超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定牛奶中23種獸藥

王卉，劉慶菊，韓平

1.北京農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究中心（北京 100097）；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室（北京）（北京 100097）；3.農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境監(jiān)測北京市重點實驗室（北京 100097）

飼養(yǎng)奶牛過程中需使用獸藥來保障奶牛的健康。然而，獸藥使用的不合理，如用藥量過大、不按療程用藥、隨意配藥、給藥途徑錯誤、未嚴格執(zhí)行休藥期規(guī)定、違規(guī)使用人用藥或原料藥等，都可能使牛奶中出現(xiàn)獸藥殘留[1-2]，獸藥殘留會影響人體健康，產(chǎn)生致毒、致癌、致畸等不良影響，并且會增加人體對微生物的耐藥性[3-4]。因此，有必要監(jiān)控牛奶中獸藥的殘留情況，以保障牛奶質量。

根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第235號和2292號公告對禁限用獸藥的規(guī)定[5-6]，在牛奶中，氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、二氟沙星、沙氟沙星、達氟沙星、羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、青霉素G、鄰氯青霉素、頭孢噻呋、西馬特羅、沙丁胺醇、甲硝唑、呋喃它酮、呋喃唑酮、群勃龍、甲基睪丸酮、丙酸睪酮、己烯雌酚、氯丙嗪等23種獸藥需要重點監(jiān)測，它們分別屬于喹諾酮類、β-內酰胺類、β-受體激動劑、硝基咪唑類、硝基呋喃類、性激素類、吩噻嗪類等。為保障牛奶的食用安全，需要嚴格測定牛奶中以上獸藥含量。

牛奶中獸藥的檢測方法主要有微生物檢測法、免疫分析法、適配體傳感器檢測法和液質聯(lián)用法等[7-10]，其中，微生物檢測法在檢測的靈敏度上有待進一步提高，免疫分析法和適配體傳感器檢測法等方法在檢測穩(wěn)定性方面有待進一步改善，而液質聯(lián)用檢測法具有耗時短、測量范圍廣、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢[11-16]，特別在多種獸藥的同時檢測中優(yōu)勢明顯。因此，試驗選擇乙腈（含2%甲酸）作為提取溶劑結合固相萃取小柱，對牛奶中的23種獸藥殘留進行提取，建立UPLCMS/MS檢測牛奶中23種獸藥殘留的方法。方法操作簡便、快速、準確，可以滿足牛奶中23種獸藥分析檢測的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶（市售）；標準品：氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、二氟沙星、沙氟沙星、達氟沙星、羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、青霉素G、鄰氯青霉素、頭孢噻呋、西馬特羅、甲硝唑、呋喃它酮、群勃龍、甲基睪丸酮、丙酸睪酮、氯丙嗪、沙丁胺醇、呋喃唑酮、己烯雌酚（純度均在98%以上，德國Dr. E公司）；甲酸、甲醇、乙腈、乙酸銨（均為質譜純，美國Fisher公司）；超純水；固相萃取小柱Oasis PRiME HLB（200 mg，6 cc，美國Waters公司）。

1.2 儀器與設備

ACQUITY超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四級桿Xevo TQS質譜儀（美國Waters公司）；ME104E電子天平（最大稱量120 g，精度0.000 1 g，瑞士梅特勒公司）；Vortex Genie 2渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）；N-EVAP氮吹儀（美國Organomation公司）；PHS-3C精密pH計（上海雷磁儀器廠）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）；3-30k離心機（德國Sigma公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛奶中獸藥的提取

稱取1 g牛奶，加入4 mL乙腈（含2%甲酸），充分混合，在7 000 r/min下離心5 min，取3 mL上清液進行SPE凈化。

1.3.2 凈化

先用3 mL乙腈（含2%甲酸）通過Oasis PRiME HLB固相萃取柱進行活化。取3 mL牛奶樣品上清液，使其通過小柱，取2 mL上樣后的流出液于10 mL離心管中，在溫和氮氣流下?lián)]干溶劑，用1 mL 5%甲醇水溶液復溶，過0.22 μm微孔濾膜，再將其轉移至樣品瓶中，待UPLC-MS/MS分析。

1.3.3 獸藥標準溶液的配制

分別準確稱取10 mg獸藥標準品，用甲醇定容至10 mL，配制成1 mg/mL標準儲備液，在-20 ℃保存，獸藥混合標準工作溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4 液相色譜條件

色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），進樣體積5 μL；柱溫45 ℃；流動相A為水（含0.1%甲酸），流動相B為甲醇（含0.1%甲酸），流速0.45 mL/min，采用梯度洗脫程序：0～0.15 min，2% B；0.15～1.95 min，2%～26% B；1.95～2.95 min，26%～35% B；2.95～7.50 min，35%～99% B；7.50～8.00 min，99% B；8.00～8.01 min，99%～2% B；8.01～10.00 min，2% B。

