基于海洋多糖的納米給藥系統(tǒng)的研究*

劉晨光，池 哲，丁園園

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266100)

在納米技術(shù)領(lǐng)域，納米粒是指粒徑在 1～100 nm之間的顆粒；而藥劑學(xué)中的納米粒(納米藥物或納米給藥系統(tǒng))一般是指粒徑在 10～1 000 nm之間用于遞送藥物或生物分子的納米載體，主要包括納米球、納米囊、納米膠束、納米脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒等。與傳統(tǒng)的藥物劑型相比，納米給藥系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢：(1)能穿透毛細血管避免了吞噬細胞的快速清除作用，延長了其在血液中的存留時間；(2)可以透過細胞和組織間隙到達肝、脾、肺、脊髓和淋巴等靶器官；(3)由材料本身的生物降解性、pH、離子和/或溫度敏感性決定了所負載藥物的控釋特性等。目前，納米給藥系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于小分子藥物、多肽、蛋白質(zhì)(疫苗)、核酸等領(lǐng)域，在生物、醫(yī)學(xué)和制藥等領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力[1-3]。研究主要內(nèi)容包括：(1)選擇適當(dāng)種類的載體材料和配比，以獲得適當(dāng)?shù)乃幬镝尫潘俣龋?2)篩選特異性配基修飾納米粒的表面，以提高其藥物遞送的靶向性；(3)研究納米粒與血液、靶向組織器官等相互作用的體內(nèi)動力學(xué)過程；(4)優(yōu)化納米粒的制備方法，提高其載藥能力及工業(yè)化生產(chǎn)的可能性；(5)進行相關(guān)的臨床的實驗。制備納米給藥系統(tǒng)的原料必須具有生物相容性，還應(yīng)可生物降解，常用的材料包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯、多糖(如殼聚糖)、聚丙烯酸系列、蛋白質(zhì)或多肽(如明膠)等，其中多糖是制備納米給藥系統(tǒng)最常用的材料[4]。

多糖(如纖維素、幾丁質(zhì)等)是地球上含量最豐富的天然聚合物。在過去的幾十年里來源于海洋生物的多糖類物質(zhì)(以下簡稱“海洋多糖”)不僅成為學(xué)術(shù)研究的熱點，也吸引了醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。主要是因為海洋多糖具有多樣的生物活性，在生物、醫(yī)藥和健康領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。海洋多糖主要來源于海洋植物、海洋動物和海洋微生物。大型海藻(主要包括褐藻、紅藻和綠藻三類)是海洋多糖的主要來源。其中，褐藻中富含褐藻膠多糖(Alginate)、巖藻多糖(Fucoidan)等；紅藻中以卡拉膠多糖(Carrageenan)、瓊膠多糖(Agarose)等為主；綠藻則主要含石莼多糖(Ulvan)。海藻多糖一般為水溶性，大都含有硫酸基團，具有很強的凝膠性和增稠性。組成海藻多糖的單糖單位主要包括葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、巖藻糖(見圖1)等[5]。海洋多糖的另一個重要來源是海洋動物，其結(jié)構(gòu)更復(fù)雜多樣，如甲殼動物含有大量的幾丁質(zhì)(Chitin)；海參中含有大量的巖藻糖基化硫酸軟骨素(Fucosylated chondroitin sulfate)和高硫酸化巖藻聚糖(Highly sulfated fucoidan)；鯊魚皮膚中含有透明質(zhì)酸(Hyaluronan)、鯊魚軟骨中有大量的硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate)(見圖2)；另外，軟體動物扇貝、文蛤、鮑魚、海兔等富含糖蛋白或糖胺聚糖等。部分海洋細菌和真菌可以產(chǎn)生種類多樣的胞外多糖，由于可以通過發(fā)酵進行規(guī)?；a(chǎn)，是海洋多糖一個潛在的重要來源。

圖1 植物來源多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of plant-derived polysaccharide

圖2 動物來源多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig. 2 Chemical structure of animal-derived polysaccharides

海洋多糖具有來源豐富、低毒性、易生物降解、生物相容性好、親水性好等特點；同時，其多糖鏈上大量游離羥基和羧基的存在，使化學(xué)改性變的非常容易。另一方面，海洋多糖的一些獨特理化性質(zhì)，還為制備主動靶向納米材料提供了可能。例如利用海藻酸鈉和殼聚糖的生物粘附性可制備定位于粘膜的納米粒；利用石莼多糖含有的大量鼠李糖殘基可制備巨噬細胞靶向的納米粒；而透明質(zhì)酸納米?？捎糜诎邢駽D44和CD168過度表達的癌細胞和炎癥細胞等[6]。因此，海洋多糖是制備藥物(或生物活性物質(zhì))遞送納米材料的理想原料。本文將基于我們實驗室近十幾年關(guān)于納米給藥系統(tǒng)的研究成果，綜述納米粒的制備方法、應(yīng)用研究的最新進展、指出了目前研究中存在的問題，同時對該領(lǐng)域未來的發(fā)展趨勢進行了展望。

