“黃金洗劑”逆轉(zhuǎn)ESBLs+E.coli耐藥性的體外實驗研究*

衡雪源，左志文，朱德全，劉江濤，張 磊，王立坤，彭善鑫，朱曉松，王善超

(1.山東省臨沂市人民醫(yī)院多重耐藥菌與真菌感染控制研究所，山東臨沂 276000；2.山東省臨沂市人民醫(yī)院肛腸科，山東臨沂 276000；3.北京航空航天大學(xué)醫(yī)工交叉創(chuàng)新研究院/北航大數(shù)據(jù)精準(zhǔn)醫(yī)療高精尖創(chuàng)新中心，北京 100191)

肛腸疾病屬于臨床多發(fā)病，其發(fā)病率高達(dá)59%，手術(shù)治療是常用方式，而由于肛門位置的特殊性，條件致病菌極易導(dǎo)致創(chuàng)面感染，不僅降低手術(shù)成功率，還嚴(yán)重影響患者術(shù)后康復(fù)效果[1]。李敏皓等[2]通過分析220例肛腸手術(shù)患者切口周圍分泌物的菌群變化，發(fā)現(xiàn)全部患者檢出的細(xì)菌包括大腸埃希菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、腸球菌、白色念珠菌等，而E.coli占比超過50%。E.coli是臨床中常見的條件致病菌，可能引起尿路感染、血行感染和腸道感染等，在近10年的檢測標(biāo)本中，E.coli的檢出數(shù)量歷年均居前5位[3]。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是一種主要由質(zhì)粒介導(dǎo)的能水解青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)類抗菌藥物的β-內(nèi)酰胺酶[4]。ESBLs對抗菌藥物的選擇要求較高，極易引起新的耐藥株產(chǎn)生，隨著臨床抗菌藥物的大量使用和不合理使用，產(chǎn)ESBLs的E.coli(ESBLs+E.coli)的檢出率呈逐年上升的趨勢，給臨床抗感染診療帶來極大的挑戰(zhàn)[5]。因此，進(jìn)行延緩或逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的相關(guān)研究具有重要意義。在肛腸疾病手術(shù)后，除了傳統(tǒng)的抗菌藥物治療，常采用復(fù)方黃柏洗劑進(jìn)行坐浴輔助治療，其效果明顯優(yōu)于單純抗菌藥物治療。本研究主要探討復(fù)方黃柏洗劑改良方“黃金洗劑”對ESBLs+E.coli的體外抗菌效果及其逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥的部分機(jī)制，以期為臨床中藥與抗菌藥物聯(lián)合使用治療感染性疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1菌株來源 依據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的抗菌藥物藥敏試驗操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，從2018年12月至2019年6月山東省臨沂市人民醫(yī)院多重耐藥菌與真菌感染控制研究所分離的菌株中篩選出20株ESBLs+E.coli作為實驗菌株。銅綠假單胞菌(ATCC25873)為本研究所保存的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株，作為生物膜檢測的陽性對照。

1.2試劑 頭孢噻肟(CTX，30 μg)、頭孢曲松(CRO，30 μg)、頭孢吡肟(FEP，30 μg)藥敏紙片購自英國Oxoid公司；頭孢噻肟(CTX)粉末購自中國藥品生物制品檢定所。三氯乙酸(TCA)購自北京索萊寶科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂購自杭州濱和微生物試劑有限公司；蛋白檢測試劑盒購自天根生化科技有限公司；結(jié)晶紫染液購自法國生物梅里埃公司。

1.3方法

1.3.1中藥“黃金洗劑”的制備 復(fù)方黃柏洗劑應(yīng)用于各類痔瘡及肛門疼痛、術(shù)后的治療等有較好的療效[7]，山東省臨沂市人民醫(yī)院肛腸科在復(fù)方黃柏洗劑經(jīng)典方的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改良，得到“黃金洗劑”，效果甚佳，本研究探討其對ESBLs+E.coli耐藥性的逆轉(zhuǎn)效果。“黃金洗劑”的配方如下：黃柏20 g，金銀花20 g，苦參20 g，荊芥20 g，荔枝草30 g，白礬20 g，玄明粉 10 g，川椒30 g，經(jīng)醫(yī)院制劑室自動煎藥機(jī)濃煎，最終原藥材質(zhì)量與煎液體積比為1.0 g/mL，瓶裝備用。

1.3.2中藥“黃金洗劑”最低抑菌濃度(MIC)檢測 采用試管稀釋培養(yǎng)法檢測MIC。接種ESBLs+E.coli 1×106cfu/mL，分別置于含不同濃度“黃金洗劑”的肉湯中培養(yǎng)，以無中藥的肉湯培養(yǎng)基為對照，24、48、168 h時觀察試管的渾濁程度，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：肉湯完全清亮表示無細(xì)菌生長，記為-；肉湯渾濁表示有細(xì)菌生長，記為+。以肉眼觀察無細(xì)菌生長試管中的最低藥物濃度為MIC值[8]。

