大豆E2泛素結(jié)合酶基因GmUBC1的克隆及在擬南芥中的異源表達(dá)

毛卓卓，宮宇，史貴霞，李亞麗，喻德躍，黃方

研究報(bào)告

大豆E2泛素結(jié)合酶基因的克隆及在擬南芥中的異源表達(dá)

毛卓卓，宮宇，史貴霞，李亞麗，喻德躍，黃方

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家大豆改良中心，農(nóng)業(yè)部大豆生物學(xué)與遺傳育種實(shí)驗(yàn)室(綜合性)，南京 210095

E2泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme)參與植物的抗逆、生長發(fā)育等多種生物途徑的調(diào)控，其功能研究在擬南芥()中的報(bào)道較多，但在重要經(jīng)濟(jì)作物大豆()中鮮有報(bào)道。本研究從大豆“南農(nóng)94-16”中克隆了1個(gè)與大豆子葉折疊突變體可能相關(guān)的基因，序列分析結(jié)果表明該基因編碼一個(gè)E2泛素結(jié)合酶，因此將其命名為。該基因編碼區(qū)全長為462 bp，編碼一個(gè)含153個(gè)氨基酸的蛋白，預(yù)測其分子量為17.25 kDa，等電點(diǎn)為6.74。利用qRT-PCR技術(shù)對在大豆不同組織中的表達(dá)模式及其對不同非生物脅迫和激素處理的響應(yīng)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在開花后40 d種子中表達(dá)量最高，在PEG、低溫、JA和ABA處理下表達(dá)下調(diào)。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)GmUBC1蛋白在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)都有表達(dá)。進(jìn)一步在擬南芥中異源表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的千粒重和總氨基酸含量顯著提高，表明異源過表達(dá)可以調(diào)控種子重量和氨基酸含量，為大豆品質(zhì)改良提供了基因資源。

大豆；E2泛素結(jié)合酶；；異源表達(dá)

泛素/26S蛋白酶體途徑是目前研究較多的植物蛋白降解系統(tǒng)機(jī)制之一。泛素是一種高度保守且由76個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白，分子量約為8.5 kDa，幾乎存在于所有真核生物體內(nèi)[1]。該途徑由一系列泛素酶及類泛素酶參與，如E1泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme)、E2泛素結(jié)合酶(ubi-quitin-conjugating enzyme)、E3泛素連接酶(ubiquitin ligase E3)以及一些蛋白酶體等。該途徑廣泛參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[2~4]，在維持細(xì)胞功能以及細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)、抵御環(huán)境脅迫、激素響應(yīng)、胚胎發(fā)育和衰老等方面發(fā)揮著重要的作用[5~14]。植物泛素蛋白酶體途徑在擬南芥中研究的最為深入，擬南芥中約有1400個(gè)基因編碼的蛋白(約占總蛋白質(zhì)數(shù)量的5%)參與蛋白泛素化系統(tǒng)[13]。其中編碼E2泛素結(jié)合酶的基因有37個(gè)，編碼E2泛素結(jié)合酶類似蛋白的基因?yàn)?個(gè)[8]。E2泛素結(jié)合酶由150個(gè)氨基酸組成的保守催化結(jié)構(gòu)域組成，內(nèi)含一個(gè)高度保守的半胱氨酸保守位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在真核生物中許多編碼泛素結(jié)合酶的基因參與抗逆、生長發(fā)育等多種生物途徑的調(diào)控，如在多種非生物脅迫處理下，泛素結(jié)合酶基因的表達(dá)量變化顯著，同時(shí)該基因在煙草()中過表達(dá)可以顯著提高煙草的抗旱性[15]。陳超等[16]研究發(fā)現(xiàn)，大豆基因在酵母中異源表達(dá)降低了酵母對干旱和鹽脅迫的耐受性。此外，Wan等[17]研究發(fā)現(xiàn)E2泛素結(jié)合酶在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育等多方面也發(fā)揮著重要的作用。Vierstra等[18]研究表明，雙突變體擬南芥能抑制、和基因的表達(dá)，從而表現(xiàn)出早花的表型，同時(shí)該雙突變體還表現(xiàn)出蓮座葉數(shù)量顯著減少、葉片表面增大、莖直徑減小以及花序莖中的維管束數(shù)量減少等表型。Wang等[19]通過VIGS (virus indu-ced gene silencing)技術(shù)對番茄() E2泛素結(jié)合酶基因和進(jìn)行沉默后，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因參與了果實(shí)成熟的調(diào)控，使番茄果實(shí)成熟期延遲。在葡萄()中的研究顯示，編碼E2泛素結(jié)合酶基因在葡萄漿果發(fā)育期間以及在收獲后的生理過程中發(fā)揮著重要的作用[20]。盡管E2泛素結(jié)合酶在多種植物中的功能研究越來越多，但是其在大豆中的報(bào)道相對較少。

