NNK長(zhǎng)期暴露對(duì)小鼠毒性和Prx基因表達(dá)的影響

時(shí)桂芹，沈佳鑫，任 菲，韓亞偉

鄭州輕工業(yè)大學(xué)，鄭州市金水區(qū)東風(fēng)路5 號(hào) 450002

卷煙煙氣化學(xué)成分非常復(fù)雜，其中含有一些對(duì)吸煙者有潛在風(fēng)險(xiǎn)的有害成分，例如煙草特有亞硝胺（TSNAs），在此類(lèi)化合物中，4-（甲基亞硝氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）的含量較高，致癌性較強(qiáng)，已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）列為一類(lèi)致癌物［1-5］。據(jù)報(bào)道，氧化損傷在NNK 誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生過(guò)程中扮演著重要角色，而抗氧化蛋白Prx（Peroxiredoxin）最重要的功能是通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平使機(jī)體免受氧化損傷，在腫瘤中表達(dá)異常的一些Prx 蛋白可能成為某些腫瘤的標(biāo)志物［6］。因此，研究NNK 等環(huán)境致癌物對(duì)Prx基因表達(dá)的影響具有重要意義。

在小鼠體內(nèi)NNK 可通過(guò)α-亞甲基羥基化反應(yīng)與DNA 結(jié)合生成DNA 加合物，進(jìn)而使機(jī)體發(fā)生癌變［7］。李琛等［8］研究表明，NNK 致癌的小鼠肺、肝臟等器官組織中形成了DNA 甲基化產(chǎn)物O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤（O6-mG）。有報(bào)道表明，許多疾病及癌癥的發(fā)生都與機(jī)體的免疫系統(tǒng)損傷有關(guān)［9］。在哺乳動(dòng)物中Prx家族蛋白含有Prx1～Prx6等6種蛋白［10］，是一類(lèi)在機(jī)體內(nèi)廣泛存在的抗氧化酶，其能有效清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，從而使細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平保持平衡［11］。Prx 家族蛋白對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和免疫反應(yīng)、抗腫瘤等具有重要影響［12］。自由基導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和損傷與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，而Prx 蛋白最為顯著的功能是清除過(guò)氧化物，同時(shí)氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)Prx 的表達(dá)，這表明Prx 與ROS 的生成相關(guān)［13］。通常，在各種氧化應(yīng)激條件下，Prx 與氧化應(yīng)激的衰減和細(xì)胞存活的增加有關(guān)，Prx 基因也被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)H2O2的受體，而H2O2具有重要的第二信使功能，因此，Prx 基因在多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［14］。近年來(lái)，Prx 在腫瘤預(yù)防中的作用已被證實(shí)，但也有報(bào)道稱(chēng)Prx 可能與促進(jìn)癌癥的發(fā)生有關(guān)，因此，Prx 基因在腫瘤發(fā)生中的確切作用仍有爭(zhēng)議。有研究表明，卷煙煙氣、NNK和砷酸鹽等可以通過(guò)激活蛋白激酶C、絲裂原活化 蛋 白 激 酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）和p38 MAPK 途徑刺激2-Cys Prx 基因的表達(dá)［15］。目前，NNK 對(duì)Prx 基因體內(nèi)表達(dá)的誘導(dǎo)作用以及對(duì)腫瘤發(fā)生的影響尚不清楚。有關(guān)NNK誘導(dǎo)的癌癥與機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷，以及Prx 基因差異表達(dá)的研究較少［16］。因此，通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行NNK 腹腔注射，綜合評(píng)價(jià)NNK 對(duì)小鼠的毒性和Prx 基因表達(dá)的影響，旨在為NNK 致癌性研究和腫瘤靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

SPF 健康清潔KM 雄性小鼠，6 周齡，體質(zhì)量33～37 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。環(huán)境適應(yīng)期為7 d［溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度40%～75%］，自由飲水和攝食。觀察1 周后，選擇健康小鼠進(jìn)行分組和NNK 染毒實(shí)驗(yàn)。

NNK （＞98% ，加 拿 大TRC 公 司）；乙 醇（100%）、甲醛（＞99%）、甲醇（99%）（青島玉洲化工有限公司）；氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、二甲苯（＞99%，上海源葉生物科技有限公司）；生物切片石蠟（＞99%，上海華靈康復(fù)器械廠）；蘇木精染液、伊紅染液（＞99%，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）；中性樹(shù)膠（上海標(biāo)本模型廠）；Trizol 試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］；其余均為市售分析純?cè)噭?/p>