1 多糖納米給藥系統(tǒng)的制備方法

依據(jù)原材料的性質(zhì)和載體功能的不同需求，納米材料的制備方法主要有兩類：(1)自上而下法(Top-down methods)：即由大變小法，是用機械的方法將宏觀尺度較大的材料轉(zhuǎn)化為小單元的方法，常用的方法有膠體磨碾磨法、高壓均質(zhì)法、納米噴霧干燥法等；(2)自下而上法(Bottom-up methods)：即由小變大法，是在原子和分子水平上，通過分子或膠體顆粒間的結(jié)合來構(gòu)筑納米載體。由于該方法可在原子、分子水平上設(shè)計載體的結(jié)構(gòu)和性能，因此可裝備出高質(zhì)量的納米材料，是制備納米材料的主流技術(shù)。主要方法包括交聯(lián)法、自組裝法和綴合物合成法等[7]?；诤Ｑ蠖嗵堑募{米材料的制備主要是采用這一技術(shù)。

1.1 交聯(lián)法

1.1.1 共價交聯(lián)法 共價交聯(lián)法是利用多糖分子鏈上的羥基、氨基或羧基等能與交聯(lián)劑(戊二醛、甲醛、甘油醛、環(huán)氧氯丙烷等)上的活潑基團發(fā)生共價交聯(lián)反應(yīng)制備納米粒的方法。例如，將殼聚糖溶液分散于油相(石蠟油、礦物油、植物油等)制備油包水型(W/O)乳液，同時加入適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑(如戊二醛等)對納米粒進行固化(見圖3a)。該方法制備的納米粒可形成穩(wěn)定的剛性三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能吸附水分和生物活性成分。但這種方法使用的交聯(lián)劑，往往具有細胞毒性，對所負載藥物的活性也有影響。因此，近來已被一些新型的低毒性交聯(lián)劑，如京尼平(Genipin)、1—乙基—3—(3—二甲氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)、天然二元和三元羧酸所替代。

1.1.2 離子交聯(lián)法 離子交聯(lián)法主要通過正、負電荷間的靜電作用來制備納米粒。在帶電荷的小分子存在的條件下，帶相反電荷的多糖分子被結(jié)合在一起形成納米粒子(見圖3b)。例如，帶正電荷的殼聚糖分子通過與帶負電荷三聚磷酸鈉分子的靜電作用而形成納米粒；離子交聯(lián)法制備納米粒的條件溫和、對所負載的藥物，特別是生物大分子藥物(如多肽和蛋白質(zhì))的活性影響較小，是一種制備生物降解和生物相容性的多糖納米粒子的有效方法。

圖3 海洋糖納米藥物制備原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of the preparation of marine glyconanomedicine nanomedicine

1.2 聚電解質(zhì)復(fù)合法

該方法是指在溶液中兩種帶相反電荷的聚電解質(zhì)通過靜電相互作用凝聚形成納米結(jié)構(gòu)的聚集體(PEC)。例如將聚陰離子多糖(透明質(zhì)酸、海藻酸鈉、硫酸軟骨素、羧甲基纖維素等)溶液與聚陽離子多糖(如殼聚糖)溶液按一定比例混合，室溫下攪拌即可形成的納米復(fù)合物(見圖3c)。該方法對于水溶性小分子或生物大分子物質(zhì)的遞送均適合，而且制備過程簡單，也不需要添加其他的化學(xué)試劑，因此得到了廣泛的應(yīng)用，是一種理想的制備納米載體的方法。與離子交聯(lián)法不同，在PEC中由于靜電相互作用是發(fā)生在大分子之間，溶液的pH值、離子強度、溫度以及混合的持續(xù)時間和順序等對其穩(wěn)定性影響較大；其次，其穩(wěn)定性還會受到聚電解質(zhì)的分子量及分子的柔韌性等因素的影響。研究顯示，加入小分子離子交聯(lián)可以增強大分子之間的相互作用，得到更穩(wěn)定的納米復(fù)合物。