本課題組前期為了探索大豆子葉折疊突變體()形成的分子機(jī)制，基于比較基因組雜交芯片(comparative genomic hybridization, CGH)[21]和RNA-seq[22]結(jié)果篩選出一個(gè)在大豆子葉折疊突變體與栽培大豆品種“南農(nóng)94-16”中表達(dá)差異的基因。本研究進(jìn)一步從大豆中克隆了該基因，序列分析結(jié)果顯示其編碼一個(gè)泛素結(jié)合酶，因此將其命名為。進(jìn)一步利用熒光定量PCR技術(shù)分析了基因在組織器官和在各種脅迫處理(鹽堿、干旱、低溫、JA、ABA)下的表達(dá)特性，構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子千粒重以及氨基酸含量顯著提高。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究大豆E2泛素結(jié)合酶參與植物發(fā)育和逆境中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株及試劑

大豆栽培品種“南農(nóng)94-16”(WT)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心種質(zhì)資源庫提供，大豆子葉折疊突變體()由本實(shí)驗(yàn)室通過NaN3-60COγ誘變大豆栽培品種“南農(nóng)94-16”獲得，材料均種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)場。出苗后1個(gè)月左右，分別取WT和的根、莖、葉、花和開花后7 d、10 d、15 d、30 d、40 d的豆莢和種子。取樣后立即液氮速凍，–80℃?zhèn)溆?。用于脅迫處理的大豆品種Williams82種植于本實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)箱內(nèi)。

擬南芥Columbia-0生態(tài)型種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。根癌農(nóng)桿菌EHA105及植物表達(dá)載體pMDC83由國家大豆改良中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 GmUBC1基因CDS全長序列的克隆

選取“南農(nóng)94-16”花為材料，利用RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取RNA，之后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用Phytozome數(shù)據(jù)庫預(yù)測其完整的基因序列，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物序列如下：GmUBC1F1：5?-TTTGCTGA-TTCTCTCGGCGT-3?；GmUBC1R1：5?-AGGTAACT-GGAAACTGCGAGG-3?。

50 μL PCR擴(kuò)增體系包括：KOD-Plus-Neo 0.25 μL，10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol/L MgSO44 μL，2 mmol/L dNTPs 4 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各2 μL，補(bǔ)滅菌ddH2O至50 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，31個(gè)循環(huán)；最后再72℃延伸10 min，4℃保存?zhèn)溆谩U(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離(電壓110 V)，目的片段用膠回收試劑盒回收后檢測濃度。膠回收產(chǎn)物首先用酶加polyA尾，再連接到pMD19-T載體上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有篩選抗生素的培養(yǎng)基上。挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測，測定正確后，進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.3 GmUBC1基因生物信息學(xué)分析

通過Phytozome網(wǎng)站(http://www.phytozome.net/ soybean)，分析基因及其部分同源基因的氨基酸序列，利用軟件BioXM 2.6計(jì)算蛋白分子量和等電點(diǎn)，Clustal X2.0進(jìn)行多序列同源對比，MEGA 5軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，通過TargetP軟件預(yù)測基因蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。

