生防細(xì)菌復(fù)配對(duì)蘋果主要病原真菌抑菌活性篩選及其穩(wěn)定性

李恩琛，張文軍，張樹武，徐秉良，劉 佳

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

蘋果是世界上栽培面積最廣的的水果之一，其富含維生素及人體必須的微量元素[1]。目前，中國是世界蘋果生產(chǎn)大國，無論是栽植面積，還是年均產(chǎn)量均居世界第一[2]。然而，蘋果病害已經(jīng)嚴(yán)重影響蘋果產(chǎn)量和質(zhì)量，制約著蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。當(dāng)前，蘋果病害的防治仍以化學(xué)農(nóng)藥為主，但是其大量或不合理使用，不但對(duì)人畜及環(huán)境造成嚴(yán)重危害，而且能夠?qū)е虏≡a(chǎn)生抗藥性[3-5]。微生物防治蘋果病害具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如對(duì)環(huán)境安全、對(duì)有益微生物無影響、對(duì)人畜健康有利、兼防兼治、促生等，是一種無公害植保新技術(shù)，目前對(duì)于微生物防治蘋果病害的研究較多，如鄧振山等[6]分離出的4株蘋果樹內(nèi)生真菌均對(duì)蘋果樹腐爛病菌有較強(qiáng)的抑制作用；馬志峰等[7]研究表明EM活性菌泥對(duì)蘋果樹腐爛病防治效果好，能有效促進(jìn)病疤的愈合；王洋娟[8]研究指出，多年施用微生物菌肥能明顯改善蘋果花臉和腐爛病發(fā)病情況。

近年來，生防細(xì)菌由于其繁殖速度快，不污染環(huán)境，對(duì)人畜健康安全，其分泌的拮抗物質(zhì)不僅對(duì)病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，而且容易生產(chǎn)，成本低，所以生防細(xì)菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景，尤其在蘋果病害防治中已成為目前研究的熱點(diǎn)之一[9-13]。然而，相關(guān)學(xué)者研究表明，單一生防細(xì)菌菌劑在實(shí)際生產(chǎn)中存在對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力弱，效果不顯著和穩(wěn)定性差等弊端，但是不同生防菌株間混配使用可以優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，增強(qiáng)生物防治效果，提高穩(wěn)定性[14]。陳志誼等[15]研究表明拮抗細(xì)菌間的混合使用可以有效提高對(duì)植物病害的防治效果；葛紅蓮等[16]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合細(xì)菌菌劑PB12不僅能夠有效防治黃瓜疫病，而且能夠促進(jìn)黃瓜幼苗生長，改善土壤酶活性。因此，將不同拮抗細(xì)菌進(jìn)行復(fù)配可以在一定程度上解決單一生防菌在實(shí)際應(yīng)用中存在的許多問題，更好的防治蘋果病害。同時(shí)，已有研究表明不同溫度、酸堿度和紫外線照射等條件對(duì)生防細(xì)菌的抑菌活性具有顯著的影響，如牛偉等[17]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B26粗提物對(duì)高溫具有一定的耐受性，對(duì)pH有比較寬的適應(yīng)范圍，但紫外照射對(duì)其抑菌活性有一定影響。然而，目前有關(guān)不同溫度、酸堿度和紫外線照射等條件對(duì)生防細(xì)菌抗蘋果主要病原菌活性方面研究較少。

本試驗(yàn)以5種蘋果主要病原菌為研究對(duì)象，測(cè)定不同生防細(xì)菌及其復(fù)配的室內(nèi)抑菌效果，以及復(fù)配生防細(xì)菌發(fā)酵液在不同環(huán)境下對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑制效果及穩(wěn)定性變化，旨在為后期新型微生物藥劑的研制與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試病原菌 蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)、蘋果炭疽葉枯病菌(Glomerellacingulata)、蘋果輪紋病菌(Macrophomakawatsukai)、蘋果霉心病菌(Alternariaalternata)和蘋果斑點(diǎn)落葉病菌(A.mali)均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 供試生防細(xì)菌 解淀粉芽孢桿菌TS-1203(TS-1203)(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌BS-1208(BS-1208)(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌GS-1209(GS-1209)(B.licheniformis)和多粘類芽孢桿菌FS-1206(FS-1206)(Paenibacilluspolymyxa)均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防細(xì)菌發(fā)酵液制備 單一生防細(xì)菌發(fā)酵液的制備：在100 mL NB中接種一環(huán)在NA上活化了24 h的生防細(xì)菌，置于28 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床黑暗振蕩12 h，獲得種子液。在無菌的NYBD(60 mL)培養(yǎng)基中接種5 mL生防細(xì)菌種子液，在同樣的條件下黑暗振蕩48 h后獲得該生防細(xì)菌發(fā)酵液。

