直接PCR法在獼猴桃潰瘍病檢測(cè)中的建立

李智念 羊煉 劉露

摘 要：通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，本文建立了使用獼猴桃枝條為樣品，直接檢測(cè)獼猴桃潰瘍病PSA病原菌的方法。該方法跳過(guò)了病原菌培養(yǎng)和DNA提取步驟，大大縮短了檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)，利用微型PCR儀系統(tǒng)，使針對(duì)獼猴桃潰瘍病的簡(jiǎn)單、低成本、快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)成為可能。

關(guān)鍵詞：獼猴桃潰瘍病;檢測(cè)方法;直接PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.634文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1003-5168（2020）20-0139-03

Abstract： By optimizing the PCR reaction system and reaction program， a method for directly detecting the pathogenic bacteria of kiwi fruit ulcer PSA by using kiwi twigs as a sample was established in this paper. The method skips the steps of pathogen culture and DNA extraction， greatly shortens the detection time， and utilizes a micro-PCR system， which makes simple， low-cost and fast on-site detection for kiwi fruit ulcer possible.

Keywords： kiwi fruit ulcer;detection method;direct PCR

近年來(lái)，我國(guó)獼猴桃種植面積不斷增加，細(xì)菌性潰瘍病快速蔓延[1-2]。在沒(méi)有特效防治藥品的現(xiàn)狀下，加強(qiáng)外引苗木的檢疫、及早清除園中感染植株是防范潰瘍病，避免果園全軍覆沒(méi)的重要手段。植株感病的早期雖然不表現(xiàn)出相應(yīng)性狀，但已經(jīng)具備傳播擴(kuò)散致病菌的能力，要及早發(fā)現(xiàn)已染病植株并不容易。

PCR檢測(cè)能夠高效準(zhǔn)確地鑒定出PSA病原菌，但現(xiàn)有的方法一般要首先采樣培養(yǎng)病原菌，然后提取培養(yǎng)出的菌落DNA，再進(jìn)行PCR檢測(cè)。這樣的流程需要專(zhuān)業(yè)人員操作，很難應(yīng)用到獼猴桃園的常規(guī)檢測(cè)。面對(duì)基層獼猴桃園主的自主快速檢測(cè)方法，目前國(guó)內(nèi)還少有報(bào)道。本研究通過(guò)優(yōu)化普通PCR的反應(yīng)體系與程序，跳過(guò)病原物培養(yǎng)和DNA提取過(guò)程，直接以獼猴桃枝條為樣本進(jìn)行PCR反應(yīng);整合現(xiàn)有儀器設(shè)備，避開(kāi)了常規(guī)PCR試驗(yàn)對(duì)高速離心機(jī)、成像系統(tǒng)或熒光定量系統(tǒng)的依賴(lài)，建立了一套簡(jiǎn)單、可靠、準(zhǔn)確、快速、低成本的檢測(cè)方法，旨在為發(fā)展出一種基層獼猴桃園主用得起、用得上的獼猴挑潰瘍病早期檢測(cè)技術(shù)，為我國(guó)獼猴桃栽培的健康發(fā)展提供幫助。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

從明顯發(fā)生潰瘍病的獼猴桃枝條中分離保存的PSA病原菌。

1.2 獼猴桃枝條

分別以明顯發(fā)生潰瘍病的獼猴桃枝條（見(jiàn)圖1）、未見(jiàn)病征的獼猴桃枝條（見(jiàn)圖2）和已確認(rèn)未感染PSA病原菌的獼猴桃枝條（見(jiàn)圖3）為樣品。

1.3 PCR引物

通過(guò)文獻(xiàn)分析選取P3F/P5R（5′-GGTTTCGGACACCGCAGGTTCTACCGAG-3′，5′-CTTCCTGATCCCCGTTACCCATCGAC-3′）[3]用于PCR檢測(cè)，由上海生工進(jìn)行合成。