1.4 GmUBC1基因組織表達(dá)分析以及在不同脅迫處理下的表達(dá)模式分析

提取大豆突變體和“南農(nóng)94-16”不同時(shí)期的組織(根、莖、葉、花以及開花后7 d、10 d、15 d、30 d、40 d豆莢和種子)的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)大豆基因組Phytozome數(shù)據(jù)庫中該基因的CDS序列，利用Prime5.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，序列為：GmUBC1F2：5?-GGCGT-TGTTCATTTCTGTCTCA-3?，GmUBC1R2：5?-TC-GAGTTCGATTGCAAAACGT-3?。以大豆組成型表達(dá)基因(GenBank登錄號：AY907703)作為內(nèi)參，擴(kuò)增引物序列為：GmtubullinF：5?-GGAGTTCAC-AGAGGCAGAG-3?，GmtubullinR：5?-CACTTAC-GCATCACATAGCA-3?。熒光定量PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min終止反應(yīng)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后通過熒光值變化曲線以及溶解曲線分析基因的表達(dá)情況。

分別采集用15% 聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)處理0 h、0.5 h、2 h，4℃處理0 h、2 h、4 h以及250 mmol/L 氯化鈉(NaCl)、50 mol/L 茉莉酸(jasmonic acid, JA)、100 μmol/L脫落酸(abscisic acid, ABA)脅迫誘導(dǎo)0 h、3 h、6 h后的大豆Williams82葉片立即液氮冷凍，–80℃保存?zhèn)溆?。提取?jīng)過不同非生物脅迫以及激素處理后的大豆Williams82葉片RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，以大豆組成型表達(dá)基因作為內(nèi)參，進(jìn)行qRT- PCR，驗(yàn)證基因是否受脅迫誘導(dǎo)。

1.5 GmUBC1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建

本研究選擇pMDC83作為表達(dá)載體，首先以測序正確的連接有全長cDNA的pMD19-T載體為模板，擴(kuò)增基因的開放閱讀框(ORF)，包含終止子。所用引物序列為：GmUBC1F3：5?-ATGGCCAACAGCAACCTCCC-3?，GmUBC1R3：5?-TCAGACGCCACTAGCATATA-3? (下劃線的小寫字母為接頭引物序列)。用Gateway系統(tǒng)的BP反應(yīng)將其完整的ORF通過同源重組構(gòu)建到入門載體pDORNOR221上。測序正確后進(jìn)行LR反應(yīng)，將入門載體克隆產(chǎn)物與表達(dá)載體通過重組交換，將目的基因轉(zhuǎn)化到pMDC83載體上，即完成pMDC83-GmUBC1表達(dá)載體的構(gòu)建。經(jīng)過菌液PCR及酶切鑒定后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，培養(yǎng)后進(jìn)行PCR檢測。

1.6 大豆GmUBC1亞細(xì)胞定位

取新鮮的洋蔥，在基因槍轟擊的前一天在超凈臺內(nèi)剝?nèi)『线m的內(nèi)表皮，緊密貼合在MS固體培養(yǎng)基平板上，黑暗過夜培養(yǎng)，第二天待用。以測序正確的連接有全長載體為模板，擴(kuò)增基因的ORF，將其與報(bào)告基因融合，形成一個(gè)GmUBC1-GFP的嵌合基因。質(zhì)粒金粉處理后之后利用基因槍法打入洋蔥表皮細(xì)胞中，進(jìn)行基因槍轟擊后的洋蔥表皮在室溫暗環(huán)境下培養(yǎng)1 d后可進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥

將含有重組載體pMDC83-GmUBC1質(zhì)粒的陽性農(nóng)桿菌菌液在含有卡那霉素(Kan)、潮霉素(HygB)、利福平(Rif)的 YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24 h后，接種于含有相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)12~14 h，按1∶10左右比例轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。當(dāng)值達(dá)到0.8~1.0后，離心收集菌液，加入含有0.3%表面活性劑Silwet的蔗糖溶液懸浮菌液，重新調(diào)至600=0.8左右。于擬南芥開花期，利用蘸花法將構(gòu)建好的過表達(dá)載體pMDC83-GmUBC1農(nóng)桿菌菌液侵染野生型擬南芥，農(nóng)桿菌侵染當(dāng)代的植株為T0代。

