非極性柱下保留指數(shù)結(jié)合GC-MS/MS 分析煙草香味成分

任宗燦，陳 黎，史天彩，王曉瑜，崔華鵬，謝復(fù)煒，劉惠民

中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001

煙草香味成分既是煙葉又是卷煙風(fēng)格和品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)。獲得正確的煙草香味成分定性、定量分析數(shù)據(jù)對(duì)卷煙風(fēng)格剖析、卷煙產(chǎn)品的安全控制至關(guān)重要。目前行業(yè)普遍采用GC-MS 法結(jié)合通用型商業(yè)GC-MS 譜庫(kù)對(duì)煙草香味成分進(jìn)行定性分析［1-4］。由于煙草中成分極其復(fù)雜、質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，常有重疊峰出現(xiàn)，GC-MS 法需要進(jìn)行解卷積扣除背景等處理以提高譜庫(kù)匹配的準(zhǔn)確性［5-6］。對(duì)于低質(zhì)量分?jǐn)?shù)、多指標(biāo)的檢測(cè)方法，該過(guò)程既顯得繁瑣復(fù)雜，又難以實(shí)現(xiàn)可靠的高匹配度結(jié)果。GC-MS/MS 法靈敏度高、檢出限低、定性準(zhǔn)確、抗干擾能力強(qiáng)，可以將在色譜分離過(guò)程不能完全分開(kāi)的具有不同母離子的共流出物通過(guò)設(shè)置動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（dMRM）分離［7-8］。目前已有報(bào)道采用GC-MS/MS 法測(cè)定煙草香味成分，但覆蓋目標(biāo)物種類(lèi)及數(shù)量皆較少［9-10］。dMRM 模式的定性依據(jù)是目標(biāo)物的保留時(shí)間和特征離子對(duì)信息，目標(biāo)物的準(zhǔn)確保留時(shí)間及離子對(duì)信息需通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品獲取。但煙草成分中含有大量的同分異構(gòu)體及結(jié)構(gòu)近似的香味成分，人工合成的標(biāo)準(zhǔn)品也常為異構(gòu)體混合物，異構(gòu)體質(zhì)譜圖之間差別不明顯，僅依據(jù)譜圖匹配結(jié)果無(wú)法明確標(biāo)準(zhǔn)品中色譜峰的歸屬，導(dǎo)致異構(gòu)體之間難以區(qū)分。另一方面，在實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)中，當(dāng)儀器維護(hù)（如更換或切割色譜柱）后，目標(biāo)物保留時(shí)間會(huì)發(fā)生改變。多靶標(biāo)的GC-MS/MS 法由于目標(biāo)物繁多、掃描信息少（僅為特征離子對(duì)信息，無(wú)法進(jìn)行譜圖匹配）以及掃描時(shí)間窗口窄（目標(biāo)物保留時(shí)間偏離出時(shí)間窗口則無(wú)法進(jìn)行掃描采集）等問(wèn)題導(dǎo)致重新確定目標(biāo)物的保留時(shí)間會(huì)耗費(fèi)大量時(shí)間及精力。

保留指數(shù)（Retention index, RI）的概念由Kovats 在1958 年提出［11］。RI 表示物質(zhì)在固定液上的保留值行為，當(dāng)固定相確定時(shí)，物質(zhì)的RI 與柱溫成線(xiàn)性相關(guān)且毛細(xì)管色譜柱的極性越小RI 的重現(xiàn)性越好［12］。即當(dāng)色譜條件確定時(shí)，目標(biāo)物的RI為與其保留時(shí)間有關(guān)的常數(shù)?；诖嗽?，在復(fù)雜樣品體系中，采用RI 結(jié)合GC-MS 譜庫(kù)匹配可以明顯提高同分異構(gòu)體定性結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。利用GC-MS 法結(jié)合RI 進(jìn)行定性分析已廣泛應(yīng)用于食品、香精香料和煙草等領(lǐng)域［12-17］。然而通用型商業(yè)GC-MS 譜庫(kù)RI 信息不全，往往導(dǎo)致一些重要煙草香味成分無(wú)法被準(zhǔn)確定性；另一方面，由于RI 具有良好的穩(wěn)定性，且RI 與保留時(shí)間之間又存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，在多靶標(biāo)GC-MS/MS 方法中，利用RI 可以快速調(diào)整目標(biāo)物的掃描時(shí)間窗口。在煙草領(lǐng)域，RI 多被應(yīng)用于輔助定性分析目標(biāo)成分，而利用RI 確定多靶標(biāo)GC-MS/MS 法采集時(shí)間窗口的研究鮮有報(bào)道。因此，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品確定了241 種煙草香味成分的RI，并探究了其在確定GC-MS/MS 方法采集時(shí)間窗口中的應(yīng)用，旨在為煙草香味成分的快速分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