1.3 自組裝法

如前所述，海洋多糖分子鏈上存在多種可被修飾的基團如羧基、硫酸基、羥基等，易于進行化學(xué)改性。將疏水性基團例如烷基、芳香、脫氧膽酸基等接枝到親水性糖骨架上，可制成兩親性多糖分子。在水相環(huán)境中，兩親性多糖為了使界面自由能最小化，其上的疏水基可通過分子內(nèi)和/或分子間自組裝形成自聚集體(見圖3d)。例如，疏水化修飾的殼聚糖(如烷基化或脫氧膽酸化等)通過超聲或乳化的處理兩親性分子可以自組裝形成納米粒，能用作抗癌藥物(如紫杉醇、阿霉素等)的載體。通過自組裝法制備的納米粒在應(yīng)用上有以下特點，如：(1)可通過原料的選擇和制備工藝的優(yōu)化控制納米粒的粒徑和分散度；(2)與傳統(tǒng)的小分子表面活性劑相比，聚合物的臨界膠束濃度較低，使納米粒的結(jié)構(gòu)在各種生理條件下具有較好的穩(wěn)定性，保證藥物的高的運送效率和生物利用度。(3)納米粒具有一種獨特的核-殼結(jié)構(gòu)，其中核是由多糖分子鏈上的疏水基團聚集而成，而外殼是由多糖的親水骨架構(gòu)成。內(nèi)核主要通過疏水作用結(jié)合小分子藥物或生物大分子(如蛋白質(zhì)、DNA等)，而外殼的表面性質(zhì)決定了納米粒的生物利用度。

1.4 制備糖鏈-藥物綴合物

1975年，Ringsdorf首次提出了可以制備聚合物-藥物綴合物用于小分子疏水性藥物的遞送。同游離的藥物相比，與聚合物的結(jié)合改變了小分子藥物在體內(nèi)的生物分布和循環(huán)時間，并且借助滯留滲透(EPR)效應(yīng)，聚合物-藥物綴合物能選擇性地在腫瘤處聚集和積累。目前，這種給藥策略已被用于制備糖鏈-藥物綴合物，特別適用于水難溶性抗癌藥物的輸送。糖鏈-藥物綴合物主要由三部分組成：多糖分子、藥物和連接兩者的可生物降解間隔臂，同時還可共價偶聯(lián)上示蹤劑和靶向病灶的配基(見圖3e)。在進行綴合物設(shè)計時，間隔臂的選擇是成功的關(guān)鍵因素。理想的多糖-藥物綴合物具備以下特點：第一，間隔臂在血流中穩(wěn)定不被降解，以增加循環(huán)時間，但進入細胞后能迅速分解；第二，間隔臂能在不改變藥物分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的前提下將其完整的釋放；第三，糖鏈的結(jié)構(gòu)在血液中不發(fā)生改變。糖鏈-藥物綴合物的大小和形狀最終由其組分的特性決定。例如，糖鏈-疏水性藥物綴合物可自組裝成球形納米粒，糖鏈位于表面，而藥位于其核心。

1.5 逐層組裝法

逐層組裝法(LBL)是一種多用途的納米制造技術(shù)，聚電解質(zhì)LBL是制備納米復(fù)合材料最有效的方法之一。基于靜電相互作用，用帶相反電荷的聚電解質(zhì)的交替吸附來制備納米粒的技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一個新的策略。例如，以聚陽離子殼聚糖和聚陰離子硫酸葡聚糖為原料，采用LBL可制備多層納米顆粒(見圖3f)。這個方法制備納米粒的優(yōu)勢表現(xiàn)在：(1)在生理條件下，治療藥物和生物材料通過非共價的形式摻入到LBL膜中，其生物活性不受到影響；(2)可通過控制表面化學(xué)、LBL膜的厚度等因素將多種組分組合在一起，制備可自由調(diào)節(jié)藥物釋放持續(xù)時間的多功能納米給藥系統(tǒng)。

2 多糖納米給藥系統(tǒng)的應(yīng)用

2.1 褐藻膠多糖(Alginate)

褐藻膠多糖是從褐藻中提取由β—D—甘露糖醛酸(M)和α—L—古羅糖醛酸(G)通過α或β—(1→4)糖苷鍵連接而成的天然多糖。褐藻膠多糖由于其優(yōu)異的生物相容性、低成本、低生物毒性和環(huán)境響應(yīng)性等優(yōu)點而被廣泛研究并應(yīng)用于藥物遞送領(lǐng)域[8]。制備褐藻膠多糖納米粒的常用的方法是離子交聯(lián)法，其中交聯(lián)速率是控制褐藻膠多糖納米粒形成的關(guān)鍵因素。然而，該方法只適用于水溶性活性成分的包封。

