多靶點(diǎn)分子對(duì)接研究艾葉抗乙肝病毒的有效成分

王衛(wèi)京，詹世平，丁仕強(qiáng)

（大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧大連 116622）

1 概述

感染乙肝病毒（HBV）可導(dǎo)致慢性乙型肝炎，會(huì)發(fā)展成為肝硬化、肝癌等疾病。乙肝病毒感染是最嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。目前用于抗乙肝病毒的藥物有兩種；

1）干擾素；

2）核苷類似物。

但這些藥物對(duì)乙肝病毒只能功能性抑制，一旦乙肝病毒發(fā)生變異，就會(huì)對(duì)藥物產(chǎn)生抗藥性。因此，研究新型抗乙肝病毒藥仍是一個(gè)十分緊迫的問(wèn)題。

中藥治乙肝的歷史十分悠久，具有多途徑，副反應(yīng)小，價(jià)格便宜的特點(diǎn)，是研究抗乙肝病毒藥物的一個(gè)重要領(lǐng)域。彭立生等研究了葉下珠提取物對(duì)乙肝病毒及X基因的抑制作用。王羿今利用數(shù)據(jù)挖掘研究了茵陳蒿湯治療慢性乙肝的作用機(jī)制。趙志鴻等研究了艾葉提取物對(duì)乙肝病毒抑制作用，結(jié)果表明，艾葉提取物對(duì)HBsAg和HBeAg的分泌有明顯的抑制作用，對(duì)HBV DNA的復(fù)制有一定的抑制作用，并呈劑量依賴性。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，分子對(duì)接技術(shù)也越來(lái)越多地應(yīng)用于中藥活性成分的分析。姚香草等采用分子對(duì)接研究了雞骨草抗乙肝病毒的活性分子，對(duì)接分?jǐn)?shù)較高的主要為三萜皂苷類、有機(jī)酸類、黃酮類及氨基酸類成分。孫硯輝利用分析對(duì)接技術(shù)輔助篩選了氧化苦參堿治療乙型肝炎的蛋白結(jié)合靶標(biāo)。周厚琴等通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)分析了赤芍治療膽汁淤積型肝炎的作用機(jī)制，篩選了其中有顯著療效的成分。

乙肝病毒屬于嗜肝DNA病毒科，其病毒顆粒由病毒基因組、核衣殼和囊膜組成。HBV病毒基因組有四個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼Core蛋白即核衣殼蛋白，pre-core蛋白，Pol蛋白，x蛋白以及S蛋白（L，M，S）。pre-core蛋白與HBeAg的合成與分泌有關(guān)，S蛋白是病毒包膜蛋白。與乙肝病毒復(fù)制有關(guān)的蛋白則為核衣殼蛋白，Pol蛋白即乙肝病毒聚合酶，以及x蛋白HBx。乙肝病毒核衣殼蛋白組成乙肝病毒核衣殼，對(duì)乙肝病毒的復(fù)制有重要作用。乙肝病毒聚合酶在裝配新的病毒顆粒以及由RNA逆轉(zhuǎn)錄DNA的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，是核苷類藥物的作用靶點(diǎn)。乙肝病毒x蛋白HBx是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，它通過(guò)對(duì)信號(hào)通路、細(xì)胞周期等方面的調(diào)控，在HBV復(fù)制時(shí)起到重要作用。由于核衣殼蛋白，聚合酶以及HBx在乙肝病毒復(fù)制過(guò)程中作用十分重要，本研究就以這三種蛋白為靶點(diǎn)，篩選艾葉中的有效成分。

2 計(jì)算方法

艾葉的組分來(lái)源于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以分子量小于500，氫鍵給體數(shù)目小于5，氫鍵受體數(shù)目小于10為標(biāo)準(zhǔn)先對(duì)其進(jìn)行一輪篩選。用iGEMDOCK將艾葉組分和三個(gè)靶點(diǎn)分別進(jìn)行分子對(duì)接，初步篩選出30個(gè)與靶點(diǎn)對(duì)接較好的組分。然后再用Ledock做進(jìn)一步篩選，篩選出10個(gè)與靶點(diǎn)對(duì)接能較低的組分。

乙肝病毒核衣殼蛋白的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)源于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org），PDB ID為5E0I，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。乙肝病毒聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)還沒(méi)有解析出來(lái)，本研究利用同源模建的方法構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)。首先在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NBCI）數(shù)據(jù)庫(kù)中找到乙肝病毒聚合酶的一級(jí)序列BAQ95565.1，然后利用BLAST程序在PDB庫(kù)中找到其同源性最高的蛋白質(zhì)晶體6IK9作為建模模板，二者序列同源性為29.64%。在SWISS-MODEL網(wǎng)站進(jìn)行同源模建，得到的蛋白質(zhì)模型經(jīng)拉氏圖評(píng)估后，其有1.4%的氨基酸不在合理區(qū)間內(nèi)，模型較為合理。該模型結(jié)構(gòu)，如圖2所示。

圖1 核衣殼蛋白結(jié)構(gòu)

圖2 聚合酶模型結(jié)構(gòu)

