組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較

與對照組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平明顯升高；與模型組相比，復(fù)方丹參滴丸組、托伐替尼組及復(fù)方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠血清TNF-α、IL-6水平明顯降低；與復(fù)方丹參滴丸組、托伐替尼組分別相比，復(fù)方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠血清TNF-α、IL-6水平明顯降低，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 五組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較Tab 3 Comparison of serum TNFα-, IL-6 levels among

2.5 各組大鼠腦組織JAK/STAT通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與對照組相比，模型組大鼠腦組織p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3表達(dá)明顯升高；與模型組相比，復(fù)方丹參滴丸組、托伐替尼組及復(fù)方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠腦組織p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3表達(dá)明顯降低；與復(fù)方丹參滴丸組、托伐替尼組分別相比，復(fù)方丹參滴丸+托伐替尼組大鼠腦組織p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3表達(dá)明顯降低，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、表4。

A.對照組；B.模型組；C.復(fù)方丹參滴丸組；D.托伐替尼組；E.復(fù)方丹參滴丸+托伐替尼組A.control group; B.model group; C.compound Danshen dripping pill group; D.tofacitinib group; E.compound Danshen dropping pill+tofacitinib group圖2 免疫印跡檢測五組大鼠腦組織JAK/STAT通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig 2 Expression of proteins associated with the JAK/STAT pathway in brain tissues of five groups by Western Blot

表4 五組大鼠腦組織JAK/STAT通路相關(guān)蛋白的相對表達(dá)比較Tab 4 Comparison of relative expression of proteins related to the JAK/STAT pathway in brain tissues of five groups

3 討論

癲癇是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可長期反復(fù)發(fā)作，難以治愈，大多數(shù)患者需長期服藥，甚至終身不能停藥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至因焦慮、抑郁增加其患精神疾病的風(fēng)險(xiǎn)。近年來，癲癇發(fā)病人數(shù)逐年增加，因而關(guān)于癲癇研究具有重大的臨床及社會(huì)意義[15]。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活，促使TNF-α、IL-6等促炎因子合成并釋放，引發(fā)神經(jīng)炎癥，造成海馬神經(jīng)元損傷是癲癇的主要病理機(jī)制[16]。本研究以腹腔注射氯化鋰及戊四氮方法建立癲癇模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬神經(jīng)元呈現(xiàn)排列紊亂、疏松且失去正常結(jié)構(gòu)，胞體變?yōu)槿切位虿灰?guī)則圖形，胞質(zhì)濃縮、深染，胞核固縮，核膜、核仁不明顯，胞漿呈空泡樣改變，細(xì)胞凋亡，數(shù)量顯著減少等病理損傷癥狀；且大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)明顯增多，持續(xù)時(shí)間、逃避潛伏期明顯延長，血清TNF-α及IL-6水平明顯升高，穿越平臺原位置次數(shù)明顯減少。表明經(jīng)氯化鋰及戊四氮處理后，大鼠出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，海馬神經(jīng)元及認(rèn)知功能受損，出現(xiàn)癲癇典型臨床癥狀，揭示模型建立成功。

中醫(yī)認(rèn)為，癲癇屬“癇證”，病因病機(jī)復(fù)雜，風(fēng)痰上擾，血瘀風(fēng)阻，氣機(jī)逆亂，引起清竅蒙蔽是其主要病機(jī)，治療應(yīng)以祛除痰阻、清痰化濁、活血化瘀及安心寧神為主。復(fù)方丹參滴丸由丹參、三七和冰片組成，具有止痛散結(jié)、活血通經(jīng)和補(bǔ)心安神之功效，還可有效消除氧自由基，降低炎癥因子水平，減輕腦部炎癥，并減少神經(jīng)興奮遞質(zhì)釋放，阻滯神經(jīng)元異常放電，起到抗癲癇作用[4,17]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激活JAK/STAT通路，可引發(fā)神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致癲癇的發(fā)生，阻滯該通路激活對癲癇的治療具有關(guān)鍵作用[18-19]。復(fù)方丹參滴丸的主要成分丹參可抑制JAK/STAT活化，減輕炎癥反應(yīng)，緩解肺纖維化進(jìn)程[20]。因此，可推測復(fù)方丹參滴丸治療癲癇的作用機(jī)制可能是通過下調(diào)JAK-STAT 通路實(shí)現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，癲癇模型大鼠腦組織p-JAK/JAK及p-STAT3/STAT3表達(dá)明顯升高；經(jīng)復(fù)方丹參滴丸及托伐替尼處理后，JAK-STAT 通路蛋白磷酸化水平降低，且大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷減輕，其癲癇發(fā)作次數(shù)減少，持續(xù)時(shí)間、逃避潛伏期縮短，血清TNF-α及IL-6水平降低，穿越平臺原位置次數(shù)增多。表明癲癇大鼠JAK-STAT 通路處于激活狀態(tài)，復(fù)方丹參滴丸可抑制JAK-STAT 通路磷酸化激活，與JAK抑制劑托伐替尼作用相似，均可降低促炎因子合成、分泌，抑制炎癥反應(yīng)，阻止癲癇發(fā)作，減輕海馬神經(jīng)元損傷，修復(fù)大鼠認(rèn)知功能。復(fù)方丹參滴丸與托伐替尼聯(lián)合處理模型大鼠，可進(jìn)一步減輕大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷，減少癲癇發(fā)作次數(shù)，縮短持續(xù)時(shí)間，降低血清TNF-α、IL-6水平和腦組織JAK、STAT3蛋白磷酸化水平，使大鼠穿越平臺原位置次數(shù)增多。表明復(fù)方丹參滴丸與托伐替尼聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同下調(diào)JAK-STAT 信號磷酸化，抑制炎癥發(fā)生，減輕海馬神經(jīng)元損傷及癲癇發(fā)作，修復(fù)受損認(rèn)知功能，揭示抑制JAK/STAT3信號激活可能是復(fù)方丹參滴丸改善癲癇大鼠臨床癥狀的藥理機(jī)制之一。

綜上所述，復(fù)方丹參滴丸可降低炎癥因子合成、釋放，抑制神經(jīng)炎癥發(fā)生，減少癲癇發(fā)作次數(shù)并縮短發(fā)作時(shí)間，促使認(rèn)知功能恢復(fù)，改善癲癇大鼠臨床癥狀，抑制JAK/STAT3信號激活可能是其作用機(jī)制之一。但本研究未使用JAK/STAT3通路激動(dòng)劑進(jìn)行對照驗(yàn)證，關(guān)于復(fù)方丹參滴丸治療癲癇的藥理機(jī)制的證據(jù)并不充分，還需要后續(xù)深入研究。