Observer A1 倒置顯微鏡（德國(guó)Zeiss 公司）；ERM3100 組織切片機(jī)及配套刀片（上海精密儀器儀表有限公司）；Stepone Plus 熒光定量PCR（美國(guó)ABI 公司）；5810/5810R 高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；PL4002 電子天平［感量：0.1 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；Option-S7/15 純水機(jī)（英國(guó)ELGA 公司）；GZX-DH-202-BS 電熱恒溫干燥箱（上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；LX-C35L 立式壓力蒸汽滅菌鍋（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；DW-86L386 超低溫冰箱（-80 ℃，青島海爾特種電器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組染毒、觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

選擇健康雄性小鼠60 只，體質(zhì)量30～35 g。隨機(jī)分成A～D 4 組，每組15 只。具體為：A. 2.5 mg/kg NNK處理組，B. 5.0 mg/kg NNK處理組，C. 2.5 mg/kg生理鹽水對(duì)照組，D. 5.0 mg/kg 生理鹽水對(duì)照組。采用等體積腹腔注射（0.5 mL/只）給藥，NNK 處理組于初次腹腔注射給藥24 h 后進(jìn)行等劑量再次給藥。每間隔24 h 腹腔注射1 次，直到注射24 周后斷頸處死小鼠。每隔2～3 d 給小鼠添加飼料，更換飲用水，并且清理更換鋸末墊料。小鼠從購(gòu)買(mǎi)期到注射期之間的時(shí)間間隔為適應(yīng)期，適應(yīng)期為7天，在注射期及正常飼養(yǎng)期間，每天觀察小鼠一般形態(tài)（打斗行為、精神狀態(tài)、皮毛顏色和光澤以及分泌物等）。另外，每周統(tǒng)計(jì)1 次各組小鼠的平均進(jìn)食量，每月稱(chēng)量1 次小鼠的體質(zhì)量，每組10 只小鼠，計(jì)算平均值。

1.2.2 組織切片的制作與HE 染色

從各組隨機(jī)抓取3 只小鼠，斷頸處死后用鑷子小心取出肝臟、肺、腎臟、睪丸，將每種組織用生理鹽水清洗3～5 遍，用剪刀剪下約0.5 cm 尺寸的組織，置于10%中性緩沖福爾馬林溶液中進(jìn)行固定，用于后期的組織切片制作，其余組織于-80 ℃冰箱中保持，用于總RNA的提取。將各種組織剪成約0.5 cm 厚度的小塊，用石蠟進(jìn)行包埋，制成約4 μm的組織切片，用于HE 染色。取出各種組織器官，依次進(jìn)行乙醇梯度脫水、石蠟包埋、常規(guī)切片、HE染色，最后將切片置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察［17］。

1.2.3 RNA 的提取及Prx 基因表達(dá)的熒光定量PCR 檢測(cè)

分別用Trizol 試劑提取處理組和對(duì)照組小鼠器官組織的RNA，按照操作說(shuō)明得到白色沉淀，加入40 μL 0.01%焦碳酸二乙酯（DEPC），使RNA 完全溶解。采用紫外分光光度計(jì)法分別測(cè)定RNA在260 和280 nm 下的吸光度，并計(jì)算其比值。將各種組織的總RNA 用DEPC 調(diào)節(jié)至相同濃度，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟為：

①取試劑盒中需要用的試劑，混勻后置于冰上保存。②按照反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)中步驟進(jìn)行操作，配制反應(yīng)液（表1），并將其加入無(wú)菌、無(wú)RNase 的EP 管中，混勻后離心。③放入PCR 儀中，設(shè)定程序?yàn)椋?5 ℃，10 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min，終止反應(yīng)。將PCR 產(chǎn)物稀釋后于-20 ℃保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是以GAPDH 為內(nèi)參基因，基因引物序列見(jiàn)表2。④熒光定量PCR 反應(yīng)條件。取20 μL 不同反應(yīng)溶液（表3），混勻，離心，置于PCR 儀中進(jìn)行反應(yīng)。設(shè)置的程序?yàn)椋篴. 變性溫度95 ℃，時(shí)間30 s；b. 循環(huán)擴(kuò)增40 次，變性溫度95 ℃、時(shí)間5 s，退 火 溫 度58～60 ℃、時(shí) 間30 s；延 伸 溫 度72 ℃、時(shí)間30 s；c. 延伸溫度72 ℃，時(shí)間5 min。

