急性冷應激對小鼠生理、生化指標的影響及麻黃湯的干預作用

徐光沛，楊 睿，章萬君，吳書卉，朱 蕓，韓春楊，劉翠艷 *

(1.獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036)

【研究意義】寒冷是一種重要的環(huán)境應激原。在畜禽養(yǎng)殖上，春冬季節(jié)防寒保暖難以得到有效保障，特別是北方高寒地區(qū)晝夜溫差大，冷應激更加無法避免。冷應激可引起動物機體免疫力下降[1]、能量代謝紊亂、抗氧化功能受損[2]，影響動物的生產(chǎn)性能、繁殖性能，降低畜產(chǎn)品的質量甚至死亡[3]，是制約畜牧生產(chǎn)發(fā)展的重要因素之一[4-5]。因此，研究急性冷應激的致病特點、開發(fā)具有提高抗冷應激能力的藥物，對于防治冷應激對機體的損害及其引發(fā)的多種疾病、保障畜禽的健康具有重要意義[6]。研究表明，中藥可以提高機體冷適應能力，調節(jié)低溫條件下機體特異和非特異性免疫功能，增強抗寒能力和加速冷適應的建立[7]?！厩叭搜芯窟M展】王娜等[6]將附子、當歸、黃芪、五味子等中藥飼喂雛雞發(fā)現(xiàn)能提高冷應激狀態(tài)下雛雞的免疫水平和抗氧化能力；楊鳳微[8]等試驗發(fā)現(xiàn)，復方中藥水提液(附子、黃芪、五味子)可顯著提高慢性冷應激狀態(tài)下雛雞的抗氧化能力和白細胞數(shù)量。經(jīng)典方劑麻黃湯出自張仲景的《傷寒論》，由麻黃、杏仁、桂枝、甘草組成，主治外感風寒表實證。現(xiàn)代臨床應用表明，麻黃湯可以抗流行性感冒、急性支氣管炎、支氣管哮喘等[9-10]；藥理學研究發(fā)現(xiàn)，麻黃湯具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗過敏作用[11-14]，能顯著提升寒冷應激小鼠的免疫功能[15]?！颈狙芯壳腥朦c】麻黃湯對動物冷應激的防治效果及對急性冷應激狀態(tài)下動物生理、生化指標的影響未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本試驗通過動物病理模型，觀察了麻黃湯對急性冷應激模型小鼠血液生理、血清生化及肝組織抗氧化能力的影響，以期為麻黃湯在畜禽冷應激方面的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康昆明種小鼠36只，體重(21±1)g，雄性，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011-2012，飼養(yǎng)于清潔級動物房，溫度(23±2)℃，相對濕度41 % ～ 60 %。

1.1.2 中藥 麻黃、桂枝、杏仁、炙甘草，均購自合肥華佳大藥房。

1.2 方法

1.2.1 麻黃湯水煎液的制備 取麻黃16 g、桂枝16 g、杏仁20 g、炙甘草8 g，混合后冷水浸泡40 min；武火煎至沸騰時，改用文火；共煎煮2次，合并濾液；濃縮至0.45 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動物分組與處理 36只小鼠適應性飼養(yǎng)1 w后，隨機分為空白組、模型組和麻黃湯給藥組，每組12只。給藥組按0.02 mL/g 體質量灌胃麻黃湯，其它組按同等劑量灌胃蒸餾水。造模前36 h第1次灌藥/灌水，以后每隔12 h灌藥/灌水1次，連續(xù)3次。末次灌胃2 h后，將模型組、給藥組小鼠置于-20 ℃冷室中感受寒冷刺激，空白組小鼠室溫放置。分別于放置1、2 h觀察小鼠的精神狀態(tài)、黏膜顏色等情況；試驗結束時，所有小鼠眼球采血，摘取肝臟。肝組織于液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 指標檢測 ① 血液生理指標。紅細胞指數(shù)：紅細胞(RBC)、紅細胞比容(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、紅細胞分布寬度(RDW)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)、血紅蛋白濃度(HGB)；白細胞指數(shù)：白細胞(WBC)、淋巴細胞(Lymp)、單核細胞(Gran)、中性粒細胞(Mono)；血小板(PLT)。② 血清生化指標。血清尿素(urea)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、血糖(Glu)、肌酸激酶(CK)含量(活性)。③ 肝組織抗氧化指標 取肝組織，低溫勻漿處理，按照試劑盒說明操作，采用比色法檢測肝組織中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)含量(活性)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0比較均值中的單因素進行分析，結果以均值±標準誤(Mean±SEM)表示，同時比較各組之間的差異性，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 麻黃湯對冷應激小鼠精神狀態(tài)、活動能力及皮膚色澤的影響