1.3.5 質譜條件

采用ESI源，電噴霧模式采用ESI+和ESI-這2種模式；毛細管電壓3.5 kV；離子源溫度150 ℃；錐孔氣流速150 L/h；脫溶劑氣溫度600 ℃；脫溶劑氣流速1 000 L/h；碰撞氣流速（氬氣）0.15 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Masslynx 4.1數(shù)據(jù)采集分析軟件。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

在牛奶的獸藥殘留提取試驗中，常用乙腈作為提取溶劑[17-18]。乙腈不僅可以提取獸藥化合物，還能沉淀牛奶中的蛋白質。分別用乙腈（含2%甲酸）和80%乙腈（含0.2%甲酸）溶液對牛奶樣品中的獸藥殘留進行提取，結果顯示，乙腈（含2%甲酸）的提取效果更好，平均回收率為95.67%，而80%乙腈（含0.2%甲酸）溶液的平均提取回收率為85.62%，因此試驗選擇乙腈（含2%甲酸）作為提取溶劑。由于測定的23種獸藥化學性質差異較大，不適宜采用吸附-淋洗-洗脫的方式凈化，所以選擇用固相萃取小柱吸附雜質，作為目標化合物通過的方式凈化。有研究發(fā)現(xiàn)Oasis PRiME HLB小柱對牛奶提取液中的蛋白、脂肪和磷脂等雜質的吸附效果較好[19-21]。因此，選用Oasis PRiME HLB對牛奶樣品進行凈化處理，并對上樣體積進行優(yōu)化。結果表明，上樣體積分別為3和4 mL時，平均回收率分別為95.67%和94.89%，無明顯的區(qū)別，由于體積大時，收集流出液所需時間長，因此選擇上樣體積3 mL進行凈化。

2.2 色譜條件優(yōu)化

選取ACQUITY UPLC BHE C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱和ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，通過比較2種色譜柱對23種獸藥化合物的保留情況，并綜合考慮化合物的保留時間、離子化效率和分段掃描等因素，發(fā)現(xiàn)ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱對目標化合物的分離效果更好，因此選擇該色譜柱進行試驗。流動相極性和pH對化合物的保留和分離影響較大，試驗比較甲醇-水、乙腈-水、甲醇（含0.1%甲酸）-水（含0.1%甲酸）、甲醇（含0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨）-水（含0.1%甲酸）等不同流動相條件，試驗發(fā)現(xiàn)以甲醇（含0.1%甲酸）和水（含0.1%甲酸）為流動相時，化合物的分離效果最好，靈敏度最高，酸度低時，喹諾酮類化合物會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。因此，試驗采用此流動相優(yōu)化梯度洗脫程序。

2.3 質譜條件的優(yōu)化

將23種獸藥分別配制成200 μg/L單標溶液，液相流速設為10 μL/min，使用Masslynx 4.1軟件的調諧功能，找到23種化合物的母離子和子離子，通過優(yōu)化碰撞能、去簇電壓、錐孔電壓等，確定各離子的最佳質譜參數(shù)，如表1所示。其中，己烯雌酚是在ESI-離子化模式下進行檢測的，其他化合物均在ESI+離子化模式下檢測，對23種獸藥標樣進行測定時，其出峰時間見表1，MRM色譜圖如圖1所示。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍、線性方程、檢測限和定量限

在最佳儀器條件下，配制不同濃度的混合標準工作溶液，以定量離子對的峰面積為縱坐標（y），以標準品的濃度為橫坐標（x）繪制標準工作曲線，計算得到化合物的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍，以化合物信噪比S/N=3時對應的濃度作為最低檢測限（LODs），以標準曲線上的最低點作為定量限（LOQs），結果列于表2。

2.4.2 準確度和精密度

取不含上述23種待測獸藥的牛奶作為基質，進行低、中、高3個濃度水平的添加回收試驗，重復測定6次，加標回收試驗結果見表3，加標回收率為70.98%～118.63%，相對標準偏差為0.14%～11.55%。

表1 目標化合物的質譜分析參數(shù)

圖1 23種獸藥化合物混合對照品的MRM色譜圖

表2 23種藥物線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

表3 23種獸藥化合物的回收率和精密度結果（n=6）

3 結論

建立超高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定牛奶中23種禁限用獸藥的方法，采用乙腈（含2%甲酸）作為提取溶劑，用Oasis PRiME HLB小柱進行凈化處理，方法靈敏度高，操作方便。方法的線性、檢測限和定量限均符合殘留檢測的要求。