高壓氧治療對慢性腦缺血大鼠認知功能的影響及其作用機制

周磊，應英，范茂丹，鄭成剛，衣洪杰，劉青樂

慢性腦缺血（chronic cerebral ischemia，CCI）是一種以腦血流灌注不足、腦血流量降低為特征的病理狀態(tài)，能夠引起全腦或局部腦組織區(qū)域性代謝障礙，常表現(xiàn)為進行性的認知功能缺損[1-4]。軸突生長抑制因子Nogo-A是一種廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘蛋白，是維持大腦結(jié)構完整和功能穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)因子，被認為是迄今發(fā)現(xiàn)最強的神經(jīng)再生抑制物，其表達增強，損傷神經(jīng)的再生修復能力降低。Nogo-A參與調(diào)節(jié)脊髓損傷、多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默病、外傷性腦出血、癲癇等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病神經(jīng)損傷后的病理生理過程，與認知功能關系密切[5-9]。高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）治療能夠改善一氧化碳中毒、缺血性卒中、外傷性腦出血等腦損傷后的認知功能障礙。但HBO治療是否能通過調(diào)節(jié)Nogo-A蛋白的表達，改善CCI相關認知功能障礙目前鮮有報道。本研究通過模擬CCI病理生理過程，建立CCI大鼠動物模型，評估HBO治療后大鼠學習記憶等認知功能的變化，通過觀察海馬組織神經(jīng)元結(jié)構改變，在分子水平檢測Nogo-A mRNA及Nogo-A蛋白的表達水平，探討HBO治療是否能夠改善CCI相關認知障礙。

1 研究對象與方法

1.1 實驗材料及分組

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠240只，體質(zhì)量160±20 g[購于海軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0002]。所有大鼠入組前均采用Morris水迷宮實驗進行為期5 d的適應性訓練，每日2次，剔除連續(xù)3 d未能找到隱蔽平臺的大鼠，用備用大鼠補充。

1.1.2 實驗試劑 包括Nogo-A抗體（北京中杉金橋有限公司），β-actin抗體（美國Bioworld公司），BCA蛋白定量分析試劑盒（美國Pierce公司），組織用RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche公司），十二烷基硫酸鈉、甘氨酸（武漢谷歌生物有限公司）。

1.1.3 實驗儀器 包括Morris水迷宮（北京碩林苑科技有限公司），全自動核酸分離純化系統(tǒng)（Roche公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），動物高壓氧艙（DWC450-1150型）。

1.1.4 實驗分組 根據(jù)隨機數(shù)字法將大鼠分為假手術組、CCI組、HBO組，每組80只。

1.2 慢性腦缺血模型制備 將CCI組和HBO組大鼠按永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈方法建立CCI模型[10]。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，將大鼠取仰臥位固定于動物手術臺中央。取頸部正中切口，分離頸部血管及伴行神經(jīng)，依次結(jié)扎右側(cè)頸總動脈近心端、遠心端后離斷血管。再用相同方法離斷左側(cè)頸總動脈。建模成功的標志為大鼠出現(xiàn)意識障礙，翻正反射消失。建模不成功或建模過程中死亡的大鼠用備用大鼠重新建模補充。假手術組大鼠在建模時操作方法相同，但僅分離左、右兩側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎、也不離斷頸總動脈。

1.3 治療方法 HBO組大鼠在CCI建模成功蘇醒12 h后進行HBO治療，治療前純氧洗艙10 min，后勻速加壓10 min，艙內(nèi)壓力達到0.2 MPa，穩(wěn)壓時間60 min，最后20 min勻速減壓至常壓，每日1次，持續(xù)治療28 d。假手術組與CCI組不予治療。

1.4 實驗檢測方法 建模成功后，每組分為4個檢測時間點：7、14、21及28 d，每個時間點20只大鼠，采用Morris水迷宮實驗測定各時間點大鼠學習、記憶能力，檢測前均進行3 d訓練，每天訓練4次，記錄各時間點大鼠逃逸潛伏時間和穿越平臺次數(shù)（穿越平臺次數(shù)僅取第28天）。建模28 d認知能力評估后處死大鼠，每組隨機選取4只大鼠海馬組織進行HE染色，8只大鼠海馬組織RT-PCR法檢測Nogo-A mRNA表達水平，8只大鼠海馬組織Western blot法檢測Nogo-A蛋白表達水平。

1.4.1 Morris水迷宮實驗 將大鼠放入水中，記錄其在120 s內(nèi)找到并爬上平臺的時間，超過120 s記錄為120 s，每只大鼠在每個時間點測試2次，取均值作為逃逸潛伏時間測定結(jié)果。然后撤出平臺，任選一相同入水點將大鼠放入水中，記錄其在120 s內(nèi)穿越原平臺位置的次數(shù)，僅測試1次。每組大鼠取檢測結(jié)果的平均值作為最后的測定結(jié)果。