1.3.3藥敏檢測 將中藥“黃金洗劑”配制成低于MIC的肉湯(含藥0.5 g/mL和0.1 g/mL)，以無中藥肉湯為對照(中藥未處理組)，接種ESBLs+E.coli 1×106cfu/mL，分別培養(yǎng)24、48、168 h后(中藥處理組)，采用改良Kirby-Bailer法，參照CLSI推薦的方法判定結(jié)果[6]。測量并比較中藥處理前后抑菌圈直徑(單位：mm)。中藥方劑逆轉(zhuǎn)耐藥菌株的逆轉(zhuǎn)率計算公式：逆轉(zhuǎn)率=(D2-D1)/D1×100%(D1為干預(yù)前的藥敏直徑，D2為干預(yù)后的藥敏直徑)。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.4生物膜抑菌率的檢測 將菌液加入96孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，無菌生理鹽水清洗數(shù)次后，在超凈工作臺上完全風(fēng)干。加入結(jié)晶紫染液，室溫染色，無菌雙蒸水清洗數(shù)次，自然完全風(fēng)干。加入33%冰醋酸，脫色10 min后于575 nm處檢測吸光度(A)值。分別以新鮮培養(yǎng)基、ATCC25873菌液作為陰性對照組和陽性對照組，做3個平行重復(fù)實驗。生物膜的抑制率(BIR)=(A0-A1)/A0×100%(A0為中藥未處理組的A值，A1為中藥處理組的A值)。

1.3.5細(xì)菌粗酶提取與ESBLs酶活性的檢測 取等量ESBLs+E.coli于無菌小管中，離心后留菌備用。磷酸鹽(PBS)緩沖液重懸細(xì)菌，反復(fù)凍融8～10次，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，留取上清。將60 μL的0.01 mol/L PBS、60 μL的100 μg/mL CTX溶液和30 μL的粗酶提取液分別加入96孔板中，于37 ℃孵育，精確計時，加入終止液60 μL的5%三氯乙酸終止反應(yīng)，于235 nm檢測A值。60 μL CTX作為空白對照，做3個平行重復(fù)實驗。

酶活性單位：在37 ℃，pH值為7.0時，每1 mL酶液內(nèi)每1 mg活性蛋白質(zhì)每1 min內(nèi)水解底物的量。酶活性單位(U)=△A/0.03×T；公式中△A為37 ℃，235 nm下的AN-A0，AN為測試后數(shù)值，A0為空白值；0.03是將酶液體積換算成1 mL；T是酶與底物的反應(yīng)時間。

2 結(jié) 果

2.1中藥“黃金洗劑”MIC的檢測結(jié)果 通過試管稀釋培養(yǎng)法檢測“黃金洗劑”的MIC發(fā)現(xiàn)，中藥處理ESBLs+E.coli 24、48、168 h都能夠抑制細(xì)菌的生長，“黃金洗劑”對ESBLs+E.coli具有一定的抑菌作用，其MIC為0.6 g/mL。見表1。

表1 不同濃度“黃金洗劑”對ESBLs+E.coli的抑菌效果

2.2中藥“黃金洗劑”對ESBLs+E.coli耐藥性的逆轉(zhuǎn)效果 通過檢測中藥處理后的細(xì)菌對抗菌藥物的抑菌圈直徑發(fā)現(xiàn)，與中藥未處理組相比，經(jīng)中藥處理24 h的ESBLs+E.coli對FEP抑菌圈直徑明顯變大，而對CTX和CRO的抑菌圈直徑大小變化并不大，見圖1。根據(jù)測得的抑菌圈直徑計算逆轉(zhuǎn)率，0.5 g/mL的中藥“黃金洗劑”作用于ESBLs+E.coli 24 h，能夠逆轉(zhuǎn)細(xì)菌對第四代頭孢菌素FEP的耐藥性，逆轉(zhuǎn)率為(13.9±1.2)%，而對第三代頭孢菌素CTX和CRO的影響不大。0.1 g/mL的中藥對FEP、CTX和CRO無明顯影響。見表2。

圖1 中藥“黃金洗劑”處理前后ESBLs+E.coli分離株對抗菌藥物的耐藥性變化

表2 中藥“黃金洗劑”逆轉(zhuǎn)ESBLs+E.coli耐藥的逆轉(zhuǎn)率

2.3中藥“黃金洗劑”對ESBLs+E.coli生物膜形成的影響 通過結(jié)晶紫染色法分析中藥對細(xì)菌生物膜形成的影響發(fā)現(xiàn)，與中藥未處理組相比，中藥處理組能夠明顯抑制生物膜的形成，0.5 g/mL的中藥處理24 h時，生物膜抑制效果最佳，生物膜抑制率可以達(dá)到63%，見圖2。

2.4中藥“黃金洗劑”對ESBLs酶活性的影響 通過分析中藥對ESBLs活性的影響發(fā)現(xiàn)，與中藥未處理組相比，0.5 g/mL的中藥處理細(xì)菌24 h能夠明顯抑制ESBLs的活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，酶活性單位從0.50 U降到0.35 U，見圖3。另外，0.5 g/mL和0.1 g/mL的中藥處理細(xì)菌48 h，也能夠略微抑制ESBLs的酶活性，與中藥未處理組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖2 中藥“黃金洗劑”對ESBLs+E.coli生物膜形成的抑制作用