根據(jù)Ct 值計(jì)算內(nèi)參基因和處理組基因的△Ct，由△Ct對(duì)照組-△Ct處理組得到△△Ct，根據(jù)2-△△Ct得出處理組樣本基因相對(duì)于對(duì)照組樣本基因的表達(dá)量。

表1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系Tab.1 Reverse transcription reaction system

表2 Prx 基因的引物序列Tab.2 Primers for Prx genes

表3 qRT-PCR 反應(yīng)體系組成Tab.3 Composition of qRT-PCR reaction system

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行組間比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠形態(tài)學(xué)分析

在本實(shí)驗(yàn)中，由形態(tài)學(xué)分析可知，A 組（2.5 mg/kg NNK 處理組）小鼠的毛發(fā)粗糙散亂、光澤稍顯暗淡，行為表現(xiàn)焦慮，觸碰時(shí)有撕咬行為，但尿液和糞便無(wú)異常。B 組（5.0 mg/kg NNK 處理組）小鼠的行為表現(xiàn)同A 組，但與A 組相比，小鼠毛發(fā)更加粗糙散亂、無(wú)光澤，在觸碰時(shí)更顯焦慮，而尿液和糞便無(wú)異常。C 組（2.5 mg/kg 生理鹽水對(duì)照組）小鼠尾巴表明有打斗痕跡，其他均無(wú)異常。D組（5.0 mg/kg 生理鹽水對(duì)照組）小鼠與C 組小鼠相同。總體上，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射N(xiāo)NK，會(huì)使小鼠侵略性、好斗性增強(qiáng)，并使其毛發(fā)變得粗糙。

2.2 小鼠進(jìn)食量與體質(zhì)量分析

小鼠月均進(jìn)食量（圖1）顯示，4 組小鼠月平均進(jìn)食量均先上升后降低，這可能是由于前兩個(gè)月小鼠處于快速生長(zhǎng)時(shí)期，因此進(jìn)食量較大。在注射N(xiāo)NK 第1 個(gè)月至第5 個(gè)月，處理組小鼠進(jìn)食量明顯比對(duì)照組大。這可能是由于處理組小鼠代謝NNK 需要消耗較多能量，因此進(jìn)食量比對(duì)照組大。從注射N(xiāo)NK 第5 個(gè)月開(kāi)始，B 組小鼠進(jìn)食量超過(guò)其他3 個(gè)組，可能的原因是經(jīng)過(guò)4 個(gè)月的NNK腹腔注射，小鼠已適應(yīng)NNK 處理，但B 組小鼠需要代謝更多的NNK，機(jī)體消耗能量多，因而進(jìn)食量較大。

小鼠月均體質(zhì)量（圖2）顯示，小鼠在適應(yīng)期平均體質(zhì)量約34 g。在注射N(xiāo)NK 和生理鹽水期間，處理組小鼠的體質(zhì)量先增加后降低。但對(duì)照組小鼠體質(zhì)量一直處于增加趨勢(shì)。盡管4 組小鼠進(jìn)食量差異不大，但是隨著NNK 注射時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組小鼠的體質(zhì)量有所降低，對(duì)于5.0 mg/kg NNK處理組，變化更加明顯。

圖1 小鼠月均進(jìn)食量Fig.1 Monthly average food intake of mice

圖2 小鼠月均體質(zhì)量Fig.2 Monthly average body weight of mice

2.3 組織切片制作與HE 染色分析

小鼠肺組織切片見(jiàn)圖3。圖3A 是2.5 mg/kg NNK 處理組小鼠肺組織細(xì)支氣管，可以看出，肺泡隔出現(xiàn)增生、膨大，HE 著色較深并伴有溶血，有炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)反應(yīng)，結(jié)締組織存在被破壞現(xiàn)象，黏膜上皮有脫落，黏膜下層平滑肌斷裂，部分黏膜已無(wú)法識(shí)別。而對(duì)照組小鼠肺泡隔色澤健康完整，氣道壁結(jié)構(gòu)完好，平滑肌連續(xù)（圖3C）。與對(duì)照組小鼠（圖3D）相比，5.0 mg/kg 的NNK 處理組小鼠（圖3B）肺泡隔出現(xiàn)輕微增生，著色略深，部分肺泡囊被破壞，但沒(méi)有A 組嚴(yán)重，肺泡隔同樣有增生，且伴有炎癥反應(yīng)。