1.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥抗性篩選及陽性植株的鑒定

將收獲的T0代種子用70%酒精浸泡1 min，30%H2O2消毒10 min，于超凈臺內(nèi)用滅菌水清洗干凈之后，均勻種植于固體MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基帶有潮霉素抗性，置于人工智能培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 d左右。根系生長正常的幼苗初步確定為陽性T1代株系。提取轉(zhuǎn)基因擬南芥及對照野生型擬南芥植株葉片的DNA。取1 μL DNA為模板，以構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)的引物(GmUBC1F3和GmUBC1R3)進(jìn)行PCR鑒定。設(shè)置含有基因編碼框的質(zhì)粒為陽性對照，野生型擬南芥的DNA為陰性對照。收獲的T1代植株的種子為T2代，繼續(xù)種于含有潮霉素抗性的平板上篩選，最終得到3個(gè)純合的T3代株系，記為U20-3、U20-5、U20-7。

1.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子千粒重以及氨基酸含量測定

將T3代成熟種子放置于2 mL離心管中，置于30℃烘箱一周以上，而后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因種子千粒重的統(tǒng)計(jì)和氨基酸含量的測定。使用天平(AL104-LC)稱取每個(gè)株系的千粒重，重復(fù)3~5次。稱取至少0.12 g的擬南芥T3代種子于液氮中研磨后加入5 mL HCl浸提液過濾后定容至10 mL。之后加入4%磺基水楊酸，15,000 r/min離心15 min，過濾上清液，用氨基酸分析儀(L-8900)測氨基酸含量。相同提取條件下，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.10 不同脅迫處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的萌發(fā)率

選取U20-3、U20-5、U20-7各3個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥(WT)種子，用70%酒精浸泡1 min，30%H2O2消毒10 min，于超凈臺內(nèi)用滅菌水清洗干凈之后，分別種植于不同逆境(70 mmol/L的NaCl、6%的PEG和0.1 μmol/L ABA)處理的固體MS培養(yǎng)基上，將胚根突破種皮1 mm視為萌發(fā)，培養(yǎng)7 d后對種子萌發(fā)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并重復(fù)3次。數(shù)據(jù)分析采用Excel 2007，繪圖采用ORIGIN 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmUBC1基因克隆

本研究以栽培大豆品種“南農(nóng)94-16”花cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一個(gè)長度為462 bp的CDS片段。通過ExPASy proteomics 網(wǎng)站預(yù)測該基因編碼的蛋白包含153個(gè)氨基酸，蛋白分子量為17.25 kDa，等電點(diǎn)為6.74。在NCBI網(wǎng)站將其氨基酸序列進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)其具有UBCc結(jié)構(gòu)域，屬于E2泛素結(jié)合酶家族，因此將該基因命名為。通過phytozome網(wǎng)站進(jìn)一步獲得該基因的基因組序列，全長為6785 bp，包含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子。

將GmUBC1氨基酸序列與擬南芥、水稻()、苜蓿()、玉米()、菜豆()、番茄()氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)不同物種的E2泛素結(jié)合酶氨基酸序列高度相似，均具有一個(gè)典型的泛素結(jié)合酶UBCc結(jié)構(gòu)域，屬于E2泛素結(jié)合酶家族。其中，GmUBC1與擬南芥(AT1G16890)和番茄(Solyc07g062570)的氨基酸相似性最高(一致率為99.35%，相似率為100%)，此外與苜蓿Medtr2g-078010 (99.39%，98.69%)、玉米GRMZM5G862131 (97.39%，99.35%)、水稻LOC_Os01g48280 (97.39%，98.69%)和菜豆中Phvul.005G066900 (97.39%，99.35%)相似度也較高，推測各物種同源蛋白可能具有高度相似的功能(圖1)。進(jìn)一步將擬南芥、水稻、玉米、苜蓿、菜豆、番茄的UBCc結(jié)構(gòu)域蛋白與GmUBC1蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GmUBC1與