為了拓展海藻酸納米粒的應(yīng)用范圍，李倩等[9]應(yīng)用活性酯法首先制備得到了油酰海藻酸(OAE)，進而分別用自組裝法和乳化法構(gòu)建了油酰海藻酸納米粒。以維生素D3和維生素E為模型藥物對其包埋效率和緩釋效果進行了測定。OAE納米粒在模擬胃液中保持完整球形結(jié)構(gòu)、粒徑變小、藥物釋放率低；在模擬腸液中形狀變得不規(guī)則、粒徑變大、藥物釋放率迅速提高，表明OAE納米粒具有腸道靶向緩釋作用。為了進一步闡明納米粒的轉(zhuǎn)運和吸收機制(見圖4)，李倩等[10-11]通過差速離心法制備了不同粒徑的負載VE的海藻酸鈉單分散顆粒(50 、120、420和730 nm)。體外Transwell的跨膜轉(zhuǎn)運模型實驗表明，負載VE的OAE納米粒的透過率顯著提高，但隨著粒徑的增加(70 nm 升到 700 nm)，VE表觀滲透系數(shù)降低((2.72 ± 0.66)×10-4cm/s降到(0.94 ± 0.43)×10-4cm/s)。Wistar大鼠腸外翻實驗結(jié)果表明：OAE納米粒主要通過主動運輸吸收；不同粒徑的OAE納米粒胞吞機制不同，其中網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)了NP 80 和NP 130的內(nèi)吞作用，小凹蛋白介導(dǎo)了NP 370的內(nèi)吞作用，而NP 700主要通過巨胞飲作用進入細胞。

在以上研究的基礎(chǔ)上，為了進一步提高藥物的跨膜通透率及口服生物利用度，張沛等[12-13]利用腸上皮細胞表面存在苯丙氨酸酯類受體這一原理，合成了苯丙氨酸乙酯-海藻酸鈉耦合物(PE-SA, SP)，研究了兩親性褐藻膠多糖在水溶液中的自組裝行為；制備了負載維生素B2(VB2)的褐藻膠多糖納米粒(VB2-SP)(見圖5)。結(jié)果顯示：納米粒的最大載藥量為(12.76 ± 1.22)% ；VB2從PEA-NPs的體外釋放行為顯示出雙相釋放曲線，在最初的10 h內(nèi)爆發(fā)性釋放約占VB2的40%～50%，隨后在pH 7.4的PBS中50 h穩(wěn)定持續(xù)釋放；同時，相對于pH 7.4，VB2-SP在pH 2.0條件下釋放率較低；SP納米粒可作為VB2的腸道靶向載體。激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果顯示苯丙氨酸乙酯對于Caco-2細胞對SP納米粒攝取具有一定的促進作用。SP能有效提高所負載營養(yǎng)物的生物利用度，可解決低生物利用度營養(yǎng)物質(zhì)吸收問題。

圖4 不同粒徑納米粒進入細胞的不同機制Fig.4 Different mechanisms of cellular uptake of nanoparticles with different particle sizes

2.2 巖藻多糖(Fucoidan)

隨著褐藻種類的不同，巖藻多糖的結(jié)構(gòu)和組成有差別，海帶來源的巖藻多糖由硫酸巖藻糖通過α(1→3)糖苷鍵連接而成，而墨角藻和泡葉藻來源的巖藻多糖通過α(1→3)和α(1→4)糖苷鍵連接而成。巖藻多糖具有多種生物學(xué)活性，如抗凝[14]、抗病毒[15]、抗血管生成、抗腫瘤、抗炎[16]、抗氧化劑[17]以及抗增殖和免疫調(diào)節(jié)特性[15]，是用于制備藥物遞送載體的優(yōu)質(zhì)材料。

Leung等[18]的研究使用了羧甲基化的瓜兒豆膠多糖及巖藻多糖作為還原劑和穩(wěn)定劑來生物合成銀納米粒。從褐藻中分離出巖藻多糖，使用脂質(zhì)體作為納米載體將其包裹在納米粒中。這些納米粒對骨肉瘤顯示出有效的體外抗癌活性，為了制備載有化療藥物的納米粒，研究人員又通過巖藻多糖的乙酰化合成了疏水改性的巖藻多糖。阿霉素被用作治療模型中的化療藥物，將該藥物裝載于乙?；瘞r藻多糖納米粒子中研究其載藥性能。

圖5 基于苯丙氨酸乙酯的共軛物的自聚集體的示意圖和透射電子顯微照片F(xiàn)ig.5 Schematic and transmission electron micrographs of self-aggregates of phenylalanine ethyl ester-based conjugates

2.3 卡拉膠多糖(Carrageenan)

