響應(yīng)面法優(yōu)化中藥烏賊墨酶解工藝及體外抗腫瘤活性研究

陶然 劉富菁 王婭玲

摘 ? ? ?要：以水溶性總蛋白及總多糖雙指標(biāo)優(yōu)化中藥烏賊墨酶解法提取工藝并進(jìn)行了體外抗腫瘤活性研究。以中藥烏賊墨總蛋白、總多糖為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察酶解時(shí)間、加酶量和酶解pH值對(duì)雙指標(biāo)的影響，在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化中藥烏賊墨酶解提取工藝，最后在最佳酶解提取工藝的條件下，采用MTT法對(duì)酶解物凍干粉進(jìn)行體外抗肝癌Bel-7402細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果最佳工藝條件為：酶解時(shí)間4.50 h，加酶量為2 500 u，pH為10.6;在此條件下，烏賊墨水溶性總蛋白的得率最高為38.34%，水溶性總多糖的得率最高為12.26%。最佳條件下制得的烏賊墨酶解液對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞株有一定的抑制作用，抑制率達(dá)到70%～80%。通過響應(yīng)面法優(yōu)化烏賊墨酶解工藝條件，使水溶性總蛋白及總多糖得率增加，為烏賊墨活性成分及抗腫瘤研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān) ?鍵 ?詞：烏賊墨;酶解;響應(yīng)面法;水溶性總蛋白;水溶性總多糖;肝癌Bel-7402細(xì)胞株

中圖分類號(hào)：R282.77 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ? ? ? 文章編號(hào)： 1671-0460（2020）05-0855-05

Abstract： The extraction process of squid ink was optimized， and the antitumor activity in vitro was studied. Taking the total protein and total polysaccharide of squid ink as indexes， the effect of hydrolysis time， amount of enzyme and PH value of hydrolysis on the two indexes was investigated by single factor experiment. On this basis， the extraction process of squid ink was optimized by response surface design. Finally， under the optimum conditions of enzyme hydrolysis and extraction， MTT method was used to study the effect of lyophilized powder of enzyme hydrolysate on liver cancer Bel-7402 cell line in vitro. The optimum conditions were determined as follows： the hydrolysis time 4.50 h， the amount of enzyme 2 500 u， and the pH 10.6. Under these conditions， the highest yield of water-soluble total protein was 38.34%， and the highest yield of water-soluble total polysaccharide was 12.26%. Under the optimum conditions， the squid ink hydrolysate could inhibit the liver cancer Bel-7402 cell line to a certain extent， and the inhibition rate was 70%～80%. After the enzymatic hydrolysis conditions of squid ink were optimized by response surface method， the yield of water-soluble total protein and total polysaccharide was increased， which laid a foundation for the study of active components and antitumor activities of squid ink.

Key words：Squid ink; Enzymolysis; Response surface method; Water soluble total protein; Water soluble total polysaccharide; Liver cancer cell line Bel-7402

烏賊墨存在于烏賊的墨囊中，由黑色素和蛋白多糖復(fù)合體組成，其蛋白質(zhì)和糖類的含量分別為6.3%、3.0%。現(xiàn)代研究表明，烏賊墨中的多糖、蛋白質(zhì)、多肽等活性物質(zhì)均具有良好的抗腫瘤、抗氧化等作用。酶解技術(shù)在中藥有效成分提取中具有明顯優(yōu)勢(shì)，其可在溫和的條件下提高中藥有效成分的浸出率，保證藥物有效成分的藥效[1]。同時(shí)酶可使蛋白質(zhì)、糖蛋白等成分水解成小分子活性肽或多糖類物質(zhì)，從而有效地發(fā)揮其藥理作用。酶的催化能力受pH值、酶解溫度等因素的影響較大，因此對(duì)于特定藥物，研究酶反應(yīng)的最佳條件尤為重要[2]。在前期實(shí)驗(yàn)研究中，我們仿照人體胃腸道的環(huán)境和運(yùn)行原理，已經(jīng)明確了烏賊墨最佳的酶解溫度為37 ℃、最佳的用酶為胰蛋白酶[3]。本次實(shí)驗(yàn)首先采用單因素方法，分別考察酶解時(shí)間、加酶量和酶解pH值對(duì)烏賊墨中總蛋白、總多糖提取率的影響，在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化中藥烏賊墨酶解提取工藝，最后在最佳酶解提取工藝的條件下，采用MTT法對(duì)酶解物凍干粉進(jìn)行體外抗肝癌Bel-7402細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)研究。

1 ?試劑與儀器

胰酶細(xì)胞消化液、RPMI Medium 1640培養(yǎng)基、牛血清蛋白、胰蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司）;葡萄糖、福林酚、濃硫酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;FA1204B型分析天平（上海天美天平儀器有限公司）;KQ-500GVDV雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;DNM-9602酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）;烏賊墨（SepiellamaindronideRochebrune）凍干粉經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)高德民副教授鑒定為正品。