2016 年云南曲靖產(chǎn)C3F 等級(jí)K326 煙葉樣品。4 種檢測(cè)用煙葉樣品：1#為2015 年云南產(chǎn)清香型B2F 等級(jí)CB-1 煙葉，2#為2015 年云南產(chǎn)清香型X2F 等級(jí)CB-1 煙葉，3#為2015 年河南產(chǎn)濃香型B2F 等級(jí)中煙100 煙葉，4#為2015 年河南產(chǎn)濃香型X2F 等級(jí)中煙100 煙葉。

QuEChERS 萃取試劑盒（4 g 硫酸鎂+ 1 g 氯化鈉，美國(guó)Agilent 公司）；過(guò)濾工具包（尼龍，13 mm×0.22 μm）；241 種標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品信息見(jiàn)表1）；苯乙酮-d8（98 atom% D）、正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品C7～C40（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；磷酸（AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；磷酸二氫鈉（AR，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)J T Baker 公司）。

7890B-7000D 氣相色譜/三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）；EOFO-945066 多管式旋渦混合器（美國(guó)Talboys 公司）；3-30KS 高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；Milli-Q 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；CPA225D 電子天平（感量0.000 1 g，德國(guó)Sartorius 公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

內(nèi)標(biāo)工作溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取30 mg 的苯乙酮-d8標(biāo)準(zhǔn)品，然后用乙腈溶解并定容至10 mL，得3 000 mg/L 的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于-18 ℃冰箱中儲(chǔ)存；取0.1 mL 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配制成30 mg/L 的內(nèi)標(biāo)工作液。

混標(biāo)工作液：準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg 標(biāo)準(zhǔn)品（精確至± 0.1 mg），用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成10 000 mg/L 的單標(biāo)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取0.1 mL 各單標(biāo)儲(chǔ)備液于50 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配制成20 mg/L 的混標(biāo)工作液。

1.2.2 樣品前處理

將實(shí)驗(yàn)所用煙葉研磨成粉，過(guò)孔徑0.450 mm（40 目）篩。準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g 樣品于50 mL 具塞離心管中，依次加入0.1 mL 混標(biāo)工作液、10 mL 磷酸鹽緩沖溶液，以使樣品完全浸潤(rùn)，靜置20 min。加入0.1 mL 內(nèi)標(biāo)工作液、10 mL 乙腈，以2 500 r/min 渦旋萃取2 min，隨后放入－18 ℃的冰箱中冷凍10 min。取出后加入4 g 無(wú)水硫酸鎂、1 g 氯化鈉并迅速劇烈搖晃，再以2 500 r/min 渦旋2 min，8 000 r/min 離心3 min。取1.5 mL 上清液，加入0.2 g 無(wú)水硫酸鎂，立即以2 500 r/min 渦旋2 min，8 000 r/min離心3 min；將上清液過(guò)0.22 μm 有機(jī)相濾膜，進(jìn)行GC-MS/MS 檢測(cè)。分析條件：

色譜柱：DB-5MS UI 彈性石英毛細(xì)管柱（60 m× 0.25 mm × 0.25 μm），進(jìn)樣口端串聯(lián)預(yù)柱（5 m ×0.25 mm）；進(jìn)樣口溫度：290 ℃；程序升溫：50 ℃min）；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣，不分流時(shí)間1 min；載氣：氦氣（99.999%）；恒流流速：1.5 mL/min；進(jìn)樣量：0.8 μL。電離模式：電子轟擊（EI）；電離能量：70 eV；燈絲電流：35 μA；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；傳輸線(xiàn)溫度：280 ℃；Q2 碰撞氣：氮?dú)猓?9.999%），流量1.5 mL/min；淬滅氣：氦氣（99.999%），流量2.25 mL/min；掃描方式：動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（dMRM）。

2 結(jié)果與討論

2.1 241 種煙草香味成分RI 的測(cè)定

241 種煙草香味成分選自美國(guó)煙草添加劑清單［18］、BAT 煙草添加劑清單［19］、英國(guó)煙草添加劑清單［20］，包含了醛、酮、醇、酚、烴、醚、酯、內(nèi)酯、吡啶和吡嗪等揮發(fā)性、半揮發(fā)性香味成分、潛香成分。