復(fù)配生防細(xì)菌間發(fā)酵液的制備：在100 mL NB中接種一環(huán)NA上活化了24 h的生防細(xì)菌，搖床振蕩12 h，獲得種子液。在滅菌NYBD(60 mL)中加入不同比例生防細(xì)菌混合種子液5 mL(表1)，在同樣條件下?lián)u床振蕩48 h后，可獲得生防細(xì)菌發(fā)酵液。

表1 不同生防細(xì)菌種子液復(fù)配比例Table 1 The mixture ratio of different bio-control bacteria seed solution

1.2.2 生防細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)蘋果主要病原菌的抑菌作用測(cè)定 抑菌效果測(cè)定參考智小青等[18]采用的紙碟法和魏少鵬等[19]采用的菌絲生長速率法，對(duì)紙碟法略作修改。接種蘋果病害菌餅(d=5 mm)于平板中央，將分別蘸有單一或復(fù)配生防細(xì)菌發(fā)酵液的圓形紙片(d=6 mm)放于距離中心位置2 cm的“十”字兩端，以蘸有無菌水的圓形紙片作為對(duì)照，并置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5～7 d后，采用十字交叉法測(cè)量病原菌菌落直徑，每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)3次，并計(jì)算單一和復(fù)配生防菌發(fā)酵液對(duì)蘋果病菌的抑菌活性。

抑菌率=(對(duì)照病原菌落直徑-處理病原菌落直徑)/(對(duì)照病原菌落直徑-5)×100%

1.2.3 溫度對(duì)復(fù)配生防細(xì)菌抑菌穩(wěn)定性影響 依次吸取前面篩選出的最佳復(fù)配生防細(xì)菌發(fā)酵液20 mL置于無菌試管中，經(jīng)30 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃和100 ℃不同溫度的水浴鍋中處理發(fā)酵液60 min和在120 ℃的高溫滅菌鍋中滅菌30 min，當(dāng)不同溫度處理的發(fā)酵液溫度恢復(fù)至室溫時(shí)，采用紙碟法和菌絲生長速率法測(cè)定抑菌活性。對(duì)照為未進(jìn)行溫度處理的復(fù)配生防細(xì)菌發(fā)酵液，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4 紫外線對(duì)復(fù)配生防細(xì)菌抑菌穩(wěn)定性影響 吸取篩選出的備用最佳復(fù)配生防細(xì)菌發(fā)酵液20 mL于直徑90 mm無菌培養(yǎng)皿中(不加蓋)，水平放置于254 nm紫外燈下，垂直距離20 cm，分別照射1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h。采用紙碟法和菌絲生長速率法測(cè)定抑菌活性。對(duì)照不經(jīng)紫外線照射，每個(gè)處理及對(duì)照均重復(fù)3次。

1.2.5 pH對(duì)復(fù)配生防細(xì)菌抑菌穩(wěn)定性影響 吸取篩選出的備用最佳復(fù)配生防細(xì)菌發(fā)酵液 20 mL于無菌試管中，利用1 mol/L HCl或 1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)整pH為2～12，并置于28 ℃和180 r/min的恒溫?fù)u床黑暗振蕩 12 h后調(diào)回原始發(fā)酵液pH(6.3)。采用紙碟法和菌絲生長速率法測(cè)定抑菌活性。試驗(yàn)以未經(jīng)pH處理的復(fù)配生防細(xì)菌發(fā)酵液作為對(duì)照，每個(gè)處理及對(duì)照均重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用 Microsoft Excel 2010整理，并采用SPASS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件和Duncan氏新復(fù)極差法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及其差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一生防細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)蘋果主要病原菌的抑制作用

4種單一的生防細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)5種蘋果病原真菌具有不同的生長抑制作用，且不同生防細(xì)菌發(fā)酵液間存在明顯差異(圖1)。BS-1208對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌抑菌效果最好，抑菌率達(dá)65.74%(圖1-A)；TS-1203對(duì)蘋果輪紋病菌和霉心病菌抑菌效果最好，抑菌率分別達(dá)到64.92%和 65.19%(圖1-B)；FS-1206對(duì)蘋果樹腐爛病菌和蘋果斑點(diǎn)落葉病菌的抑菌效果最好，抑菌率分別達(dá)到 78.19%和72.87%(圖1-C)；GS-1209對(duì)蘋果樹腐爛病菌抑制效果最好，為63.14%(圖1-D)。因此，4種單一生防細(xì)菌對(duì)5種蘋果病原真菌的抑制作用中，F(xiàn)S-1206對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑制效果最佳。