2 ?方法及結(jié)果

2.1 ?烏賊墨酶解液的制備工藝流程

烏賊墨→凍干制粉→精密稱取1.000 g→加40倍蒸餾水溶解→超聲提?。?0 Hz）30 min→調(diào)節(jié)pH→加胰蛋白酶→37 ℃酶解→3 000 r·min-1、4 ℃離心10 min→抽濾、定容至100 mL→稀釋至適宜濃度→水溶性總蛋白質(zhì)、水溶性總多糖含量測(cè)定。

2.2 ?水溶性總蛋白及水溶性總多糖含量測(cè)定

采用改良lowry法[4]，Y = 2.267 5X+ 0.003 9， R2 = 0.998 4，測(cè)定蛋白質(zhì)含量。采用苯酚-硫酸法[5]，Y= 13.484X+ 0.007 2，R2 = 0.998 8，測(cè)定多糖含量。（Y吸光度值;X：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度）。

2.3 ?單因素試驗(yàn)考察烏賊墨酶解工藝

多糖與蛋白質(zhì)均為烏賊墨酶解液中的主要有效成分。以水溶性總蛋白質(zhì)、水溶性總多糖為雙指標(biāo)，分別探討酶解過程中酶解時(shí)間、加酶量、pH對(duì)各指標(biāo)的影響。設(shè)定各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)均為1，提取工藝優(yōu)化過程中，先算出水溶性總多糖及總蛋白得率，再按公式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得綜合評(píng)價(jià)值[6]。

2.3.1 ?酶解時(shí)間對(duì)水溶性總多糖及總蛋白得率影響

酶解時(shí)間分別選取2、3、4、5、6、7、8 h，固定pH調(diào)至8.0，酶活力為2 000 u。由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，可提高蛋白質(zhì)和多糖溶出，在2～8 h內(nèi)，酶解液中總多糖及總蛋白質(zhì)得率均先升高后降低。在2～4 h內(nèi)，蛋白質(zhì)得率不斷提升，因?yàn)殡S時(shí)間延長(zhǎng)，酶與藥液充分酶解，4～8 h內(nèi)呈現(xiàn)先緩慢升高后平緩下降的趨勢(shì)，并且在6 h達(dá)到最大值。多糖得率的變化不如蛋白質(zhì)明顯，總體呈現(xiàn)緩慢上升后得率逐漸穩(wěn)定的趨勢(shì)，并于4 h達(dá)到最大值。根據(jù)水溶性總蛋白質(zhì)及多糖的得率，結(jié)合綜合評(píng)價(jià)值，選擇3、4、5 h進(jìn)行工藝優(yōu)化。

2.3.2 ? pH對(duì)水溶性總多糖及總蛋白得率的影響

pH分別調(diào)至6、7、8、9、10、11、12，固定酶解時(shí)間為4 h，酶活力為2 000 u。由圖2可知，pH的變化對(duì)蛋白質(zhì)、多糖得率影響均較大。隨著pH的不斷提升，總蛋白得率先升高趨于平衡后下降，并于pH值為10時(shí)得率最高。在pH為6～10之間總蛋白質(zhì)得率增長(zhǎng)迅速，pH為10～12范圍內(nèi)呈現(xiàn)先趨于平衡后下降趨勢(shì)，可見堿性條件有利于蛋白質(zhì)的溶出。在pH為6～12之間總多糖的得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在pH值為10時(shí)總多糖的得率達(dá)到最大。根據(jù)水溶性總蛋白質(zhì)及多糖的得率，結(jié)合綜合評(píng)價(jià)值，選擇pH為9、10、11進(jìn)行工藝優(yōu)化。

2.3.3 ?酶活力對(duì)水溶性總多糖及總蛋白得率的影響

分別加胰蛋白酶1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 u，固定酶解時(shí)間為4 h，pH為8.0。由圖3可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，總多糖得率隨酶活力增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在酶活力為2 500 u時(shí)多糖得率達(dá)到最大。蛋白質(zhì)得率在酶活力為1 000～1 500 u呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在2 000～3 000 u范圍內(nèi)呈現(xiàn)先下降后趨于平衡。根據(jù)水溶性總蛋白質(zhì)及多糖的得率，結(jié)合綜合評(píng)價(jià)值，選擇酶活力1 500、2 000、2 500 u進(jìn)行工藝優(yōu)化。

2.4 ?響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化烏賊墨酶解工藝[7]

2.4.1 ?響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取烏賊墨水溶性總多糖及水溶性總蛋白的工藝參數(shù)。以水溶性總蛋白得率（Y1）及水溶性總多糖得率（Y2）為指標(biāo)，考察酶解時(shí)間（A）、pH（B）、酶活力（C）對(duì)制備工藝的影響。采用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（以P<0.05作為判斷顯著性的標(biāo)準(zhǔn)），見表1-2。