在程序升溫條件下，目標(biāo)化合物RI 的計(jì)算采用正構(gòu)烷烴系列作為參考，計(jì)算公式為：

式中：x、z、z+1 分別為目標(biāo)化合物以及其流出前后相鄰正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)，t（x）、t（z）、t（z+1）分別為目標(biāo)化合物以及其流出前后相鄰正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。241 種煙草香味成分RI 的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，RI 和RI*分別為本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的和NIST 庫(kù)中非極性柱上的程序升溫保留指數(shù)?？芍?12 種目標(biāo)化合物的RI 與RI*差值皆小于10，表明目標(biāo)物在非極性柱上的重現(xiàn)性良好，實(shí)驗(yàn)所得RI 數(shù)據(jù)可以為非靶標(biāo)檢測(cè)方法提供輔助定性依據(jù)。此外，本實(shí)驗(yàn)中新補(bǔ)充了25 種NIST17 庫(kù)中未收錄成分的RI，其中包括一些重要的香味成分，如西瓜酮和1-（2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯基）-1-戊烯-3-酮等。

表1 241 種目標(biāo)成分的預(yù)測(cè)保留時(shí)間和實(shí)際測(cè)得保留時(shí)間①Tab.1 Predicted retention times and measured retention times of 241 target components

表1 （續(xù)）

表1 （續(xù)）

表1 （續(xù)）

表1 （續(xù)）

表1 （續(xù)）

2.2 RI 在同分異構(gòu)體區(qū)分中的應(yīng)用

煙草基質(zhì)是化學(xué)組成極其復(fù)雜的體系，其中含有大量的同分異構(gòu)體。通常所購(gòu)買(mǎi)的標(biāo)準(zhǔn)品也為異構(gòu)體混合物。同分異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)相似，質(zhì)譜圖差別不大，僅依靠譜圖匹配難以區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)品中的同分異構(gòu)體，而結(jié)合RI 輔助定性可以明顯提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。例如檸檬醛包含順式和反式兩種構(gòu)型，即橙花醛（編號(hào)213）和香葉醛（編號(hào)216），天然提取及化學(xué)合成的檸檬醛皆為兩種異構(gòu)體的混合物。檸檬醛標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖及色譜峰1和2 所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖如圖1 所示。NIST 譜庫(kù)檢索結(jié)果表明：峰1 與橙花醛和香葉醛的匹配度分別為86%和85%，峰2 與橙花醛及香葉醛的匹配度分別為84%和85%。因此無(wú)法通過(guò)譜圖匹配來(lái)確定兩者的色譜峰。文獻(xiàn)［21］報(bào)道，橙花醛與香葉醛的RI 分別為1 232 和1 266，即出峰順序?yàn)槌然ㄈ┰谇?、香葉醛在后，由此可初步判定檸檬醛標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖中峰1為橙花醛、峰2為香葉醛。且由本實(shí)驗(yàn)所測(cè)峰1及峰2的RI分別為1 234和1 263，與文獻(xiàn)值相近，進(jìn)一步確認(rèn)峰1為橙花醛、峰2為香葉醛。

圖1 檸檬醛標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖（a）以及色譜峰1（b）和色譜峰2（c）的質(zhì)譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of citral (a) and mass spectra of chromatographic peaks 1 (b) and 2 (c)

某些香料不同構(gòu)型的異構(gòu)體對(duì)于煙氣香吃味的影響不同。天然玫瑰醚為順式結(jié)構(gòu)，人工合成的玫瑰醚一般為異構(gòu)體的混合物。與反式玫瑰醚相比，順式玫瑰醚的玫瑰香味更強(qiáng)烈，香味閾值更低。合成的玫瑰醚中順式結(jié)構(gòu)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高香氣越好，因此檢測(cè)時(shí)需要對(duì)兩者進(jìn)行明確區(qū)分。玫瑰醚標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖及色譜峰所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2，譜圖匹配顯示標(biāo)準(zhǔn)品中兩個(gè)色譜峰皆為順式玫瑰醚。實(shí)測(cè)兩峰對(duì)應(yīng)化合物的RI 分別為1 108、1 124，既往報(bào)道稱(chēng)順式玫瑰醚［22］和反式玫瑰醚［23］的RI 分別為1 109 和1 126，因此可以確認(rèn)峰1 和峰2 分別為順式和反式玫瑰醚。

圖2 玫瑰醚標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖（a）以及色譜峰1（b）和色譜峰2（c）的質(zhì)譜圖Fig.2 Total ion current chromatogram of rose oxide (a)and mass spectra of chromatographic peaks 1 (b) and 2 (c)