蛋白HBx目前也沒(méi)有解析出其晶體結(jié)構(gòu)，而且在NBCI數(shù)據(jù)庫(kù)中也沒(méi)有找到與其同源性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)，但其含有154個(gè)氨基酸，氨基酸數(shù)目較少，故對(duì)其三維結(jié)構(gòu)采用從頭預(yù)測(cè)的方法建模。在NBCI數(shù)據(jù)庫(kù)中找到該蛋白質(zhì)的一級(jí)序列BAQ95563.1，上傳該序列至從頭預(yù)測(cè)網(wǎng)站QUARK，建立該蛋白質(zhì)模型。該模型經(jīng)拉氏圖評(píng)估后，有5.5%的氨基酸在不合理區(qū)間內(nèi)，模型較為合理。得到的模型結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 HBx蛋白模型結(jié)構(gòu)

3 結(jié)果與討論

經(jīng)過(guò)兩輪對(duì)接后，艾葉組分中與各靶點(diǎn)對(duì)接能位于前10的組分，如表1、2、3所示。

表1 艾葉組分與核衣殼蛋白的對(duì)接結(jié)果

表2 艾葉組分與聚合酶的對(duì)接結(jié)果

從表中的對(duì)接結(jié)果來(lái)看，總體上艾葉組分與乙肝病毒聚合酶的對(duì)接能最低，其次是HBx蛋白，而與核衣殼蛋白的對(duì)接能則與前兩個(gè)蛋白有一定差距。這表明艾葉對(duì)乙肝病毒的抑制作用主要是通過(guò)抑制聚合酶和HBx蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)，而對(duì)核衣殼蛋白的抑制作用相對(duì)較弱。很有可能聚合酶和HBx蛋白就是艾葉組分的作用靶點(diǎn)。

表3 艾葉組分與HBx蛋白的對(duì)接結(jié)果

從表2和表3可以看出，艾葉組分和聚合酶及HBx蛋白對(duì)接能均較低，其中與聚合酶的結(jié)合能整體上還要更低一點(diǎn)，這說(shuō)明艾葉組分與聚合酶的結(jié)合能力更強(qiáng)一些。圖4和圖5分別是艾葉組分與HBx蛋白和聚合酶的對(duì)接位點(diǎn)情況。從圖4可以看出，不同艾葉組分與HBx的對(duì)接位點(diǎn)非常集中，能夠很好地抑制該蛋白的活性，但艾葉組分與聚合酶的結(jié)合就比較分散，特別是在圖5中，箭頭所指的有可能是逆轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域，只有一個(gè)組分quercetin與之結(jié)合。在乙肝病毒中，HBx是一個(gè)多功能蛋白，它通過(guò)對(duì)細(xì)胞中各種蛋白及信號(hào)通路的調(diào)控，在HBV基因轉(zhuǎn)錄中起重要作用。HBV的RNA則是通過(guò)聚合酶逆轉(zhuǎn)錄成DNA，再裝配成新的病毒。而對(duì)接結(jié)果表明，艾葉組分對(duì)HBx蛋白活性抑制作用較強(qiáng)，進(jìn)而也就抑制了HBV基因轉(zhuǎn)錄成RNA，然后再翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程。雖然艾葉組分與聚合酶的對(duì)接能較低，但位于可能的逆轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的組分卻只有一個(gè)，導(dǎo)致整體上艾葉組分對(duì)DNA的復(fù)制抑制作用較弱。這從側(cè)面印證了趙志鴻等[3]經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論：艾葉提取物可能作用于HBV的蛋白表達(dá)水平，而不在DNA復(fù)制階段。

圖4 艾葉組分和HBx的對(duì)接位點(diǎn)

圖5 艾葉組分和聚合酶的對(duì)接位點(diǎn)

在艾葉組分中，quercetin、eupatilin以及（2R）-5，7-dihydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）chroman-4-one均對(duì)三個(gè)靶點(diǎn)起到抑制作用，這體現(xiàn)了中藥的特點(diǎn)，即多個(gè)組分對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)作用，使病毒很難產(chǎn)生抗藥性。組分quercetin對(duì)三個(gè)靶點(diǎn)均有較強(qiáng)的抑制作用，值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在乙肝病毒中，乙肝核衣殼蛋白，聚合酶以及HBx蛋白均對(duì)乙肝病毒的復(fù)制起重要作用。本文以這三種蛋白為靶點(diǎn)，用分子對(duì)接軟件iGEMDOCK和Ledock對(duì)艾葉組分進(jìn)行研究。對(duì)接結(jié)果顯示，艾葉組分主要對(duì)HBx蛋白的抑制作用較強(qiáng)，而對(duì)核衣殼蛋白抑制作用較弱。艾葉組分和聚合酶的對(duì)接能雖然較低，但對(duì)接位點(diǎn)分散且在可能的逆轉(zhuǎn)錄區(qū)域結(jié)合組分少，削弱了艾葉組分對(duì)聚合酶的抑制作用。在艾葉中，多種組分對(duì)靶點(diǎn)蛋白有抑制作用，其中quercetin對(duì)三個(gè)靶點(diǎn)均有較強(qiáng)的抑制作用。