圖3 小鼠肺組織的HE 染色效果圖（400 倍）Fig.3 HE staining images of mouse lung tissues（400 times）

小鼠肝組織切片見(jiàn)圖4。圖4A 是2.5 mg/kg NNK 處理組小鼠肝小葉組織，與對(duì)照組小鼠（圖4C）相比，中央靜脈組織完整、清晰可見(jiàn)，內(nèi)部有少量血紅細(xì)胞；肝索清晰，肝血竇數(shù)量較多，并且比較大，肝血竇中間有少量顆粒物；枯否細(xì)胞伸出偽足附著于內(nèi)皮細(xì)胞表面，肝細(xì)胞與其細(xì)胞核明顯增大。與對(duì)照組小鼠（圖4D）相比，5.0 mg/kg NNK 處理組小鼠（圖4B）肝小葉中央貫穿中央靜脈，肝細(xì)胞向四周呈放射狀排列，形成肝索；肝板之間的空隙內(nèi)有若干肝血竇，中間夾雜一些巨噬細(xì)胞。

圖4 小鼠肝組織的HE 染色效果圖（200 倍）Fig.4 HE staining images of mouse liver tissues（200 times）

小鼠腎組織切片見(jiàn)圖5。圖5A 是2.5 mg/kg NNK 處理組小鼠腎臟組織腎皮質(zhì)，與對(duì)照組小鼠（圖5C）相比，腎小球出現(xiàn)萎縮、變形，腎小囊腔變窄；腎小球內(nèi)的足細(xì)胞分布松散不緊密，部分腎小管管壁變薄，集合管代償性變粗增生，內(nèi)部出現(xiàn)些許纖維化變性。與對(duì)照組小鼠（圖5D）相比，5.0 mg/kg NNK 處理組小鼠（圖5B）腎小球出現(xiàn)嚴(yán)重變性、萎縮，腎小囊壁層損傷嚴(yán)重，腎小體破裂，細(xì)胞間質(zhì)分布不均勻，近端小管、遠(yuǎn)端小管難以辨認(rèn)，部分管腔明顯變窄，部分間質(zhì)組織增厚、肥大。

圖5 小鼠腎組織的HE 染色效果圖（400 倍）Fig.5 HE staining images of mouse kidney tissues（400 times）

小鼠睪丸組織切片見(jiàn)圖6。圖6A 是2.5 mg/kg NNK 處理組小鼠睪丸組織，與對(duì)照組小鼠（圖6C）相比，生精小管外層生精上皮細(xì)胞排列較緊密，緊靠在一起；各級(jí)生精小管均有不同程度的萎縮，外壁變薄，甚至一些生精小管內(nèi)部出現(xiàn)空腔，沒(méi)有各級(jí)精細(xì)胞；有精細(xì)胞的生精小管出現(xiàn)精子變少的現(xiàn)象。與對(duì)照組小鼠（圖6D）相比，而5.0 mg/kg NNK 處理組小鼠（圖6B）部分生精小管緊密排列連接在一起，有些生精小管上皮細(xì)胞脫落，且厚度不一；靠近內(nèi)側(cè)的精母細(xì)胞與生精上皮細(xì)胞分離；組織結(jié)構(gòu)疏松，內(nèi)側(cè)細(xì)胞排列不均勻。

圖6 小鼠睪丸組織的HE 染色效果圖（200 倍）Fig.6 HE staining images of mouse testis tissues（200 times）

有研究表明，NNK 對(duì)多種器官組織具有細(xì)胞毒性［1］。趙華玲［18］的研究結(jié)果表明，8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）會(huì)發(fā)生不良反應(yīng)，主要是DNA 的氧化損傷所致，對(duì)于部分氧化損傷，機(jī)體會(huì)進(jìn)行自我修復(fù)，從而阻止損傷，但嚴(yán)重的氧化損傷會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害，例如造成炎癥等。本研究中通過(guò)HE染色證實(shí)了NNK 對(duì)小鼠的肺、肝、腎和睪丸組織會(huì)造成不同程度的傷害，NNK 染毒可使小鼠肺泡隔增生，肝血竇與肝細(xì)胞核增大，腎小球出現(xiàn)玻璃樣變性、破碎，睪丸生精小管中各級(jí)精細(xì)胞明顯減少，進(jìn)而引發(fā)大量炎癥，這與前人的研究結(jié)果一致。