擬南芥的AtUBC36、番茄的SIUBC聚為一枝，表明他們的親緣關(guān)系較近。此外，系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果顯示雙子葉植物，如大豆、擬南芥、菜豆等UBCc結(jié)構(gòu)域蛋白聚為一枝，而單子葉植物，如水稻、玉米等單獨(dú)聚為另外一枝，說明單子葉和雙子葉植物的UBCc蛋白功能發(fā)生了分化。

2.2 大豆GmUBC1基因在不同組織和脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)分析

為了研究基因在大豆栽培品種“南農(nóng)94-16”(WT)和子葉折疊突變體()不同組織中的表達(dá)模式，分別提取兩種材料的根、莖、葉、花以及開花后10 d、15 d、30 d、40 d種子的RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，利用qRT-PCR技術(shù)分析的表達(dá)情況。結(jié)果表明，基因在花和種子中的表達(dá)量相對較高，其中在開花后40 d的種子中表達(dá)量最高(圖3)。本研究進(jìn)一步分析了該基因在種子發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量，結(jié)果表明與WT相比，在開花后30 d的子葉折疊突變體種子中表達(dá)量顯著升高，而在開花后40 d的種子中表達(dá)量極顯著降低(圖4)。同時(shí)在種子發(fā)育過程中，在子葉折疊突變體種子發(fā)育早期10 d的種子中表達(dá)量最高，隨后隨著種子成熟該基因表達(dá)量下降，而在WT中在開花后40 d的種子中表達(dá)量達(dá)到最高。

圖1 GmUBC1與其他植物的E2泛素結(jié)合酶的氨基酸序列比對

大豆：GmUBC1(Glyma.12G161200)；苜蓿：Medtr2g078010；擬南芥：AT1G16890；菜豆：Phvul.005G066900；番茄：Solyc10g007260；玉米：GRMZM5G862131；水稻：LOC_Os01g48280。

圖2 大豆GmUBC1與其他植物的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

大豆：GmUBC (Glyma.13G270800)；苜蓿：MtUBC (Medtr2g078010)；擬南芥：AtUBC35 (AT1G78870)、AtUBC36 (AT1G16890)；菜豆：PvUBC (Phvul.005G066900)；番茄：SIUBC2 (Solyc10g007260)；玉米：ZmUBC1 (GRMZM5G862131)；水稻：OsUBC (LOC_Os01g48280)。

本研究進(jìn)一步分析了在不同生物脅迫下的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在低溫處理2 h時(shí)，基因表達(dá)量達(dá)到最低值，之后表達(dá)量逐漸升高(圖5A)。經(jīng)PEG處理后，基因的表達(dá)量在0.5 h時(shí)就極顯著低于0 h，在2 h下降到更低的水平(圖5B)。鹽處理后3 h，基因表達(dá)量達(dá)到最大值，之后有所降低，但均顯著高于對照未處理材料。在激素JA 處理3 h和6 h時(shí)，表達(dá)量均極顯著低于對照。在ABA處理3 h時(shí)，表達(dá)量急劇下降，隨著脅迫處理時(shí)間的延長，基因表達(dá)量有輕微上升，但仍顯著低于對照(圖5C)。以上結(jié)果說明，大豆基因的表達(dá)顯著受到非生物脅迫低溫、PEG以及激素JA、ABA的誘導(dǎo)下調(diào)，僅在鹽處理?xiàng)l件下基因表達(dá)量上調(diào)。

圖3 大豆GmUBC1在不同組織發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

*表示<0.05；**表示<0.01。

圖4 GmUBC1在大豆不同時(shí)期種子中的表達(dá)分析

*表示<0.05；**表示<0.01。

圖5 GmUBC1基因在不同脅迫條件下的表達(dá)模式

A：4℃低溫處理；B：15% PEG處理；C：250 mmol/L NaCl、50 mol/L JA、100 μmol/L ABA處理。*表示<0.05；**表示<0.01。