卡拉膠來源于海洋紅藻，生產(chǎn)卡拉膠的原藻主要為卡帕藻和麒麟菜兩個屬，其中以麒麟菜屬海藻資源最為豐富?？ɡz多糖鏈由兩種單糖即α—(1→4)—D—吡喃型半乳糖—β—(1→3)—D—半乳吡喃糖(或3,6內(nèi)醚—D—半乳吡喃糖)組成二糖單元交替連接而成?？ɡz多糖根據(jù)不同硫酸根基團的取代度分為k, l, λ-卡拉膠多糖三種類型。在藥物制劑中常用作乳化劑、助懸劑、膠凝劑、緩控釋材料、包衣材料等。

Daniel-da-Silva等[19]利用卡拉膠多糖研究了磁性納米粒的生物合成，并對k, l, λ-卡拉膠多糖納米復(fù)合材料的顆粒形態(tài)和化學(xué)穩(wěn)定性進行了研究。De Souza等[20]報道了從海洋褐藻和紅藻中提取的6種硫酸多糖混合物的的抗氧化活性; λ-卡拉膠多糖表現(xiàn)出很強的抗氧化活性，對貓皰疹病毒(FHV)-1在體外具有良好的抑制作用。Grenha等[21]開發(fā)了一種新型的卡拉膠多糖制備的納米粒，作為一類優(yōu)秀的藥物傳遞系統(tǒng)。這類納米粒被證明是具備緩釋及可控性的藥物輸送載體，對成纖維細胞的生物毒性低，具有良好的生物相容性，是藥物遞送載體及組織工程應(yīng)用的優(yōu)良材料。

2.4 瓊膠多糖(Agarose)

瓊膠多糖，主要是從紅藻(如石花菜、江蘺和紫菜屬等)中提取出的多糖，瓊膠多糖是由β-1,3-連接的D-半乳糖和α-1,4-連接的3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖殘基的交替連接形成的共聚物。瓊膠多糖在藥物制劑領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，可作膠凝劑、增稠劑、助懸劑、乳化或乳化穩(wěn)定劑等，可用于凝膠劑、凍膠劑、乳劑、合劑的制備。瓊膠多糖還常用于生物化學(xué)，分子生物學(xué)等生物技術(shù)領(lǐng)域，通過瓊脂糖電泳分離DNA等生物分子。瓊膠多糖由于其凝膠化的特性還常用于制造半導(dǎo)體和金屬納米粒，這些納米粒對大腸桿菌表現(xiàn)出很強的抗菌活性。

有趣的是，瓊膠多糖復(fù)合膜在氮氣中碳化后可以迅速轉(zhuǎn)化為碳-金屬復(fù)合材料[22]。Kattumuri等[23]報道了使用瓊膠多糖固定金納米粒，利用表面增強拉曼光譜檢測DNA核苷的微摩爾濃度，通過結(jié)果表明，瓊膠多糖固定金納米粒子產(chǎn)生更高的表面增強拉曼光譜檢測DNA核苷，將其應(yīng)用于芯片上的生物傳感用途。

2.5 綠藻多糖

滸苔和石莼同屬于石莼屬，是引發(fā)海洋“綠藻潮”的主要藻種。近十年來，中國黃海南部及東海北部海域頻繁爆發(fā)“綠潮”，嚴重威脅了沿海地區(qū)的漁業(yè)和旅游業(yè)的發(fā)展，探索綠藻有效的利用途徑，對解決它帶來的環(huán)境問題及經(jīng)濟損失有重大意義。海洋綠藻多糖來源豐富、同時還具有良好的生物相容、生物可降解性。近30年的研究結(jié)果表明: 這類多糖具有廣泛的生物學(xué)功能如抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗高血壓、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)作用等。因此，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。以下就兩種主要的水溶性綠藻多糖：石莼多糖和滸苔多糖來討論相關(guān)研究及應(yīng)用情況。

2.5.1 石莼多糖(Ulvan) 石莼多糖是從海洋綠藻的細胞壁中分離出來的一種復(fù)雜的陰離子硫酸化多糖。石莼中提取的石莼聚糖為酸性多糖，主要單糖組成為鼠李糖、木糖、葡萄糖、艾杜糖醛酸、葡萄糖醛酸等，其糖殘基絕大多數(shù)以α-(1→4)-和β-(1→4)-連接構(gòu)成主鏈。鼠李糖的O-2 位置存在分支，鼠李糖的C-3位置被硫酸化[24]。其中，艾杜糖醛酸、木糖、葡萄糖通過β-(1→4)-連接, 鼠李糖通過α-(1→4)-連接[25]。石莼多糖在抗氧化劑，抗腫瘤劑，抗凝劑和免疫調(diào)節(jié)劑方面具有較大的應(yīng)用研究潛能[26]。目前，從海洋綠藻中分離出的石莼多糖已被用于制備納米纖維，納米纖維在藥物輸送，傷口敷料和組織工程中有較大應(yīng)用潛力。