2.4 NNK 處理對(duì)小鼠Prx 家族基因表達(dá)的影響

小鼠Prx 基因的相對(duì)表達(dá)量（圖7）顯示，在NNK 處理后，所有的Prx 基因均被誘導(dǎo)，同一個(gè)Prx 基因在不同組織中的表達(dá)量不同，且同一組織中處理組小鼠Prx 基因的表達(dá)量最高為對(duì)照組小鼠的34.8 倍?？梢?jiàn)，在NNK 脅迫下，小鼠不同組織中Prx 基因的表達(dá)出現(xiàn)異常。初步推斷，Prx 基因可調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)ROS 水平，進(jìn)而在NNK 誘發(fā)腫瘤過(guò)程中發(fā)揮預(yù)防作用。進(jìn)一步比較可知：

圖7 小鼠Prx 基因的相對(duì)表達(dá)量（n=3）Fig.7 Relative expression of Prx gene in mice（n=3）

①與對(duì)照組小鼠相比，Prx1 基因在兩種不同劑量NNK 處理組小鼠組織中的表達(dá)量基本呈降低趨勢(shì)，僅在5.0 mg/kg NNK 處理小鼠腎組織中Prx1 基因的表達(dá)量略有升高。同樣，與對(duì)照組小鼠相比，Prx3 基因在兩種不同劑量NNK 處理組小鼠組織中的表達(dá)量基本呈降低趨勢(shì)，僅在5.0 mg/kg NNK 處理組小鼠肺組織中Prx3 基因的表達(dá)量略有升高。這說(shuō)明在NNK 影響下，Prx1 和Prx3基因的表達(dá)基本被抑制，可能的原因是Prx1 和Prx3 蛋白對(duì)NNK 引起的小鼠組織炎癥不太敏感。②Prx2 基因在不同組織中受NNK 的影響不同，在肺和腎組織中其表達(dá)量與對(duì)照相比升高，而在肝和睪丸組織中降低，這說(shuō)明Prx2 蛋白對(duì)NNK 導(dǎo)致的不同組織炎癥的敏感程度不同。③與對(duì)照組小鼠相比，在處理組小鼠肝和腎組織中Prx4 和Prx6基因受NNK 的影響其表達(dá)量升高，而在肺和睪丸組織中其表達(dá)量降低。④Prx5 基因在2.5 mg/kg NNK 處理組小鼠組織中其表達(dá)量均高于對(duì)照組小鼠；對(duì)照組小鼠所有組織中Prx5 基因表達(dá)量均較低；5.0 mg/kg NNK 處理后，小鼠肺、肝和腎組織中Prx5 基因表達(dá)量顯著升高。這說(shuō)明Prx5 基因可能在NNK 脅迫下發(fā)揮著較重要的抗氧化作用，以抑制腫瘤的發(fā)生。Prx5 是一種多功能蛋白，能夠保護(hù)DNA 免受損傷，因而是細(xì)胞凋亡的抑制劑。Avila 等［19］的研究表明，Prx5 蛋白是肺上皮細(xì)胞的重要抗氧化蛋白之一，其在人肺中的表達(dá)量會(huì)因炎癥的發(fā)生而增加。在本研究中，與對(duì)照組小鼠相比，NNK 誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥中Prx5 基因表達(dá)量顯著增加，表明Prx5 可能在肺部感染中起重要作用。Prx5 基因不僅在NNK 處理的小鼠肺組織中高表達(dá)，而且在腎臟和睪丸中高表達(dá)。由此推斷，Prx5 基因可能是腎臟和睪丸的抗炎效應(yīng)物之一。

在小鼠肺組織中，與對(duì)照組相比，NNK 處理后Prx2 和Prx5 基因表達(dá)量升高，而Prx1、Prx4 和Prx6基因表達(dá)量降低；在NNK 處理組小鼠肺組織中，上述Prx 基因?qū)?.5 mg/kg NNK 處理的響應(yīng)較5.0 mg/kg NNK 處理更加敏感；其中，Prx5 基因的最高表達(dá)量是對(duì)照組處理小鼠的28.4 倍。