2.3 GmUBC1融合蛋白亞細(xì)胞定位

將測序正確的基因全長ORF(不含終止密碼子)連接到pMDC83載體，通過基因槍法將pMDC83-GmUBC1GFP轉(zhuǎn)入到洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，pMDC83-GFP融合蛋白綠色熒光分布在整個(gè)細(xì)胞(圖6A)，GmUBC1:GFP融合蛋白也分布在整個(gè)細(xì)胞(圖6B)，說明GmUBC1蛋白在細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)。

2.4 轉(zhuǎn)GmUBC1基因擬南芥陽性植株的PCR檢測

為了進(jìn)一步探究基因的生物學(xué)功能，本研究通過蘸花法將轉(zhuǎn)入擬南芥基因組中，獲得了過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥。本研究提取9個(gè)具有潮霉素抗性的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系葉片DNA進(jìn)行PCR檢測，鑒定目的基因是否插入擬南芥基因組中。利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以pMDC83-GmUBC1重組質(zhì)粒為陽性對照，以野生型擬南芥DNA及滅菌水作為陰性對照。結(jié)果如圖7所示，陰性對照(WT)中沒有目的條帶，陽性轉(zhuǎn)基因株系擴(kuò)增得到長度為462 bp的條帶，說明pMDC83- GmUBC1已經(jīng)成功插入到擬南芥基因組中。

圖6 GmUBC1蛋白亞細(xì)胞定位

A：空載體pMDC83-GFP轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞后GFP在細(xì)胞內(nèi)的定位；B：植物過表達(dá)載體pMDC83-GmUBC1-GFP轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞后GFP在細(xì)胞內(nèi)的定位；a、d：綠色熒光；b、e：明視野；c、f：疊加圖。

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA的PCR檢測

1~9：過表達(dá)擬南芥株系；10：陽性質(zhì)粒；11：WT；12：水。

2.5 GmUBC1轉(zhuǎn)基因擬南芥千粒重和氨基酸含量

對T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行表型觀察，發(fā)現(xiàn)與對照相比并沒有明顯的表型變化。為了探究基因與擬南芥果實(shí)發(fā)育的關(guān)系，本研究對轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的千粒重進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果如圖8所示，轉(zhuǎn)基因株系U20-3、U20-5、U20-7的千粒重均比野生型植株有極顯著提高。同時(shí)本研究還測定了轉(zhuǎn)基因株系種子的總氨基酸含量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系U20-3、U20-5、U20-7的各組分氨基酸含量以及總氨基酸含量基本都比WT顯著提高(圖9)，表明在種子的發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要作用。

2.6 GmUBC1轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)率

對轉(zhuǎn)基因擬南芥種子和WT進(jìn)行非生物脅迫處理一周，對萌發(fā)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)70 mmol/L NaCl處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的萌發(fā)率高于對照(圖10A)；經(jīng)6% PEG和0.1 μmol/LABA處理，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的萌發(fā)率與對照相比，均有不同程度的降低(圖10，B和C)。該結(jié)果表明過表達(dá)可以使擬南芥對各種逆境有不同程度的響應(yīng)。

圖8 GmUBC1轉(zhuǎn)基因擬南芥千粒重

圖9 GmUBC1轉(zhuǎn)基因擬南芥種子各組分氨基酸含量

*：表示<0.05；**：表示<0.01。Asp：天冬氨酸，Thr：蘇氨酸，Ser：絲氨酸，Glu：谷氨酸，Ala：丙氨酸，Cys：半胱氨酸，Val：纈氨酸，Met：蛋氨酸，Ile：異亮氨酸，Leu：亮氨酸，Tyr：酪氨酸，Phe：苯丙氨酸，Lys：賴氨酸，His：組氨酸，Arg：精氨酸，Pro：脯氨酸。