1.4 獼猴桃枝條組織取樣量的確定

直接PCR檢測(cè)反應(yīng)對(duì)樣品用量由一定要求，樣品量太少，會(huì)導(dǎo)致底物含量過(guò)低，無(wú)法完成檢測(cè);樣品量太多會(huì)污染PCR反應(yīng)體系，導(dǎo)致目標(biāo)片段的擴(kuò)增無(wú)法順利完成[4-9]。為確定取樣量的范圍，本試驗(yàn)以ddH2O為陰性對(duì)照，以稀釋后的獼猴桃PSA菌液為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)取不同質(zhì)量的健康枝條樣品與PSA菌液混合進(jìn)行PCR檢測(cè)來(lái)確定樣品取樣量的上限，通過(guò)從感病枝條中取不同重量樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)來(lái)確定樣品取樣量的下限。

PCR反應(yīng)體系為：2×Taq PCR Master Mix10ul，上下游引物各0.5 μL，DNA模板10 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 3 min; 95℃變性10 s，58 ℃退火30 s;72 ℃延伸20 s，38個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;20 ℃保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)，核算染料為低毒的GelRed染料。

1.5 檢測(cè)系統(tǒng)的輕簡(jiǎn)化驗(yàn)證

常規(guī)PCR結(jié)果判讀一般是，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)底部的紫外燈管，激發(fā)鑲嵌了核酸染料的DNA片段發(fā)出熒光，再通過(guò)頂部的相機(jī)鏡頭拍攝下條帶的照片，傳輸至計(jì)算機(jī)，呈現(xiàn)結(jié)果。為了適應(yīng)基層低成本輕簡(jiǎn)化的操作需求，人們可以嘗試使用紫外手電筒代替成像系統(tǒng)來(lái)激發(fā)條帶，直接目測(cè)判讀的方式來(lái)解讀PCR結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣量對(duì)PCR反應(yīng)的影響

分別取1、0.5、0.1、0.05、0.02、0.01、0.008、0.005、0.002、0.001 g確定未感染獼猴桃PSA菌的健康枝條，將其分別加入500 μL含有PSA菌的ddH2O中搗碎，取10 μL搗碎后的樣品混合液作為反應(yīng)底物，進(jìn)行PCR反應(yīng);以ddH2O為陰性對(duì)照，以稀釋后的獼猴桃PSA菌液為陽(yáng)性對(duì)照。如圖4所示，PCR結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，而陰性對(duì)照未出帶，與預(yù)期相符，即反應(yīng)體系正常工作;樣品質(zhì)量在0.001～0.020 g的反應(yīng)都擴(kuò)增出條帶，并且以0.008 g樣品所對(duì)應(yīng)的條帶亮度最高，而0.05～1.00 g樣品質(zhì)量對(duì)應(yīng)的反應(yīng)都未見(jiàn)條帶。這表明在本檢測(cè)體系條件下，最適的取樣量為0.008 g左右，樣品量高于0.02 g則很可能會(huì)打亂反應(yīng)體系，導(dǎo)致檢測(cè)PCR擴(kuò)增無(wú)法進(jìn)行。

分別取1、0.5、0.1、0.05、0.02、0.01、0.008、0.005、0.002、0.001 g確定明顯感染獼猴桃PSA菌的枝條，將其分別加入500 μL的ddH2O中搗碎，取10 μL搗碎后的樣品混合液作為反應(yīng)底物，進(jìn)行PCR反應(yīng);以ddH2O為陰性對(duì)照，以稀釋后的獼猴桃PSA菌液為陽(yáng)性對(duì)照。如圖5所示，PCR結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，而陰性對(duì)照未出帶，與預(yù)期相符，即反應(yīng)體系正常工作;樣品量在0.008～0.020 g的反應(yīng)都擴(kuò)增出條帶，并且以0.008 g樣品所對(duì)應(yīng)的條帶亮度最高，而0.05～1.00 g樣品質(zhì)量和0.000 1～0.0050 g樣品質(zhì)量對(duì)應(yīng)的反應(yīng)都未見(jiàn)條帶。這表明在本檢測(cè)體系條件下，取樣量低于0.005 g會(huì)導(dǎo)致模板量過(guò)低，無(wú)法檢測(cè)出已感病材料。