試驗前，各組小鼠精神狀態(tài)良好，活動正常，皮膚呈淡粉色，抓取時劇烈掙扎。試驗1 h后，模型組小鼠精神不佳，皮膚呈粉紅色，活動量減少，抓取時略有掙扎；而給藥組小鼠精神狀態(tài)良好，少量活動，皮膚呈淡粉色，抓取時有明顯掙扎。試驗2 h后，模型組小鼠精神萎靡，幾乎不活動，身體蜷縮并伴有顫抖，皮膚輕度紫紅，抓取時幾乎不掙扎；給藥組小鼠精神沉郁，皮膚潮紅，抓取時仍有輕度掙扎。

2.2 麻黃湯對冷應激小鼠血液生理指標的影響

2.2.1 麻黃湯對冷應激小鼠紅細胞指數(shù)的影響 由表1可知，與空白組相比，模型組和給藥組的RBC、HGB、HCT值略微升高， MCV、MCHC值略微降低(P>0.05)；與模型組相比，給藥組RBC、HCT、HGB的值升高，MCV、RDW、MCHC值降低(P>0.05)；比較各組的RBC、HCT、MCV、RDW、MCHC、HGB差異均不顯著(P>0.05)。說明麻黃湯能略微增加冷應激小鼠紅細胞指數(shù)。

表1 麻黃湯對冷應激小鼠紅細胞數(shù)的影響

2.2.2 麻黃湯對冷應激小鼠白細胞指數(shù)及血小板的影響 由表2可知，與空白組相比，模型組和給藥組的WBC數(shù)量極顯著降低(P<0.01)，包括Lymp、Gran、Mono數(shù)量均極顯著降低(P<0.01)，PLT值均有所升高(P>0.05)；與模型組比較，給藥組的WBC值升高(P>0.05)，包括Lymp、Gran、Mono值均有所升高，但差異不顯著(P>0.05)，PLT值略微降低(P>0.05)；比較各組的PLT值，差異不顯著(P>0.05)。說明麻黃湯能增加冷應激小鼠白細胞指數(shù)，對血小板無顯著影響。

表2 麻黃湯對冷應激小鼠白細胞及血小板數(shù)量的影響

2.3 麻黃湯對冷應激小鼠生化指標的影響

由表3可知，與空白組相比，模型組小鼠的urea含量顯著升高(P<0.05)，給藥組小鼠的urea降低(P>0.05)；與模型組比較，給藥組小鼠的urea極顯著降低(P<0.01)。與空白組相比，模型組和給藥組小鼠的ALT水平均降低(P>0.05)；與模型組比較，給藥組小鼠ALT水平升高，但差異不顯著(P>0.05)。與空白組相比，模型組和給藥組小鼠的AST升高，差異極顯著(P<0.01)；與模型組比較，給藥組小鼠的AST升高，差異不顯著(P>0.05)。與空白組相比，模型組和給藥組小鼠的Glu水平極顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，給藥組小鼠的Glu水平極顯著降低(P<0.01)。與空白組相比，模型組小鼠的CK活性極顯著提升(P<0.01)，給藥組小鼠的CK值降低，但差異并不顯著(P>0.05)；與模型組比較，給藥組小鼠CK值極顯著降低(P<0.01)。說明麻黃湯能降低冷應激小鼠血清urea、Glu、CK水平。

