HPLC同時(shí)測(cè)定涵睿膠囊8種有效成分及薄層鑒別

張海弢，付娟，楊曉筱，李曼曼，范業(yè)文

江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司（連云港 222001）

涵睿膠囊是由紅景天、姜黃、葡萄籽提取物等制成的一款具有增強(qiáng)免疫力功能的保健食品，適用于免疫力低下的人群。紅景天苷是紅景天的主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷在增強(qiáng)免疫力方面具有明顯的保健功能[1-3]。山柰酚、槲皮素作為黃酮類(lèi)化合物主要活性成分，研究表明其對(duì)機(jī)體免疫功能具有增強(qiáng)作用。姜黃素類(lèi)化合物是雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的統(tǒng)稱(chēng)，作為中藥材姜黃中的有效成分，大量研究結(jié)果顯示，其對(duì)適應(yīng)免疫、固有免疫均有增強(qiáng)作用[4-8]。

測(cè)定復(fù)方產(chǎn)品中多種有效活性成分比單一指標(biāo)成分測(cè)定，具有快速、準(zhǔn)確、可靠的特點(diǎn)，且更加科學(xué)、全面地表征產(chǎn)品質(zhì)量[9-13]。試驗(yàn)采用小粒徑色譜柱，基于多波長(zhǎng)快速同時(shí)測(cè)定涵睿膠囊中紅景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素8種有效成分，該檢測(cè)方法快速、準(zhǔn)確、可靠；采用薄層色譜法對(duì)姜黃提取物和葡萄籽提取物進(jìn)行定性鑒別，方法可行，專(zhuān)屬性強(qiáng)。試驗(yàn)旨在建立涵睿膠囊定性定量評(píng)價(jià)方法，以期快速、全面、有效地評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量，為從多指標(biāo)、多成分角度提升涵睿膠囊質(zhì)量控制水平提供研究參考，為全面控制其質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器和材料

Agilent 1260 HPLC色譜儀，DAD紫外檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫科技公司）；ZF-20D三用紫外分析儀（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；Mettler XP6、Mettler AE240型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；Centrifuge 5415D高速離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）；KQ-250DB型超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）。色譜級(jí)乙腈（美國(guó)天地公司）；硅膠G薄層層析板（青島海洋化工廠分廠、青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司、安徽良臣硅源材料有限公司、煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所）。

紅景天苷（批號(hào)110818-201708，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以98.8%計(jì)），姜黃素（批號(hào)110823-201405，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以98.9%計(jì)），山柰酚（批號(hào)110861-201310，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以93.2%計(jì)），酪醇（批號(hào)111676-200602），雙去甲氧基姜黃素（批號(hào)112004-201501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以95.0%計(jì)），槲皮素（批號(hào)100081-201509，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以98.6%計(jì)），去甲氧基姜黃素（批號(hào)112003-201501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以98.5%計(jì)），姜黃對(duì)照藥材（批號(hào)121188-201304）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；香豆素（批號(hào)MUST-18040901），原花青素（MUST-14081604）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；涵睿膠囊（批號(hào)20171101、20171102、20171103、20171201、20171202，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司）；超純水；甲醇等試劑，除特殊說(shuō)明，所用試劑均為分析純。

2 HPLC含量測(cè)定

2.1 色譜條件

以Kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）為色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-0.5%甲酸水溶液，梯度洗脫（0～10 min，10%～30%乙腈，10～15 min，30%～45%乙腈，15～30 min，45%～65%乙腈）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm（紅景天苷、香豆素、酪醇），370 nm（槲皮素、山柰酚）和430 nm（姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素）；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL，理論板數(shù)按紅景天苷峰計(jì)算，不低于6 000。見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖譜

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定適量紅景天苷、姜黃素、山柰酚、酪醇、去甲氧基姜黃素、香豆素、槲皮素、雙去甲氧基姜黃素對(duì)照品，加50%甲醇制成含紅景天苷104.95 mg/L、姜黃素137.8 mg/L、山柰酚103.37 mg/L、酪醇70.87 mg/L、去甲氧基姜黃素78.54 mg/L、香豆素76.09 mg/L、槲皮素90.05 mg/L、雙去甲氧基姜黃素147.54 mg/L混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取10粒涵睿膠囊，去殼，內(nèi)容物研細(xì)，混勻，取1.000 0 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，稱(chēng)定其質(zhì)量，超聲提取30 min，冷卻后再稱(chēng)定其質(zhì)量，補(bǔ)足失重，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

取2.2小節(jié)的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)行等比例稀釋?zhuān)⑷際PLC色譜儀，測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 8種成分的線性關(guān)系

2.5 定量限考察

將紅景天苷等8種有效成分對(duì)照品溶液逐步稀釋后進(jìn)樣，以信噪比（S/N）為10時(shí)考察其定量限，結(jié)果顯示紅景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的定量限分別為0.033，0.063，0.068，0.068，0.065，0.045，0.031和0.043 mg/kg。

2.6 精密度試驗(yàn)