Toskas等[27]報道了來自綠藻的富含石莼多糖的分離多糖的可紡織特性，該多糖可用于制造納米纖維。Kikionis等[28]使用電紡技術(shù)制備了新型的石莼多糖纖維生物復(fù)合材料，富含石莼多糖的提取物的可制備成納米纖維的能力及其有趣的物理化學(xué)和生物學(xué)特性可以應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，例如藥物輸送，傷口敷料和組織工程。

2.5.2 滸苔多糖 滸苔多糖的單糖組成比較復(fù)雜，隨季節(jié)、種類和地域的不同有一定差異，主要由鼠李糖、葡萄糖、木糖和葡萄糖醛酸等組成。木糖通過α-(1→2,4)連接; 鼠李糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖通過α-(1→4)連接; 半乳糖通過α-(1→3,6)連接；其中硫酸化基團位于木糖的O-2位置。然而，滸苔多糖在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究較少，我們李嘉欣等[29]在滸苔多糖的生物功能和納米材料的制備方面進行了以下研究：首先，探究了滸苔多糖、滸苔低聚糖及其硫酸衍生物的抗氧化和吸濕/保濕活性。滸苔多糖(PEP)和滸苔低聚糖(LEP)通過氯磺酸/吡啶法制備其硫酸衍生物(SPEP和SLEP)。獲得的SPEP和SLEP的硫酸取代度分別為0.57和0.81。理化性質(zhì)研究和紅外光譜結(jié)果表明滸苔多糖的酶降解和硫酸化修飾成功。13C NMR結(jié)果表明硫酸基團連接到鼠李糖C-6位置。此外，研究結(jié)果表明天然多糖經(jīng)酶降解和硫酸化修飾后顯著增強了超氧自由基、羥基自由基、DPPH自由基的體外清除活性，同時也提高了多糖的吸濕/保濕能力。這表明分子量和硫酸基團含量顯著影響滸苔多糖的抗氧化性和吸濕/保濕活性。同時，李嘉欣等[30]還就負載姜黃素的滸苔多糖聚電解質(zhì)納米粒的制備及體外抗癌開展了研究。滸苔多糖(EP)和殼聚糖(CS)通過靜電作用制備了聚電解質(zhì)復(fù)合納米粒(EP/CS NPs)(見圖6)。在pH 4.0、EP∶CS質(zhì)量比為3.0∶1.0的條件下成功制備單分散、帶負電荷的EP/CS NPs。負載姜黃素納米粒(CUR-NPs)顯示球形，粒徑為230～330 nm，帶-(16.27 ± 0.97) mV電荷。CUR-NPs改善了姜黃素的儲存穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性。在體外釋放實驗中能持續(xù)釋放姜黃素。此外，CUR-NPs顯示出比游離CUR更高的細胞攝入，MTT結(jié)果表明CUR-NPs對B16F10細胞具有良好的細胞毒性。因此，對于疏水性抗腫瘤藥物遞送，滸苔多糖納米粒是一種有前景的載體。

2.6 殼聚糖(Chitosan)

殼聚糖是甲殼動物外骨骼的主要成分甲殼素的脫乙酰化后的產(chǎn)物，由β-(1→4)連接N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和D-葡萄糖胺(GlcN)以β-(1→4)糖苷鍵相連接。殼聚糖糖鏈骨架上游離的氨基存在為制備基于殼聚糖的納米粒提供便利。因此，可以通過自組裝法、交聯(lián)法和聚電解質(zhì)復(fù)合法等方法制備殼聚糖納米粒[31-33]。殼聚糖納米藥物遞送載體可采用口服給藥，注射給藥，局部給藥等不同給藥方式，用于小分子藥物、蛋白質(zhì)藥物或核酸藥物的遞送[34]。

其中自組裝法是制備殼聚糖納米粒最受關(guān)注的方法。Lee等[32]最早使用脫氧膽酸修飾殼聚糖，制備了自組裝殼聚糖納米粒用于阿霉素的遞送。載藥量達16.5 wt%，在pH 7.2的磷酸緩沖液中阿霉素緩慢的釋放。后來，Kim首先合成了5β-膽酸修飾的乙二醇殼聚糖(HGC)，隨后制備自組裝納米粒作為紫杉醇(PTX)的載體，其最大載藥量可達10 wt%。PTX-HGC的抗癌效果與紫杉醇的Cremophor EL劑型接近，但毒性大大降低[33]。