根據(jù)表3、4方差分析所示，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有顯著性（P<0.05），失擬項(xiàng)的P值為0.555 5、0.210 7，均表現(xiàn)為不顯著，表明該回歸模型理想。用方程Y1和Y2擬合3個(gè)因素（酶解時(shí)間、pH、酶活力）與水溶性總蛋白及總多糖得率之間的關(guān)系是可行的。對(duì)于水溶性總蛋白得率（Y1），其決定系數(shù)R2為0.998 0，校正決定系數(shù)R2adj為0.995 5，說明該模型能解釋99.55%響應(yīng)值。對(duì)于水溶性總多糖得率（Y2），其決定系數(shù)R2為0.984 5，校正決定系數(shù)R2adj為0.964 6，說明該模型能解釋96.46%響應(yīng)值。

表3的方差分析結(jié)果表明，A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2對(duì)水溶性總蛋白得率（Y1）影響顯著，即時(shí)間、pH、酶活力3因素均對(duì)水溶性總蛋白得率有顯著影響，交互作用時(shí)間與酶活力影響最顯著。表4的方差分析結(jié)果表明，A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2對(duì)水溶性總多糖得率（Y2）影響顯著，即時(shí)間、pH、酶活力三個(gè)因素均對(duì)水溶性總多糖得率（Y2）有顯著影響，交互作用時(shí)間與酶活力對(duì)水溶性總多糖得率有顯著影響。上述結(jié)果表明響應(yīng)值的變化相當(dāng)復(fù)雜，各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響呈二次關(guān)系，且各因素之間有相互影響。

2.4.2 ?各因素對(duì)響應(yīng)面值的影響

如圖4所示，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，水溶性總蛋白質(zhì)得率及水溶性總多糖得率均隨著酶解時(shí)間、pH、酶活力的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，說明這3個(gè)因素均有最佳值。

2.4.3 ?最佳酶解工藝驗(yàn)證

通過Design-Expert8.0.6軟件，得到最優(yōu)工藝為酶解時(shí)間4.5 h，pH值為10.6，酶活力為2 500 u，此時(shí)水溶性總蛋白質(zhì)理論得率為33.64%，水溶性總多糖理論得率為11.24%。

按照選取的最佳工藝條件重復(fù)3次試驗(yàn)，得到平均水溶性總蛋白得率為38.34%，水溶性總多糖得率為12.26%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與最佳工藝預(yù)測(cè)值接近，說明該工藝穩(wěn)定可靠。

2.5 ?MTT法測(cè)定烏賊墨酶解產(chǎn)物對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞株的抑制作用

采用MTT法進(jìn)行體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究[4]，通過測(cè)定細(xì)胞抑制率可以反映藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。圖5為最佳工藝條件下的烏賊墨酶解液對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞株的抑制率，由圖可知，在藥物濃度0.2～0.8 mg·mL-1范圍內(nèi)，細(xì)胞抑制率均為超過50%，在藥物濃度0.8～0.1 mg·mL-1之間，細(xì)胞抑制率持續(xù)上升，在藥物濃度1.0 mg·mL-1時(shí)，細(xì)胞抑制率達(dá)到73.85%。在藥物濃度1.0～2.0 mg·mL-1范圍內(nèi)，細(xì)胞抑制率在67%～77%之間波動(dòng)。

3 ?結(jié)論

烏賊墨作為傳統(tǒng)中藥，主要用于止血。隨著近代研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌等活性，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值，但烏賊墨作為烏賊的副產(chǎn)品，目前并未得到充分利用。烏賊墨的主要成分是黑色素、黑素蛋白、蛋白多糖復(fù)合體，黑色素中還含有次生降解低聚糖，但黑色素的水溶性較差，可溶于堿性溶液，在酸性環(huán)境會(huì)產(chǎn)生沉淀[8]。而胰蛋白酶為酸蛋白酶，最適pH值為7.8～8.5左右，堿性過強(qiáng)強(qiáng)會(huì)使酶的活性降低。因此、考察pH對(duì)酶解工藝的影響尤為重要。通過酶解可使黑素蛋白、糖蛋白等物質(zhì)水解為小分子活性肽和糖類物質(zhì)，從而提高活性成分的溶出，增加其藥理活性。

文中采用半仿生-酶解法，在37 ℃用胰蛋白酶酶解烏賊墨，以水溶性總蛋白質(zhì)及水溶性總多糖的得率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，得最佳酶解工藝為：酶解時(shí)間4.5 h、 pH為10.6、酶活力2 500 u。體外藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，經(jīng)胰蛋白酶酶解后的烏賊墨酶解液可以在體外抑制肝癌Bel-7402細(xì)胞株的生長(zhǎng)。

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