圖10 脅迫處理后GmUBC1轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)率

A：70 mmol/L NaCl處理后種子萌發(fā)率；B：0.1 μmol/L ABA處理后種子萌發(fā)率；C：6% PEG處理后種子萌發(fā)率。

3 討論

E2泛素結(jié)合酶是一個(gè)多基因家族，在動(dòng)物和人類中的數(shù)量涉及100多種。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)種子中IAA和ABA含量較高而發(fā)芽率和GA3含量較低。突變體的子葉具有更大的液泡和更多的膜狀多層結(jié)構(gòu)，以及更高的蛋氨酸和半胱氨酸含量，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示中的多種植物激素生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)基因存在顯著差異[22]，因此對差異表達(dá)基因的研究有助于了解大豆子葉折疊突變體的分子調(diào)控機(jī)制。本研究亞細(xì)胞定位結(jié)果與預(yù)測結(jié)果一致，GmUBC1蛋白在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，且不存在信號肽。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)泛素結(jié)合酶基因在植物的各個(gè)器官中都有表達(dá)，比如E2泛素結(jié)合酶基因在小麥()的根、莖、葉和種子中均有表達(dá)[23]。本研究在提取大豆各個(gè)不同時(shí)期組織的RNA后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測了WT及突變體不同組織中基因的表達(dá)量。結(jié)果表明基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在開花后40 d的種子中表達(dá)量最高，且在開花后30 d的種子中表達(dá)量顯著高于WT，但在開花后40 d的種子中表達(dá)量卻極顯著低于WT，且隨著種子的成熟，基因表達(dá)量逐漸下降，表明可能主要在種子發(fā)育前期起作用。眾所周知，基因序列的改變可能引起基因表達(dá)量的改變，從而引起生物表型的改變，包括SNPs、In/Del和結(jié)構(gòu)上的變異等[24,25]。除此之外，表觀遺傳學(xué)也同樣調(diào)控生物的表型。表觀遺傳學(xué)是在不改變基因序列的情況下，通過對基因進(jìn)行可逆性修飾，產(chǎn)生可遺傳的基因表達(dá)改變，導(dǎo)致表型變異的現(xiàn)象[26]。表觀遺傳學(xué)的調(diào)節(jié)機(jī)制包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA[27,28]。例如在番茄中，利用CRISPR/ Cas9技術(shù)獲得異染色質(zhì)轉(zhuǎn)座子區(qū)CG、CHG位點(diǎn)嚴(yán)重低甲基化的和突變體，該突變體葉片呈雜色、花芽較小、花粉數(shù)量及活力顯著降低，且無法產(chǎn)生可育后代[29]。擬南芥中Pol V可以合成非編碼RNA，與一些抑制染色質(zhì)修飾的沉默因子結(jié)合，從而導(dǎo)致基因沉默[30]。同時(shí)，在植物體內(nèi)，啟動(dòng)子中順式作用元件與上游轉(zhuǎn)錄因子的互作也可以控制基因的表達(dá)。如檉柳()和為上游的調(diào)控基因，它們通過結(jié)合啟動(dòng)子中的W-box元件來調(diào)控基因的表達(dá)[31]。綜上所述，基于基因在大豆栽培品種“南農(nóng)94-16”和子葉折疊突變體()中的表達(dá)量差異可能是由多種因素造成的，還有待進(jìn)一步的研究進(jìn)行驗(yàn)證。

植物在生長發(fā)育過程中會遭受到各種非生物脅迫。研究表明泛素蛋白酶體途徑在植物非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[32,33]，如過表達(dá)綠豆()泛素結(jié)合酶基因改變ABA相關(guān)基因的表達(dá)，從而使轉(zhuǎn)基因擬南芥滲透脅迫抗性增強(qiáng)[34]。玉米基因響應(yīng)鹽害和干旱的脅迫[35]，小麥基因在干旱、高鹽和ABA脅迫下均上調(diào)表達(dá)[23]。在擬南芥中異源過表達(dá)大豆增加轉(zhuǎn)基因擬南芥逆境條件下脯氨酸含量，并且激活了逆境響應(yīng)基因的表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性[36]。為探究大豆基因是否同樣受到非生物脅迫誘導(dǎo)，通過研究發(fā)現(xiàn)在低溫、PEG以及激素JA、ABA脅迫處理下基因均處于下調(diào)狀態(tài)，僅在鹽處理?xiàng)l件下表達(dá)上調(diào)。低溫處理2 h時(shí)，該基因的表達(dá)量達(dá)到最低值，之后逐漸升高。經(jīng)PEG處理后，基因的表達(dá)量在0.5 h和2 h時(shí)均極顯著低于對照。鹽處理后3 h時(shí)，該基因表達(dá)量極顯著上升，之后有所降低，但均顯著高于對照。在激素JA 處理3 h和6 h時(shí)，表達(dá)量與對照相比呈下調(diào)趨勢。在ABA處理3 h時(shí)，表達(dá)量急劇下降，但在6 h時(shí)基因表達(dá)量有輕微上升，但仍顯著低于對照。這些結(jié)果說明大豆基因不同程度地響應(yīng)低溫、鹽堿、干旱與JA和ABA脅迫處理。過表達(dá)基因擬南芥種子在PEG、ABA處理下萌發(fā)率降低，在NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)率較對照高，說明基因過表達(dá)使擬南芥對逆境有不同程度的響應(yīng)。