在小鼠肝組織中，與對(duì)照組相比，NNK 處理后Prx4（在5.0 mg/kg NNK 處理組中）、Prx5 和Prx6（在2.5 mg/kg NNK 處理組中）基因表達(dá)量升高，而Prx1、Prx2 和Prx3 基因表達(dá)量降低；在小鼠肝組織中，Prx1、Prx2 和Prx3 基因?qū)?.5 mg/kg NNK 處理的反應(yīng)更加敏感，而Prx4、Prx5 和Prx6 基因?qū)?.0 mg/kg NNK 處理的反應(yīng)更加敏感；處理組Prx 基因的最高表達(dá)量是對(duì)照組的34.8 倍。

有研究表明，使用NNK 處理小鼠胎盤(pán)后，小鼠肝和肺組織中8-羥基-鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸水平升高，這可能是由于NNK 在代謝過(guò)程中誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)多的羥基自由基或ROS 所致；當(dāng)用綠茶、抗氧化劑等NNK 抑制劑處理A/J 小鼠時(shí)，除O6-mG 外的DNA 加合物的含量降低［20］。而Prx 蛋白最為顯著的功能是清除過(guò)氧化物，同時(shí)氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)Prx 的表達(dá)，這表明Prx 與ROS 的生成相關(guān)［13］。本研究結(jié)果也表明在NNK 處理下Prx 基因表達(dá)量發(fā)生異常，提示Prx 基因可能在NNK 導(dǎo)致組織損傷的過(guò)程中發(fā)揮一定的作用，極有可能與NNK 誘導(dǎo)下的ROS 生成有關(guān)，這就為后續(xù)Prx 基因在NNK處理下的功能研究提供了參考。

在小鼠腎組織中，與對(duì)照組相比，NNK 處理后Prx5 基因表達(dá)量升高，其他Prx 基因表達(dá)量降低；Prx1、Prx2 和Prx4 基因表達(dá)量比Prx3、Prx5 和Prx6基因低；NNK 處理組小鼠腎組織中Prx 基因的最高表達(dá)量是對(duì)照組的26.4 倍。同樣，在小鼠睪丸組織中，與對(duì)照組相比，NNK 處理后Prx5 基因表達(dá)量升高，其他Prx 基因表達(dá)量降低；NNK 處理組小鼠睪丸組織中Prx 基因的最高表達(dá)量是對(duì)照組的7.0 倍。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室及國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者的研究結(jié)果推測(cè)，在NNK 作用后，小鼠器官組織中的ROS 升高，ROS 會(huì)攻擊細(xì)胞中DNA 的脫氧鳥(niǎo)苷，使8-羥基鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸水平升高，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，而在這一過(guò)程中，Prx 基因可以通過(guò)調(diào)節(jié)其表達(dá)量，進(jìn)一步清除多余的ROS，從而使機(jī)體保持氧化還原的平衡狀態(tài)。

3 結(jié)論

對(duì)小鼠進(jìn)行了NNK 腹腔注射，并利用HE 染色和qRT-PCR 技術(shù)評(píng)價(jià)了NNK 對(duì)小鼠的毒性和Prx 基因表達(dá)的影響。與對(duì)照組小鼠相比，NNK 處理組小鼠好斗性增強(qiáng)，進(jìn)食量無(wú)較大變化，但在染毒5 周后，小鼠體質(zhì)量有所降低。HE 染色結(jié)果表明，處理組小鼠肺組織肺泡隔增生，肝組織肝血竇與肝細(xì)胞核增大，腎小球出現(xiàn)玻璃樣變性、破碎，睪丸生精小管中各級(jí)精細(xì)胞明顯減少。在NNK處理后，所有Prx 基因均被誘導(dǎo)，同一Prx 基因在不同組織中的表達(dá)量不同，且在肝組織中處理組小鼠Prx 基因的表達(dá)量最高，為對(duì)照組的34.8 倍。在NNK 脅迫下，Prx 基因的表達(dá)發(fā)生異常，結(jié)果提示Prx 基因可能在NNK 導(dǎo)致組織損傷的過(guò)程中發(fā)揮一定的作用，這就為后續(xù)Prx 基因在NNK 處理下的功能研究奠定了基礎(chǔ)，并且不同Prx 基因的功能還可能是互補(bǔ)的。對(duì)照組小鼠所有組織中Prx5基因的表達(dá)量均較低，而在NNK 處理后其表達(dá)量有所升高，在5.0 mg/kg NNK 處理后，其表達(dá)量升高較明顯，這表明Prx5 基因在NNK 脅迫下可能發(fā)揮更重要的作用，對(duì)下一步研究Prx5 在NNK 導(dǎo)致組織損傷的過(guò)程中可能發(fā)揮的功能和作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。