劉晨光等[35-39]也較早開展了這方面的工作，制備了基于亞油酸修飾的羧甲基殼聚糖(LCC)[35-37]、丙烯腈(AN)和精氨酸(Arg)修飾的殼聚糖(CS)(AN-CS-Arg)[38]、N-乙酰組氨酸(NAcHis)和精氨酸(Arg)修飾的殼聚糖(NAcHis-CS-Arg)[39]等的納米粒分別用作小分子抗癌藥物(如阿霉素、姜黃素和柔比多星)的載體。同時，為進一步提高藥物的遞送效率，還開發(fā)了腫瘤靶向的葉酸修飾殼聚糖納米粒(FCC)。與正常細胞相比，葉酸受體(ER)在癌細胞中過表達，結(jié)果顯示：癌細胞(Hela)表面過表達的葉酸受體介導(dǎo)了細胞主動攝入 FCC-DOX過程，這樣大量的FCC-DOX進入細胞釋放藥物，從而提高藥物的作用效果[40]。

圖6 聚電解質(zhì)復(fù)合納米粒(EP/CS NPs)和負載姜黃素納米粒(CUR-NPs)的原理圖Fig. 6 Schematic diagram of polyelectrolyte composite nanoparticles (EP / CS NPs) and curcumin-loaded nanoparticles (CUR-NPs)

張沛等[41]制備的堿性氨基酸(精氨酸，Arg)性共軛亞油酸-羧化殼聚糖(CLA-CMCS)綴合物，可以自組裝形成超分子膠束，有效包封酪氨酸酶抑制劑——苯乙基間苯二酚(見圖7)，用于靶向傳遞抑制黑色素沉著。李倩等[42]將硬脂酸改性的殼聚糖采用自聚合法制備了殼聚糖納米粒，并通過共軸氣流法將殼聚糖納米粒子包埋在海藻酸鹽微球中(見圖8)，在溫和的條件下制備了一種納米微傳遞系統(tǒng)(NiMDS)，結(jié)果表明NiMDS可作為一種理想的、在胃腸道環(huán)境中緩釋共軛亞油酸(CLA)的口服載體。

圖7 精氨酸改性共軛亞油酸-羧化殼聚糖-NPs在蒸餾水中的自組裝與苯乙基間苯二酚在B16細胞中的高效傳遞Fig.7 Self-assembly of arginine modified conjugated linoleic acid-carboxylated chitosan-NPs in distilled water and efficient delivery of ethylresorcinol in B16 Cells

圖8 (a)硬脂酸改性殼聚糖的原理圖；(b)納米微傳遞系統(tǒng)(NiMDS)的形成Fig.8 (a) Schematic diagram of stearic acid modified chitosan; (b) Preparation of the nano-micro delivery system (NiMDS)

基于兩親性多糖自組裝納米粒還可通過氫鍵和疏水作用結(jié)合蛋白質(zhì)，并自發(fā)的形成蛋白質(zhì)-納米粒復(fù)合物。這種復(fù)合結(jié)構(gòu)可提高蛋白質(zhì)抵抗變性的能力和熱穩(wěn)定性，其作用類似于“分子伴侶”可預(yù)防蛋白質(zhì)不可逆的變性聚集沉淀。劉晨光等[43-44]曾用基于亞油酸接枝的殼聚糖自組裝納米粒負載胰蛋白酶，結(jié)果顯示納米粒可顯著提高胰蛋白酶的穩(wěn)定性。環(huán)境因素(如pH值、尿素或NaCl濃度)可影響TR在納米粒子上的負載，提示酶蛋白與納米粒的結(jié)合可能受到氫鍵、疏水作用和離子相互作用等因素的影響。隨后的研究發(fā)現(xiàn)自組裝殼聚糖納米粒還可以作為菠蘿蛋白酶的載體[45]。分別通過物理吸附和化學(xué)共價連接使酶負載于納米粒上。研究結(jié)果顯示：固定化菠蘿蛋白酶的熱穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性顯著提高。原因是酶和納米粒之間的離子相互作用、氫鍵以及疏水作用力等因素增強了酶分子的剛性。有趣的是與游離酶相比，固定化酶的Km值變小，提示納米粒通過靜電作用提高了酶與底物的親和力。

聚電解質(zhì)復(fù)合法是另一種制備殼聚糖納米粒的有效方法。最近，Arif等[46]通過綴合半胱氨酸的殼聚糖(Cys-CS)和聚蘋果酸(PMLA)，制備用于包封阿莫西林的Cys-CS / PMLA納米顆粒。結(jié)果表明，Cys-CS / PMLA納米顆粒具有良好的pH敏感性，并有粘膜黏附和穿透功能可延緩阿莫西林在胃酸中的釋放，使藥物能夠有效傳遞并靶向幽門螺桿菌。同時，叢瑩等[47]還制備了硬脂酸接枝的羧甲基殼聚糖共聚物(CMCS-g-SA)，并進一步接枝尿素，得到脲基-羧甲基殼聚糖-硬脂酸(U-CMCS-g-SA)共聚物，以U-CMCS-g-SA共聚物制備的納米膠束負載疏水性抗生素克拉霉素(見圖9)，羧甲基殼聚糖基賦予了納米膠束在胃中優(yōu)異的保存時間，而接枝的尿素基團賦予了膠束對幽門螺桿菌的有效靶向能力。