以往研究表明E2泛素結(jié)合酶不僅在植物逆境中發(fā)揮一定的作用，同時(shí)也具有調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的作用[17]。在擬南芥中，參與雌配子體發(fā)育，的敲除突變體角果長度和種子數(shù)大大減少[37]；基因能通過影響生長素信號傳導(dǎo)和Aux/IAA蛋白的穩(wěn)定性而在根發(fā)育中起作用[38]。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室早期的研究表明，相比于WT子葉折疊突變體的百粒重顯著降低，生育期明顯延遲，氨基酸和蛋白含量提高[21,39]。本研究通過構(gòu)建基因過表達(dá)載體，進(jìn)行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)而對轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的千粒重和總氨基酸含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)有些轉(zhuǎn)基因株系的千粒重和總氨基酸含量均有顯著提高，說明該基因主要對種子的生長發(fā)育以及氨基酸合成起到調(diào)控作用。通過探究過表達(dá)該基因?qū)M南芥產(chǎn)生的影響，為提高大豆品質(zhì)提供參考。泛素結(jié)合酶蛋白在大豆生長發(fā)育中功能的研究尚少，因此克隆及研究大豆泛素結(jié)合酶功能意義重大。本研究初步研究了大豆基因的功能，有利于進(jìn)一步了解泛素結(jié)合酶在植物生長發(fā)育和逆境中的作用。

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Cloning of the soybean E2 ubiquitin-conjugating enzymeand its expression in

Zhuozhuo Mao, Yu Gong, Guixia Shi, Yali Li, Deyue Yu, Fang Huang

Plant E2 Ubiquitin-conjugating enzymes regulate various biological pathways such as stress resistance, growth and development. Reports on its functions are more frequent in, but relatively rare in soybean (), which is one of the most important economic crops. In this study, a gene, which may be related to the soybean cotyledon folding mutant, was cloned from soybean “Nanong 94-16”. Analysis of its sequence suggested that it encodes an E2 ubiquitin binding enzyme, so it was named as. Its coding region is 462 bp in length, which encodes a protein of 153 amino acids with a predicted molecular mass of 17.25 kDa and an isoelectric point of 6.74.The expression pattern ofin different tissues of soybean and its response patterns to different stresses and hormone treatments were analyzed by real-time PCR. The results showed that the gene was expressed at the highest level in mutant seeds at 40 days after flowering. Moreover, the expression of thegene was down-regulated by the treatments of PEG, cold, JA and ABA, respectively.Subcellular localization analysis of GmUBC1 revealed that the protein was expressed in the whole cell. Whenwas ectopically expressed in, the 1000-grain weight and total amino acid content of some transgenic lines were found to be significantly increased.Collectively, heterologous overexpression ofcan regulate seed weights and amino acid contents, which may provide genetic resources for soybean quality improvement.

soybean (L.);ubiquitin-conjugating enzyme E2;; heterologous expression

2020-05-21;

2020-07-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：31871649)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31871649)]

毛卓卓，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：作物遺傳育種。

黃方，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：大豆遺傳育種。E-mail: fhuang@njau.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-141

2020/8/10 9:16:03

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200807.1028.001.html

(責(zé)任編委: 儲成才)