A.枯草芽孢桿菌BS-1208；B.解淀粉芽孢桿菌TS-1203；C.多粘類芽孢桿菌FS-1206；D.地衣芽孢桿菌GS-1209；1. 蘋果炭疽葉枯病菌；2. 蘋果輪紋病菌；3. 蘋果樹腐爛病菌；4.蘋果斑點(diǎn)落葉病菌；5.蘋果霉心病菌；圖上不同小寫字母表示經(jīng) Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在0.05水平差異顯著，下同。

2.2 復(fù)配生防細(xì)菌對(duì)蘋果主要病原菌的抑制作用

研究結(jié)果表明，不同比例的復(fù)配生防細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)蘋果主要病原菌的抑制作用存在明顯差異(圖2)。在不同比例的復(fù)配菌株組合中，除 FS-1206∶TS-1203 = 2∶1對(duì)蘋果樹腐爛病菌和霉心病菌的抑制效果優(yōu)于單一菌株外，其他各復(fù)配組合均無顯著增效作用(圖2)。當(dāng)生防細(xì)菌復(fù)配比例為FS-1206∶BS-1208=2∶1時(shí)，其對(duì)蘋果輪紋病菌抑制效果最好，抑菌率為61.03%，但顯著低于單一菌株TS-1203抑菌率64.92%(圖2-A和圖1-B)；當(dāng)生防細(xì)菌復(fù)配FS-1206∶TS-1203 = 2∶1時(shí)，對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病菌抑制效果最好，抑菌率為71.58%(圖2-B和圖3)，而單一菌株FS-1206對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病菌抑菌率為72.87%(圖1-C)；當(dāng)生防細(xì)菌復(fù)配為FS-1206∶BS- 1208∶GS-1209 = 2∶1∶1時(shí)，對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌抑制效果最好，抑菌率為64.41%，單一菌株BS-1208抑菌率為65.74%(圖2-F和圖1-A)。FS-1206∶TS-1203 = 2∶1時(shí),對(duì)霉心病菌抑菌率(67.99%)相比單一菌株TS-1203(65.19%)有所提高；對(duì)蘋果樹腐爛病菌抑菌率為86.64%，顯著高于最優(yōu)單一菌株FS-1206的抑菌率 78.19%。因此，在所有復(fù)配組合中，當(dāng)生防細(xì)菌FS-1206和TS-1203復(fù)配且復(fù)配比例為2∶1時(shí)，對(duì)腐爛病菌的抑制效果最好(圖3)，與單一菌株相比能顯著提高對(duì)腐爛病菌的抑菌活性。

A.多粘類芽孢桿菌FS-1206和枯草芽孢桿菌BS-1208；B.多粘類芽孢桿菌FS-1206和解淀粉芽孢桿菌TS-1203；C.多粘類芽孢桿菌FS-1206和地衣芽孢桿菌GS-1209；D.多粘類芽孢桿菌FS-1206、解淀粉芽孢桿菌TS-1203和枯草芽孢桿菌BS-1208；E.多粘類芽孢桿菌FS-1206、解淀粉芽孢桿菌TS-1203和地衣芽孢桿菌GS-1209；F.多粘類芽孢桿菌FS-1206、枯草芽孢桿菌BS-1208和地衣芽孢桿菌GS-1209;1. 蘋果炭疽葉枯病菌；2. 蘋果輪紋病菌；3. 蘋果樹腐爛病菌；4.蘋果斑點(diǎn)落葉病菌；5.蘋果霉心病菌

2.3 溫度對(duì)復(fù)配生防細(xì)菌FS-1206與TS-1203抑菌穩(wěn)定性影響

不同溫度處理對(duì)復(fù)配生防細(xì)菌FS-1206與TS-1203的抑菌活性具有不同程度的影響。與對(duì)照相比，當(dāng)處理溫度為30～80 ℃時(shí)，其對(duì)復(fù)配生防細(xì)菌FS-1206與TS-1203發(fā)酵液的抑菌活性無顯著影響，但是當(dāng)處理溫度為100 ℃和120 ℃時(shí)，其抑菌活性逐漸降低，與對(duì)照相比差異顯著(圖4)。

