響應(yīng)面法優(yōu)化中藥復(fù)方中總黃酮提取工藝及藥理作用研究

王婭玲 陶然 宋興爽

摘 ? ? ?要：目的：探索中藥復(fù)方中黃酮最佳工藝，研究各因素對(duì)其抗氧化能力的影響差異。以中藥復(fù)方為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定黃酮的抗氧化能力。經(jīng)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)證實(shí)提取復(fù)方中黃酮的最佳工藝為回流溫度84 ℃、回流時(shí)間2 h、料液比1∶30 mg·mL-1，此時(shí)黃酮的占比為4.51%。體外藥理實(shí)驗(yàn)表明：DPPH清除率為85.66%，纖體復(fù)方中總還原力為0.89 Abs，為抗壞血酸的0.67倍，該復(fù)方具有顯著的抗氧化活性。

關(guān) ?鍵 ?詞：總黃酮含量;響應(yīng)面優(yōu)化;中藥降血脂

中圖分類號(hào)：TQ 041 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ? ? ? 文章編號(hào)： 1671-0460（2020）05-0830-04

Abstract： Objective： to explore the optimum technology of flavonoids in TCM and to study the difference of antioxidant activity among different factors. Response Surface Methodology （RSM） was used to optimize the antioxidant activity of flavonoids. Response surface experiments confirmed that the optimal extraction process of flavonoids in the compound was reflux temperature 84 ℃， reflux time 2 h， feed/liquid ratio 1∶30 mg·mL-1， and the proportion of flavonoids was 4.51%. In vitro pharmacological experiments showed that the scavenging rate of DPPH free radical was 85.66%， and the total reducing power of the compound was 0.89 Abs， 0.67 times that of ascorbic acid.

Key words： ?Total flavonoid content; Response surface optimization; Chinese medicine forlowering blood lipids

根據(jù)衛(wèi)生部官方統(tǒng)計(jì)，我國(guó)高血脂發(fā)生率高達(dá)25%，并且有日益廣泛化的趨勢(shì)。高血脂癥不僅受遺傳因素的影響，與后期的生活習(xí)慣、飲食健康、起居睡眠等息息相關(guān)。高血脂癥可紊亂脂質(zhì)代謝，引發(fā)多種慢性疾病，影響生命質(zhì)量[1]。體內(nèi)脂質(zhì)排泄異常，可引起血管硬化，間接誘發(fā)供血不足甚至心肌梗塞[2]。

近年來，國(guó)外常用降脂藥多以人工合成為主，副作用顯著，臨床驗(yàn)證其見效快但易傷脾胃，所以中藥降血脂愈來愈受到人們的喜愛[3，4]。高血脂癥可導(dǎo)致肝失疏泄、脾胃失調(diào)、氣虛血弱[5]，決明子、荷葉、薏仁等中藥經(jīng)研究都具有較好的降血脂功效。本實(shí)驗(yàn)旨在研究實(shí)驗(yàn)室研究自制降脂復(fù)方清除自由基能力和抗氧化活性，以期為制備降血脂新藥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

陳俊其[6]等優(yōu)選三種不同溶劑提取黃酮，結(jié)果表明黃酮在乙醇中溶解最充分，因此本次提取溶劑選用乙醇。黃酮在高溫下因結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而分解，降低溶出率[7]，本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助乙醇加熱回流的方法，可加快提取進(jìn)程，增大溶解度。

本次實(shí)驗(yàn)以中藥復(fù)方中黃酮得率為目的，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，研究回流時(shí)間、回流溫度、料液比對(duì)最終實(shí)驗(yàn)的影響[8]，測(cè)定抗氧化活性。

1 ?試劑與器材

DPPH、亞硝酸鈉、蘆丁對(duì)照品[9];離心機(jī)、雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、恒溫水浴鍋等[10]。

2 ?實(shí)驗(yàn)部分

2.1 ?含量測(cè)定

2.1.1 ?蘆丁標(biāo)曲

按照規(guī)定方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程 y=0.502 9x+0.007 5，R2=0.998 3，R2>0.998表明所得方程具有可行性和線性關(guān)系。

2.1.2 總黃酮含量測(cè)定

量取30 mL新配制的80%乙醇溶液倒入1.00 g中藥粉末，密封超聲20 min，加熱回流，分離上清液，定容稀釋，低溫密封保存。移液槍吸取1 mL，測(cè)定其吸光度[11]。

2.1.3 ?單因素實(shí)驗(yàn)

同上述黃酮測(cè)定方法，測(cè)定吸光度值，生成趨勢(shì)表，最高點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的水平即為該因素的最佳工藝。

2.1.4 ?響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

分析3個(gè)自變量的改變對(duì)響應(yīng)值作用的規(guī)律，在單因素實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析上，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化選取最佳提取組合[12]，見表1。

2.2 ?抗氧化能力測(cè)定

2.2.1 ?DPPH自由基清除率

配制DPPH儲(chǔ)配液，避光冷藏保存。參照下表加樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)合空白組，計(jì)算DPPH清除率[13]。