隨著糖化學(xué)的發(fā)展以及各種新型殼聚糖衍生物的研發(fā)，殼聚糖納米藥物遞送載體將在不久的將來被充分開發(fā)用于更多的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

2.7 透明質(zhì)酸(Hyaluronan)

透明質(zhì)酸由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺雙糖單元重復(fù)連接而成，在一些海洋動物組織(如魷魚眼、鯊魚皮和鯨魚軟骨)中存在含量豐富的透明質(zhì)酸。透明質(zhì)酸在溶液中分子間相互作用交織成網(wǎng)，對藥物分子起到生物粘附作用，使其擴散速率大大減小，從而延長藥效。透明質(zhì)酸的這種緩釋藥物的功能使之非常適于用作藥物載體材料。腫瘤細胞過表達的細胞表面分化簇44(D44)透明質(zhì)酸高親和性的受體，因此，基于透明質(zhì)酸的納米粒被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物遞送研究。

我們(董學(xué)猛[48]等)曾制備了透明質(zhì)酸-脫氧膽酸耦合物(HD)，并制備了基于HD的透明質(zhì)酸納米粒；以阿霉素為模型藥物制備了載藥的透明質(zhì)酸納米粒，研究結(jié)果顯示：可以通過選擇脫氧膽酸的取代度來控制納米粒的粒徑、載藥量、藥物釋放速率和細胞的攝入量。隨后又(武敬亮[49]等)合成了組氨酸修飾的透明質(zhì)酸耦合物，以阿霉素(DOX)為模型藥物，應(yīng)用超聲分散法制備包載阿霉素的納米粒。體外細胞實驗結(jié)果顯示：載藥納米?？赏ㄟ^受體介導(dǎo)的胞吞被細胞攝入，組氨酸基團使納米粒具有顯著的pH值響應(yīng)性，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。以H22荷瘤小鼠為動物模型，考察DOX、DOX/His-HA納米粒的抑瘤效果，證明DOX/His-HA納米?？捎行б种颇[瘤，并降低了藥物的毒副作用。

圖9 脲基-羧甲基殼聚糖-硬脂酸共聚物制備的納米膠束用于靶向抑制幽門螺旋桿菌Fig.9 Nanomicelles prepared by urea-carboxymethyl chitosan-stearic acid copolymer for targeted inhibition of Helicobacter pylori

3 總結(jié)與展望

同其它的基于化學(xué)合成材料(如聚乳酸、聚己內(nèi)酯等)的納米粒、基于脂質(zhì)的納米粒(如脂質(zhì)體等)，基于海洋多糖的納米粒在小分子藥物、生物大分子藥物的遞送中顯示出獨特的優(yōu)勢，如由于其親水性和低免疫原性的特點避免了對血漿蛋白的非特異性識別和吸附，提高了藥物的生物利用度，增強了藥物的治療效果；其凝膠性質(zhì)(如對刺激的響應(yīng)性、柔軟性和膨脹性等)和易化學(xué)或酶學(xué)改性的特點為制備靶向和緩控釋納米藥物提供了可能。研究者采用不同的方法(如聚電解質(zhì)復(fù)合法(PEC)、自組裝法、共價交聯(lián)法和離子交聯(lián)法等)成功制備了不同的海洋多糖納米給藥系統(tǒng)，在生物和醫(yī)藥領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景。然而，目前這類研究大多仍處于實驗室階段，成功的商業(yè)應(yīng)用較少。主要原因是：一方面，在應(yīng)用基礎(chǔ)研究中以下問題還需進一步闡明：(1)納米藥物在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)運途徑及細胞攝入機制；(2)納米藥物與免疫系統(tǒng)各組分的相互作用及其機制。另一方面，在實際應(yīng)用中也面臨一些挑戰(zhàn)：(1)在進行體外實驗、體內(nèi)實驗研究和臨床應(yīng)用時，目前尚缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量標準和檢測方法；(2)產(chǎn)業(yè)化成本較高，或難以進行規(guī)模化生產(chǎn)。但是，隨著研究的不斷深入，這些問題的會得到逐步的解決，有理由相信基于海洋多糖的納米給藥系統(tǒng)將會在多種生物醫(yī)學(xué)(如藥物遞送、組織工程和傷口敷料等)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。