2.4 紫外線對(duì)FS-1206與TS-1203復(fù)配后抑菌穩(wěn)定性影響

不同時(shí)間紫外照射處理對(duì)復(fù)配生防細(xì)菌FS-1206與TS-1203的抑菌活性具有不同程度的影響。與對(duì)照相比，當(dāng)紫外照射時(shí)間在≤3 h時(shí)，其對(duì)復(fù)配生防細(xì)菌FS-1206與TS-1203發(fā)酵液的抑菌活性影響較小。當(dāng)紫外照射時(shí)間≥4 h時(shí)，其抑菌活性逐漸下降，但抑菌率均大于70%。說明發(fā)酵液對(duì)紫外光長時(shí)間的照射有較好的穩(wěn)定性(圖5)。

A.炭疽葉枯病菌；B.輪紋病菌；C.腐爛病菌；D.斑點(diǎn)落葉病菌；E.霉心病菌；CK.CK-A～CK-E.對(duì)照

圖4 不同溫度下復(fù)配生防細(xì)菌FS-1206與TS-1203發(fā)酵液的抑菌活性Fig.4 Antifungal activity of the fermentation broth compounded with biocontrol bacteria FS-1206 and TS-1203 at different temperatures

2.5 pH對(duì)FS-1206與TS-1203復(fù)配后抑菌穩(wěn)定性影響

經(jīng)不同pH處理的發(fā)酵液在pH 6～9時(shí)其抑菌活性穩(wěn)定，在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下，發(fā)酵液對(duì)腐爛病菌的抑菌率與對(duì)照相比呈顯著性差異，但其抑菌率均大于71%，即復(fù)配發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)對(duì)強(qiáng)酸強(qiáng)堿有較好的耐受性(圖6)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，4種單一生防細(xì)菌中多粘類芽孢桿菌FS-1206對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑制效果最好；不同生防細(xì)菌間復(fù)配，當(dāng)多粘類芽孢桿菌FS-1206∶解淀粉芽孢桿菌TS-1203=2∶1時(shí)，對(duì)蘋果樹腐爛病的抑菌效果最好，其抑菌率要顯著優(yōu)于單個(gè)生防細(xì)菌多粘類芽孢桿菌FS-1206。翟一軍等[20]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)配細(xì)菌生物防治效果優(yōu)異，較單一菌株適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，定殖能力好，并能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性。本試驗(yàn)中將不同生防細(xì)菌混合發(fā)酵之后，發(fā)現(xiàn)復(fù)配生防細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑菌效果明顯優(yōu)于單一生防細(xì)菌，其可能原因是兩菌株間協(xié)同增效，產(chǎn)生多種拮抗物質(zhì)共同作用，這與申愛榮等[21]、易龍等[22]、李湘民等[23]和陶晶等[24]學(xué)者報(bào)道的兩種生防細(xì)菌復(fù)配對(duì)馬鈴薯青枯病、煙草赤星病、水稻紋枯病和番茄立枯病的防治效果優(yōu)于單一菌株的研究結(jié)果一致。

圖5 紫外線不同照射時(shí)間下FS-1206與TS-1203復(fù)配后發(fā)酵液的抑菌活性Fig.5 Antifungal activity of fermentation broth after compounding FS-1206 and TS-1203 under different ultraviolet irradiation time

圖6 FS-1206與TS-1203復(fù)配發(fā)酵液在不同pH下的抑菌活性Fig.6 Antifungal activity of FS-1206 and TS-1203 mixed fermentation broth at different pH

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，生防細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)的穩(wěn)定性易受到周圍環(huán)境因素的影響，多種防效良好的生防菌株由于其拮抗物質(zhì)穩(wěn)定性差而難以進(jìn)一步利用[25]。岳東霞等[26]發(fā)現(xiàn)紫外線對(duì)黃瓜內(nèi)生性細(xì)菌枯草芽孢桿菌B10的抑菌活性影響不明顯，而溫度過高或者酸堿度過大會(huì)明顯影響其抑菌活性。張慧等[27]研究表明紫外線照射、高溫和強(qiáng)酸強(qiáng)堿的處理對(duì)枯草芽孢桿菌CS16抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性影響較小。侯寶宏等[28]表明在紫外線照射、高溫和極酸極堿條件對(duì)解淀粉芽孢桿菌TS-1203發(fā)酵粗提液的穩(wěn)定性有一定的影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)S-1206與TS-1203復(fù)配后發(fā)酵液產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性良好，其中紫外線對(duì)其抑菌活性影響較小。同時(shí)，在高溫和強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下，復(fù)配發(fā)酵液也具有較好的穩(wěn)定性。綜上，F(xiàn)S-1206與TS-1203復(fù)配發(fā)酵液在蘋果樹腐爛病防治方面具有良好的應(yīng)用前景。此外，關(guān)于此復(fù)配發(fā)酵液的田間試驗(yàn)效果有待進(jìn)一步深入研究。