2.2.2 ?總還原力

根據(jù)最新版藥典標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定總還原力[14]，測(cè)定700 nm下稀釋溶液的吸光度，同時(shí)以不同梯度的Vc作陽性對(duì)照，評(píng)價(jià)中藥復(fù)方中黃酮的氧化還原能力。

3 ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 ?響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

以復(fù)方黃酮得率為目的，根據(jù)回歸模型，得到總黃酮得率Y與3個(gè)變量間的線性關(guān)系：Y=45.06-0.98A+1.62B+4.69C+0.74AB+1.57AC-2.25BC-6.38A2-5.03B2-1.73C2，見表3。

分析ANVOA結(jié)果，A（料液比）、B（回流溫度）作用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果比C（回流時(shí)間）明顯;F值=9.82，P值<0.05， 表明黃酮得率與各考察結(jié)果之間密切相關(guān)[15]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠;根據(jù)R2=0.876 3， Radj2=0.913 0，即實(shí)驗(yàn)結(jié)果幾乎不受誤差影響16]，該回歸模型的建立較為可靠。F值可表示各變量與實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的關(guān)系密切程度，依次為C>B>A[17]。

3.2 ?響應(yīng)面交互作用分析

響應(yīng)面分析圖可用于確定最佳工藝參數(shù)，曲面彎曲程度與該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的敏感程度相關(guān)[18]。由圖1可知，保持回流溫度80 ℃，黃酮浸出物量會(huì)隨著回流時(shí)間延長(zhǎng)而顯著變多，在所選范圍內(nèi)，存在最大值[19]。

根據(jù)圖2，響應(yīng)面相對(duì)較傾斜，等高線排列相對(duì)不緊密，因此回流溫度和料液比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要是由其共同作用引起，與回歸模型分析結(jié)果一致，最高點(diǎn)即為固定回流時(shí)間不變只考慮溫度和料液比影響時(shí)總黃酮得率的最大值[20];料液比曲面比回流溫度曲面更為傾斜，更占優(yōu)勢(shì)[21]。

根據(jù)圖3，響應(yīng)面起伏坡度較大，等高線彎曲程度較大，推斷回流時(shí)間和料液比對(duì)黃酮測(cè)定作用較大，交互作用較小，與方差分析吻合;固定回流溫度，隨著提取溶劑的增多，更有利于黃酮的溶解，達(dá)到飽和后黃酮類物質(zhì)不再浸出，時(shí)間延長(zhǎng)致使黃酮分解，蛋白和多糖類物質(zhì)從細(xì)胞中流出，導(dǎo)致提取的溶液中雜質(zhì)過多[22]。

3.3 ?抗氧化實(shí)驗(yàn)

3.3.1 ?自由基清除率

溶有DPPH的乙醇溶液極易揮發(fā)，需低溫冷藏，保存時(shí)間不宜過長(zhǎng)。該法測(cè)定需要考慮諸多因素，不適用于精細(xì)測(cè)定。

如圖4所示，當(dāng)藥液濃度較小時(shí)，提取液和抗壞血酸對(duì)體內(nèi)自由基的影響較小;藥液濃度較大時(shí)，自由基大部分被清除，增勢(shì)緩慢，當(dāng)藥液濃度為達(dá)到測(cè)定最大值時(shí)，黃酮提取液85.66%的自由基遭到破壞，抗壞血酸為90.33%，抗壞血酸對(duì)體內(nèi)自由基的破壞性強(qiáng)于復(fù)方總黃酮提取液[23]。

3.3.2 ?總還原力測(cè)定（見圖5）

當(dāng)質(zhì)量濃度為0.50 mg·mL-1時(shí)，該復(fù)方中黃酮總還原力為0.89 Abs，抗壞血酸為1.33 Abs，總還原力可反映抗氧化水平，因此該纖體復(fù)方的抗氧化性弱于抗壞血酸。

4 ?結(jié) 論

含有黃酮類成分較多的物質(zhì)為天然的還原

劑[24]，許多藥物的有效成分均為黃酮類物質(zhì)。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)中藥復(fù)方中的黃酮進(jìn)行優(yōu)化采用的方法為乙醇回流法，黃酮類物質(zhì)極性較大，醇類溶劑有利于黃酮的溶解。

最佳工藝為回流時(shí)間2 h、回流溫度84 ℃、料液比1∶30 mg·mL-1，此時(shí)中藥復(fù)方中總黃酮含量為4.51%[25]。當(dāng)藥液濃度為0.50 mg·mL-1，復(fù)方中總還原力約0.89 Abs，黃酮提取液85.66 %的自由基遭到破壞，還原力為抗壞血酸的0.67倍，具有顯著的抗氧化能力，為降脂復(fù)方在食物、保健品和抗氧化劑等方面開發(fā)利用擴(kuò)大市場(chǎng)。

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