2.3 RI 在dMRM 方法時(shí)間窗口校正中的應(yīng)用

在超多靶標(biāo)分析方法中，大量時(shí)間窗口的互相重疊、堆積會(huì)導(dǎo)致每對(duì)離子對(duì)的駐留時(shí)間縮短，使采集的色譜峰數(shù)據(jù)點(diǎn)減少，甚至無(wú)法采集數(shù)據(jù)。因此，為了保證色譜峰有足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)且每對(duì)離子對(duì)有足夠的駐留時(shí)間，一般會(huì)盡可能縮小時(shí)間窗口，如本方法中各目標(biāo)物時(shí)間窗口僅為0.6 min，即儀器僅在各目標(biāo)物保留時(shí)間前后0.3 min內(nèi)掃描其特征離子對(duì)。在多靶標(biāo)dMRM 方法實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)中，儀器常規(guī)維護(hù)（如更換或切割色譜柱）后，目標(biāo)物的保留時(shí)間會(huì)發(fā)生漂移，時(shí)常出現(xiàn)目標(biāo)物色譜峰偏移出時(shí)間窗口而無(wú)法采集數(shù)據(jù)的情況，影響方法的定性定量結(jié)果。由于目標(biāo)物眾多且保留時(shí)間的重疊干擾，若采用全掃描模式確定各目標(biāo)物準(zhǔn)確保留時(shí)間則需要分組進(jìn)樣檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程及數(shù)據(jù)處理花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。利用所建立的RI 庫(kù)可以快速、準(zhǔn)確地獲得各目標(biāo)物的保留時(shí)間，大大減少保留時(shí)間校正的工作量。

在更換色譜柱后，首先采用相同的程序升溫條件對(duì)正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行全掃描檢測(cè)，獲取正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。其次將各目標(biāo)物的RI 及其相鄰正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間代入公式（1）獲得241 種煙草香味成分的計(jì)算保留時(shí)間。最后以計(jì)算保留時(shí)間±0.3 min 創(chuàng)建時(shí)間窗口，建立dMRM 方法對(duì)目標(biāo)物混標(biāo)工作液進(jìn)行檢測(cè)，獲得各目標(biāo)物的準(zhǔn)確保留時(shí)間。根據(jù)計(jì)算保留時(shí)間所創(chuàng)建的時(shí)間窗口能否覆蓋目標(biāo)物的準(zhǔn)確保留時(shí)間判定該方法是否可行。各目標(biāo)物計(jì)算保留時(shí)間與準(zhǔn)確保留時(shí)間的結(jié)果見(jiàn)表1?？芍?41 種目標(biāo)物計(jì)算保留時(shí)間與準(zhǔn)確保留時(shí)間的差值皆小于0.3 min，其中232 種的 差 小于0.05 min、9 種 的差在0.05 ～0.10 min 內(nèi)。各目標(biāo)物準(zhǔn)確保留時(shí)間皆在依據(jù)計(jì)算保留時(shí)間所建立的時(shí)間窗口范圍內(nèi)。證明利用所建立的RI 庫(kù)快速確定目標(biāo)物保留時(shí)間可行。該策略可以有效縮短實(shí)驗(yàn)室日常維護(hù)工作時(shí)長(zhǎng)，也可以在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的情況下建立煙草香味成分的dMRM 分析方法。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果分析

利用化合物的RI 信息建立針對(duì)煙草241 種香味成分的dMRM 定性分析方法，并檢測(cè)了4 個(gè)煙葉樣品，共檢測(cè)出89 種化合物（表2），以此針對(duì)性地完善靶向定量方法。在4 種煙葉樣品中巨豆三烯酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其次是1-（2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯基）-1-戊烯-3-酮、3-甲基-2,5-呋喃二酮、地芰普內(nèi)酯、苯乙醛和2（5H）-呋喃酮。

表2 4 種煙葉樣品的檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Detection results of 4 tobacco leaf samples

表2 （續(xù)）

3 結(jié)論

通過(guò)RI 概念結(jié)合GC-MS/MS 技術(shù)建立了針對(duì)241 種煙草香味成分的檢測(cè)方法，探究RI 在該方法中的應(yīng)用：①建立了針對(duì)DB-5MS UI 色譜柱的RI 庫(kù)，包括241 種煙草香味成分，其中25 種成分的RI 還未被NIST17 收錄，完成了部分同分異構(gòu)體RI 值的確認(rèn)，可為煙草香味成分分析提供參考；②提出了利用RI 快速準(zhǔn)確矯正dMRM 掃描時(shí)間窗口的方法，縮短了多靶標(biāo)檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)；③探索了一種根據(jù)RI 建立煙草香味成分定性檢測(cè)方法的新策略，有助于在無(wú)靶標(biāo)的未知盲樣檢測(cè)工作中快速篩選靶標(biāo)，針對(duì)性地建立定量方法，有效降低實(shí)驗(yàn)成本。