1.4.2 HE染色 腹腔注射10%水合氯醛處死大鼠，斷頭取腦組織進行HE染色。選取海馬組織平面，光學顯微鏡下觀察海馬組織結(jié)構和神經(jīng)元形態(tài)變化。

1.4.3 RT-PCR法檢測Nogo-A mRNA表達水平 取大鼠海馬組織，經(jīng)液氮冷凍后，研缽研磨。加入Tri試劑勻漿后，依次用氯仿、異丙嗪及無水乙醇分離、沉淀、洗滌溶解RNA，以提取總RNA備用。將提取的總RNA用瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，在42 ℃ 30 min、85 ℃5 min條件下用RT試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以Nogo-A引物（上游引物：5`-AGTCTTGGGAAGGGAAGGATAGTGA-3`，下游引物：5`-CTTTCGGTTGCTGAGGTA-3`）依次在94 ℃ 4 min 1個循環(huán)，94 ℃ 30 s、57 ℃30 s、72 ℃ 1 min 35個循環(huán)，72 ℃ 6 min條件下，擴增122bp建立PCR反應系。以β-actin為內(nèi)參，將PCR擴增的產(chǎn)物進行電泳，目的基因Nogo-A mRNA的表達量以Nogo-A/β-actin的比值進行計算。

1.4.4 Western blot法檢測Nogo-A蛋白表達水平 取大鼠海馬組織洗凈，充分裂解、冰浴后，以3000 r/min離心30 min提取總蛋白。采用BCA法對Nogo-A蛋白進行定量?？偟鞍捉?jīng)煮沸、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、浸泡、搖床后，分別依次加入Nogo-A抗體及β-actin，4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。加入ECL化學發(fā)光顯影液，充分顯影。用Image-proplus 6.0圖像程序分析軟件對電泳條帶進行灰度掃描分析，以Nogo-A/β-actin的比值代表Nogo-A蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，當方差分析有統(tǒng)計學差異時，進一步采用SNK-q檢驗進行不同組間的兩兩比較，界值設定為0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 認知能力評估 逃逸潛伏時間比較：三組間7、14、21及28 d各時間點的逃逸潛伏時間整體差異均具有統(tǒng)計學意義（P=0.0062、P=0.0023、P＜0.0001、P＜0.0001）。進一步兩兩比較顯示，CCI組、HBO組各時間點逃逸潛伏時間均較假手術組延長（均P＜0.05），HBO組各時間點逃逸潛伏時間較CCI組縮短（均P＜0.05）（表1）。

穿越平臺次數(shù)比較：三組間28 d穿越平臺次數(shù)整體差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.0015）。進一步兩兩比較顯示，CCI組、HBO組穿越平臺次數(shù)較假手術組減少（均P＜0.05），HBO組穿越平臺次數(shù)較CCI組增加（P＜0.05）（表1）。

2.2 HE染色 假手術組大鼠海馬組織神經(jīng)元呈橢圓形，排列整齊，分布均勻，層次清晰，間隙致密，細胞結(jié)構正常，形態(tài)完整，核膜完整，核仁清晰。與假手術組相比，CCI組、HBO組大鼠海馬組織神經(jīng)元出現(xiàn)不同程度的損傷，神經(jīng)元數(shù)量減少，排列疏松，間隙增大，層次紊亂，部分神經(jīng)元出現(xiàn)壞死、凋亡，細胞間質(zhì)水腫，胞核固縮溶解。HBO組大鼠海馬組織神經(jīng)元損傷程度較CCI組輕（圖1）。

2.3 Nogo-A mRNA表達水平 大鼠海馬組織Nogo-A mRNA的表達量在假手術組、CCI組、HBO組中分別為0.29±0.02、1.02±0.02、0.67±0.01，CCI組、HBO組Nogo-A mRNA表達水平均較假手術組升高（均P＜0.05），HBO組較CCI組下降（P＜0.05）。

2.4 Nogo-A蛋白表達水平 大鼠海馬組織Nogo-A/β-actin的比值在假手術組、CCI組、HBO組中分別為1.00±0.02、5.28±0.31、3.01±0.17，CCI組、HBO組大鼠海馬組織中Nogo-A表達水平均較假手術組升高（均P＜0.05）；HBO組大鼠海馬組織中Nogo-A表達較CCI組下降（P＜0.05）（圖2）。