通過(guò)對(duì)不同取樣量的檢測(cè)結(jié)果分析可知，在21 μL反應(yīng)體系下，取0.008～0.050 g的獼猴桃枝條組織，加入ddH2O（可用怡寶純凈水代替）中搗碎，取10 μL混合液作為PCR反應(yīng)的底物，能完成獼猴桃PSA病原菌的直接PCR檢測(cè)。

2.2 輕簡(jiǎn)化系統(tǒng)的可行性驗(yàn)證

為適應(yīng)基層果園無(wú)專(zhuān)業(yè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、無(wú)專(zhuān)業(yè)分子檢測(cè)人員的應(yīng)用場(chǎng)景，將實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行了設(shè)備和試劑進(jìn)行輕簡(jiǎn)化嘗試。

試劑準(zhǔn)備階段：將500 μL怡寶純凈水裝入1.5 mL EP管中;將引物與PCR反應(yīng)MIX制成預(yù)混液，并分裝入PCR反應(yīng)管中冷凍保存;將2%瓊脂糖凝膠制作完成后，用自封袋密封保存;將10 mL的50倍TAE母液裝入塑料試管保存。

模擬使用階段：分別取檢測(cè)范圍內(nèi)的健康枝條樣品、染病枝條樣品，加入預(yù)裝500 μL純凈水的EP管中，小研磨輥磨碎，取10 μL加入預(yù)裝有反應(yīng)液的PCR管中，上微型PCR儀器，以預(yù)定程序反應(yīng)。將預(yù)裝的TAE母液倒入新開(kāi)的怡寶純凈水中，搖勻制成電泳緩沖液體。將完成反應(yīng)的PCR產(chǎn)物上樣到預(yù)制的瓊脂糖凝膠中，在微型電泳儀上進(jìn)行電泳反應(yīng)。電泳完成后用紫外手電筒照射，進(jìn)行目視判定，染病枝條樣品出現(xiàn)明顯的亮條帶，而健康枝條樣品并未出現(xiàn)條帶，如圖6所示。

3 結(jié)論

隨著對(duì)獼猴桃潰瘍病菌（丁香假單胞菌獼猴桃變種Pseudomonas syrimgae PV.actinidiae，PSA）[10-13]研究的深入，基于普通PCR的檢測(cè)方法已經(jīng)被逐漸建立和完善，如已報(bào)道的KN-RCR[14]、RG-PCR[15]等技術(shù);也有基于定量PCR技術(shù)的檢測(cè)方法被報(bào)道。這些技術(shù)的建立，幫助專(zhuān)業(yè)人員準(zhǔn)確地區(qū)分出PSA和其他相似菌株，可以對(duì)無(wú)病征、未發(fā)病的果園進(jìn)行早期檢測(cè)。但是，這些檢測(cè)需要在專(zhuān)業(yè)的分子實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，需要具有相應(yīng)分子生物學(xué)專(zhuān)業(yè)技能的人員操作，耗時(shí)較長(zhǎng)，檢測(cè)成本較高?；鶎庸麍@主難以應(yīng)用PCR技術(shù)開(kāi)展自主檢測(cè)，在日常果園管護(hù)中早發(fā)現(xiàn)、早處理還不現(xiàn)實(shí)。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，建立了一套應(yīng)用普通PCR檢試劑、傻瓜化檢測(cè)的方法，無(wú)須專(zhuān)業(yè)背景即可在說(shuō)明指導(dǎo)下完成操作，結(jié)果準(zhǔn)確。該方法所需儀器極為輕簡(jiǎn)，相對(duì)于建立整套分子實(shí)驗(yàn)室，成本低廉。本研究建立的獼猴桃潰瘍病快速檢測(cè)方法，降低了檢測(cè)操作難度、檢測(cè)成本，縮短了檢測(cè)時(shí)間，應(yīng)用前景廣闊。

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