表3 麻黃湯對冷應激小鼠生化指標的影響

2.4 麻黃湯對冷應激小鼠肝組織抗氧化指標的影響

由圖1可知，與空白組相比，模型組中的MDA水平極顯著升高(P<0.01)，給藥組小鼠的MDA水平降低(P>0.05)；與模型組相比，給藥組MDA值極顯著降低(P<0.01)；說明麻黃湯能顯著降低冷應激小鼠的肝臟MDA水平。由圖2可知：與空白組相比，模型組的GSH水平降低，差異不顯著(P>0.05)，給藥組小鼠的GSH值升高(P>0.05)；與模型組相比，給藥組GSH顯著升高(P<0.05)；說明麻黃湯能提高冷應激小鼠肝臟的GSH水平。由圖3可知：與空白組相比，模型組的SOD值降低，差異極顯著(P<0.01)，給藥組SOD值降低，差異不顯著(P>0.05)；與模型組相比，給藥組SOD升高，差異極顯著(P<0.01)；說明麻黃湯能提高冷應激小鼠肝臟的SOD水平。

圖1 麻黃湯對冷應激小鼠肝臟MDA水平的影響Fig.1 Effects of Mahuang decoction on MDA level of cold-stress mice liver (n =12)

圖2 麻黃湯對冷應激小鼠肝臟GSH水平的影響Fig.2 Effects of Mahuang decoction on GSH level of cold-stress mice liver (n =12)

圖3 麻黃湯對冷應激小鼠肝臟SOD活性的影響Fig.3 Effects of Mahuang decoction on SOD activity in cold-stress mice liver (n =12)

3 討 論

動物在冷應激狀態(tài)下，增加產(chǎn)熱以維持體溫恒定是動物機體重要生理機制之一[5]。研究表明，麻黃湯可通過減少散熱、增加產(chǎn)熱，以迅速升高體核溫度調節(jié)機體代謝，還可作用于下丘腦的體溫調節(jié)中樞使體溫下降[16]。藥理學研究表明，麻黃湯中的麻黃堿能興奮中樞神經(jīng)，對大腦、中腦及延腦、呼吸與循環(huán)中樞均起到興奮作用，還有類似腎上腺素的作用，故內服麻黃制劑可使全身溫暖，心跳加快，末梢血管收縮，血壓升高，且作用和緩而持久；輔藥桂枝含有桂枝醛能增強血液循環(huán)[17]。馬江[18]通過計算機對麻黃湯口服生物利用度預測、類藥性分析和靶點預測相結合，明確了麻黃湯中的活性化合物是通過舒張血管、促腎上腺素效應和促平滑肌收縮等作用發(fā)揮治療傷寒證的功效；魏鳳環(huán)等[19,20]研究發(fā)現(xiàn)，麻黃湯能使興奮性氨基酸神經(jīng)遞質升高，增加小鼠自主活動的作用。本試驗觀察到，麻黃湯可以在一定程度上改善冷應激導致的小鼠精神狀態(tài)、活動能力的抑制。