注：與中藥未處理組比較，*P<0.05。

3 討 論

肛腸疾病患者的機(jī)體免疫功能減退，極易發(fā)生條件致病菌感染，尤其是E.coli的感染。同時，ESBLs+E.coli的臨床分離率逐年升高，情況越來越嚴(yán)重，給抗感染治療帶來了極大的困難。單純使用抗菌藥物治療E.coli感染極易產(chǎn)生新的耐藥菌，因此，除了常規(guī)的抗菌藥物治療感染性肛腸疾病，常通過中藥坐浴或者外敷進(jìn)行輔助治療。一方面，中藥坐浴可以達(dá)到消腫止痛的目的；另一方面，清熱燥濕或瀉火解毒等功效的中草藥不僅具有廣譜抗菌作用，同時也具有降低細(xì)菌耐藥性的功能[9-11]。

復(fù)方黃柏洗劑改良方中藥“黃金洗劑”的主藥是黃柏、苦參、金銀花，黃柏具有清熱燥濕、抑菌消炎、瀉火解毒的功效，苦參可清熱解毒，金銀花能消腫燥濕、清熱解毒，在肛腸疾病抗感染治療中效果甚佳[9,12]。黃柏提取液對耐青霉素細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶有不同程度的抑制作用，金銀花水煎劑對質(zhì)粒的消除率較高[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，外用中藥“黃金洗劑”能夠有效抑制ESBLs+E.coli的生長，測得中藥“黃金洗劑”的MIC為0.6 g/mL。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，0.5 g/mL的中藥“黃金洗劑”處理ESBLs+E.coli 24 h，能夠有效逆轉(zhuǎn)ESBLs+E.coli對FEP的耐藥性。以上研究結(jié)果提示在肛腸疾病抗感染治療中輔以中藥“黃金洗劑”治療，能夠減少耐藥菌的出現(xiàn)，提高治愈率。考慮到中藥可以通過改變生物膜形成、影響酶活性等途徑逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性[9]，本研究進(jìn)行了進(jìn)一步機(jī)制研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5 g/mL中藥“黃金洗劑”處理細(xì)菌24 h時對生物膜形成的抑制率能達(dá)到63%，而此時只表現(xiàn)出對FEP耐藥性的明顯改變，對CTX、CRO的效果并不明顯，這可能與3種抗菌藥物本身的生物膜穿透能力與穿透方式有關(guān)，需要進(jìn)一步深入探討。另外，檢測中藥“黃金洗劑”處理對酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5 g/mL的中藥“黃金洗劑”作用細(xì)菌24 h對ESBLs活性的影響最大，可見中藥“黃金洗劑”能夠部分逆轉(zhuǎn)細(xì)菌對FEP的耐藥性，而沒有逆轉(zhuǎn)其對CTX、CRO的耐藥性，也可能與中藥對酶的影響有關(guān)，中藥改變了ESBLs對第四代頭孢菌素的耐藥性，而沒能改變對第三代頭孢菌素的耐藥性。在進(jìn)行機(jī)制探討的過程中，本研究發(fā)現(xiàn)中藥“黃金洗劑”作用ESBLs+E.coli 24 h效果最好，并沒有呈現(xiàn)“隨著作用時間延長效果提高”的現(xiàn)象，這可能與中藥有效成分被細(xì)菌消耗有關(guān)，也可能與細(xì)菌應(yīng)對外界不利條件產(chǎn)生群體感應(yīng)有關(guān)[14]，具體原因有待進(jìn)一步研究。以上結(jié)果提示中藥作用時間并不是越長越好，而是存在最佳的作用時間，中藥在最佳作用時間才能夠有效地抑制生物膜的形成和ESBLs的酶活性。

鑒于合成藥物可能存在一定的不良反應(yīng)，中草藥在感染性疾病的治療中發(fā)揮的作用越來越大。有研究發(fā)現(xiàn)，藥用草本植物的水提物或者醇提物都具有抑制腸桿菌科細(xì)菌生長的功效，這為中草藥在抗感染治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)中藥“黃金洗劑”能夠抑制細(xì)菌生長、逆轉(zhuǎn)耐藥菌的耐藥性，這為抗菌藥物聯(lián)合中藥治療耐藥菌感染提供了依據(jù)。但本研究仍有不足，需要進(jìn)一步探討分析真正起到逆轉(zhuǎn)耐藥作用的成分，為耐藥菌的防治提供更加有利的指導(dǎo)。

4 結(jié) 論

綜上所述，中藥“黃金洗劑”能夠有效抑制ESBLs+E.coli的生長，還能通過改變細(xì)菌生物膜形成，影響ESBLs活性，從而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥菌耐藥性的作用，在臨床抗感染治療中可與抗菌藥物配伍更好地發(fā)揮其作用。