表1 各組大鼠學習記憶能力比較

圖1 各組大鼠海馬組織病理變化（HE染色×200）

圖2 各組大鼠海馬組織Nogo-A蛋白表達水平比較

3 討論

慢性腦缺血是以腦組織長期低灌注為特征的臨床綜合征。腦組織長期低灌注造成腦細胞結(jié)構和功能改變引起神經(jīng)元損傷和腦白質(zhì)病變，最終導致神經(jīng)退行性病變及認知功能障礙[11-15]。研究發(fā)現(xiàn)，CCI相關認知功能障礙的發(fā)生與血腦屏障破壞、神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂、炎癥損傷、氧化應激、免疫損傷、線粒體功能障礙、自由基損傷等機制相關[16-17]。如何改善CCI相關的認知功能障礙，逆轉(zhuǎn)引起認知功能下降的病理生理過程，找到治療認知功能障礙的分子靶點是亟待解決的課題。CCI發(fā)生的實質(zhì)是腦組織因血流低灌注處于長期的缺血缺氧狀態(tài)，而高壓氧是治療神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧性疾病的重要手段。涂杳然等[18]研究發(fā)現(xiàn)，HBO治療能夠通過下調(diào)Nogo-A及NgR表達減輕腦水腫，促進神經(jīng)功能恢復。但高壓氧能否改善慢性腦缺血引起的認知功能障礙的研究報道較少。

Morris水迷宮實驗是常用的評估大鼠認知功能的方法[19]。本研究利用Morris水迷宮實驗觀察CCI大鼠建模后28 d內(nèi)的認知能力變化及HBO治療的干預作用。研究發(fā)現(xiàn)，CCI大鼠在建模3周左右進入慢性腦缺血期[20-21]。本研究中，在建模后4個時間點（7、14、21、28 d），CCI組大鼠均出現(xiàn)不同程度的認知功能下降，且沒有恢復的趨勢。這可能與永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷較重，缺血缺氧狀態(tài)一直未改善，隨時間延長，腦細胞發(fā)生缺血缺氧損傷甚至壞死有關。同時，還觀察到在上述4個時間點，HBO治療均可以減輕慢性腦缺血導致的認知功能下降，提示HBO治療在CCI后早期干預中改善了腦組織的缺血缺氧狀態(tài)，使得部分腦細胞功能得以恢復，從而改善了認知功能。

本研究進一步探索了CCI大鼠海馬組織形態(tài)及HBO治療改善CCI大鼠認知功能的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)，學習、記憶等認知功能下降是CCI的主要表現(xiàn)之一[22-23]。本研究中，大鼠海馬組織HE染色結(jié)果提示CCI導致大鼠海馬組織形態(tài)改變，結(jié)構出現(xiàn)異常，而HBO治療可以減輕這種形態(tài)改變，減少神經(jīng)元壞死或凋亡。

Nogo是Reticulon家族成員，主要編碼Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C 3種蛋白質(zhì)，廣泛分布于哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)，在成年后中等強度表達于海馬組織、大腦皮質(zhì)等區(qū)域[24-28]。腦缺血損傷后神經(jīng)可塑性下降是影響神經(jīng)功能恢復的重要因素。Nogo-A蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，其表達上調(diào)，導致神經(jīng)可塑性下降，再生修復能力降低。史蕙青等[29]研究發(fā)現(xiàn)，慢性大腦缺血大鼠海馬組織中Nogo-A表達量在15 d左右達到高峰，之后逐漸下降，但在30 d中仍高于假手術組。這與本研究相似，本研究發(fā)現(xiàn)建模28 d，Nogo-A mRNA及Nogo-A蛋白的表達水平在CCI組、HBO組大鼠海馬組織中均較假手術組明顯升高。提示Nogo-A蛋白可能參與了CCI后認知功能下降的病理過程。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，HBO組大鼠海馬組織中Nogo-A mRNA及Nogo-A蛋白的表達水平較CCI組明顯下降。結(jié)合海馬組織形態(tài)和大鼠認知功能評估結(jié)果，提示HBO治療可能通過抑制Nogo-A蛋白的表達，減少海馬組織神經(jīng)元壞死、凋亡改善CCI大鼠的認知功能。

綜上所述，本研究結(jié)果提示HBO治療能夠改善CCI大鼠認知功能，其機制可能與降低CCI大鼠海馬組織中Nogo-A mRNA、Nogo-A蛋白的表達水平相關。這為臨床治療CCI相關認知功能障礙提供了新的思路和治療靶點。但是，本研究由于樣本量較少，未能在各個時間點取大鼠海馬組織進行Nogo-A mRNA、Nogo-A蛋白檢測，未能呈現(xiàn)慢性腦缺血及HBO治療干預后Nogo-A蛋白的動態(tài)變化。

【點睛】本研究發(fā)現(xiàn)高壓氧治療能夠改善慢性腦缺血大鼠的認知功能，其機制可能與降低海馬組織Nogo-A mRNA、Nogo-A蛋白的表達水平有關。