血液生理檢查作為臨床判斷機體是否處于正常水平的基礎的標準之一，對疾病的判斷及預后具有重要意義。血液中RBC在機體中主要承擔物質運輸及部分免疫功能[5]。一般情況下，為維持體溫恒定，冷應激時機體產(chǎn)熱會增加，代謝的需氧量也相應增加，導致RBC增多及HGB升高。本研究中，經(jīng)冷應激處理2 h后的小鼠RBC與HGB均高于空白組，而麻黃湯干預組小鼠RBC水平較模型組和正常組又有所提高，原因可能與麻黃湯能促進肝糖原分解、加快代謝，導致血液中的RBC代償性升高以提供更多的氧氣有關[21]。其中HCT增加，主要與RBC的數(shù)量增加相關。WBC主要包括Lymp、Gran、Mono等，在抵抗病原體的免疫應答中起重要作用，是臨床上判斷機體免疫力的重要指標之一[22]，冷應激時會發(fā)生顯著變化。本試驗結果顯示，冷應激處理2 h后小鼠的WBC水平特別是淋巴細胞顯著降低，這與Lavoy等[23]研究結果基本一致；而麻黃湯組小鼠WBC水平較模型組均有所增高，與喻敏等[24]研究結果一致。

血清生化指標常常反映動物機體的物質代謝水平和某些組織器官機能狀態(tài)。AST廣泛存在于肝臟、心肌、骨骼肌、腎臟及大腦內。本研究中，模型組小鼠AST水平上升，與穆淑琴等[28]的結果一致，是冷應激造成細胞受到不同程度損傷、通透性增加所致。麻黃湯組小鼠AST水平顯著上升，可能與麻黃湯能調節(jié)糖代謝、花生四烯酸代謝及脂代謝等有關[29]。Glu是機體重要的能量來源，當動物暴露寒冷環(huán)境下，血液中Glu水平顯著升高以增強產(chǎn)熱維持體溫[30]。CK是能量產(chǎn)生過程中一種重要的酶，主要存在于消耗能量迅速的組織和細胞中。研究顯示，在麻黃湯的干預下，CK水平顯著降低，提示其可緩解能量活躍細胞在冷應激狀態(tài)下的損傷。urea是哺乳動物蛋白質代謝的產(chǎn)物，當機體腎功能出現(xiàn)異?；虻鞍踪|代謝增強時會引起urea值增高。本試驗中，模型組小鼠urea顯著升高，與胡麗蓉[25]、黃立波等[26]的研究結果一致；而麻黃湯能緩解小鼠urea水平的升高，與趙莎[27]報道相吻合。其機制可能與麻黃湯降低了蛋白質代謝水平或提高代謝效率有關。

抗氧化是反映機體清除氧自由基降低細胞氧化損傷的能力，阻止損害生物細胞的一系列反應。MDA是脂質過氧化物反應中最重要的產(chǎn)物之一，能間接地反應細胞的損傷程度；GSH是機體清除氧自由基發(fā)揮抗氧化功能的重要物質，由自身的細胞合成；SOD廣泛存在于任何細胞中，能清除氧自由基。急性冷應激狀態(tài)下，動物肝組織中MDA水平顯著升高[29]，GSH水平降低[32]，SOD水平顯著降低[31-32]。本試驗模型組小鼠肝組織MDA、GSH、SOD變化與上述研究結果一致，說明急性冷應激嚴重損害了小鼠的抗氧化能力。在麻黃湯的干預下，小鼠GSH、SOD水平顯著升高，MDA水平顯著降低，其中GSH水平升高與李星[33]研究結果一致，說明麻黃湯有效地保護了急性冷應激導致的小鼠氧化損傷。根據(jù)李睿[34]的研究，麻黃湯含有的各種生物堿、有機酸、揮發(fā)油、黃酮類等物質能有效保護線粒體，與機體的抗氧化應激密切相關；Moselhy等[35]發(fā)現(xiàn)桂枝酸能有效緩解四氯化碳造成小鼠的肝損傷降低氧化應激。

4 結 論

麻黃湯可以改善急性冷應激小鼠的精神狀態(tài)和活動能力，增加應激狀態(tài)下小鼠白細胞數(shù)量，顯著降低肝、腎及心肌功能指標，從而緩解細胞損傷，增強肝臟的抗氧化功能?？梢?，麻黃湯能在一定程度上抵抗急性冷應激對小鼠造成的損傷。