取涵睿膠囊（批號(hào)20171101）去殼，內(nèi)容物研細(xì)，混勻，按照2.3小節(jié)的方法制備供試品溶液，2.1小節(jié)的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，以峰面積計(jì)算8種有效成分RSD值。結(jié)果顯示紅景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的RSD值分別為0.56%，0.41%，0.47%，0.21%，0.35%，0.19%，0.27%和0.56%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取涵睿膠囊（批號(hào)20171101）去殼，內(nèi)容物研細(xì)，混勻，取1.0 g，精密稱(chēng)定，按照2.3小節(jié)的方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按照2.1小節(jié)的色譜條件分別于0，2，6，10，14，18和24 h注入液相色譜儀，以峰面積為指標(biāo)計(jì)算8種有效成分的RSD值。結(jié)果顯示紅景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的RSD值分別為0.33%，0.24%，0.18%，0.26%，0.15%，0.40%，0.22%和0.39%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取涵睿膠囊（批號(hào)20171101）去殼，內(nèi)容物研細(xì)，混勻，取1.0 g，精密稱(chēng)定，按2.3小節(jié)的方法平行制備6份供試品溶液，計(jì)算8種有效成分的含量。結(jié)果顯示紅景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素含量分別為0.026，0.018，0.019，0.022，0.026，0.036，0.019和0.034 mg/kg；RSD值分別為0.41%，0.52%，0.26%，0.44%，0.35%，0.28%，0.49%和0.24%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取涵睿膠囊（批號(hào)20171101）去殼，內(nèi)容物研細(xì)，混勻，取0.5 g，取9份，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，3份1組，分別精密加入0.5，1.0和1.5 mL混合對(duì)照品溶液（紅景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素質(zhì)量濃度分別為1.282，0.853，0.987，1.135，1.198，1.758，0.961，1.673 mg/mL），精密加入25 mL 50%甲醇，超聲提取30 min，冷卻后搖勻，高速離心，取上清液，即得。測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示紅景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的平均回收率分別為99.0%，98.7%，98.5%，99.3%，99.7%，99.8%，99.7%和100.2%；RSD分別為0.67%，0.66%，0.86%，0.56%，0.74%，0.65%，0.75%和0.96%。2.10 樣品測(cè)定

3 TLC鑒別

3.1 姜黃提取物

取3批涵睿膠囊，各20粒，除去膠囊殼，內(nèi)容物研細(xì)，取0.2 g粉末，加20 mL無(wú)水乙醇，振搖，放置30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL無(wú)水乙醇使溶解，即得供試品溶液。取0.2 g姜黃對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取姜黃素對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每1 mL含0.5 mg溶液，即得對(duì)照品溶液。分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液，各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，條帶狀點(diǎn)樣，條帶寬度4 mm，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

表2 8種有效成分含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

圖2 涵睿膠囊中姜黃提取物TLC圖譜

3.2 葡萄籽提取物

取3批涵睿膠囊，各20粒，除去膠囊殼，取0.5 g粉末于三角瓶中，加30 mL甲醇，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液置通風(fēng)櫥中自然揮干，殘?jiān)? mL甲醇使溶解，即得供試品溶液。取5 mg原花青素對(duì)照品于2 mL量瓶中，加甲醇制成每毫升含2.5 mg原花青素溶液，即得對(duì)照品溶液。分別吸取6 μL供試品溶液、對(duì)照品溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%香草醛鹽酸溶液，置于日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 涵睿膠囊中葡萄籽提取物TLC圖譜

4 結(jié)論與討論

涵睿膠囊經(jīng)50%甲醇提取后，在190～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)通過(guò)DAD檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示紅景天苷、香豆素和酪醇在波長(zhǎng)275 nm有較強(qiáng)紫外吸收，山柰酚和槲皮素在波長(zhǎng)370 nm有較強(qiáng)紫外吸收，姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素在波長(zhǎng)430 nm有較強(qiáng)紫外吸收。通過(guò)考察不同的提取方法、提取時(shí)間和提取溶劑用量，確定涵睿膠囊有效成分測(cè)定試驗(yàn)供試品溶液制備方法?？疾?種不同流動(dòng)相（甲醇-水、甲醇-0.5%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.5%甲酸）對(duì)8種待測(cè)有效成分的影響，流動(dòng)相乙腈-0.5%甲酸系統(tǒng)所得圖譜中各色譜峰的分離情況和峰形較好，故選擇乙腈-0.5%甲酸作為流動(dòng)相；比較了使用Waters symmetry C18、Phenomenex Luna C18和Kromasil C18的3種不同品牌種色譜柱，結(jié)果顯示3種色譜柱無(wú)明顯差異。比較柱溫25，30和35 ℃，流速0.8，1.0和1.2 mL/min，結(jié)果無(wú)明顯差異。方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明紅景天苷13.15～420.89 mg/L、酪醇12.54～401.12 mg/L、香豆素13.61～435.36 mg/L、槲皮素13.62～435.88 mg/L、山柰酚12.94～414.20 mg/L、雙去甲氧基姜黃素17.93～573.64 mg/L、去甲氧基姜黃素12.32～394.32 mg/L、姜黃素17.02～544.52 mg/L，呈良好線性關(guān)系，8個(gè)成分的平均回收率分別為99.0%，98.7%，98.5%，99.3%，99.7%，99.8%，99.7%和100.2%；8種有效成分測(cè)定試驗(yàn)所采用的檢測(cè)方法耐用性良好。

涵睿膠囊中姜黃提取物薄層鑒別試驗(yàn)，參考《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》2015年版姜黃藥材鑒別項(xiàng)下TLC方法[14]制備供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液?？疾?種不同展開(kāi)劑三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）、二氯甲烷-丙酮-甲酸（96∶4∶0.7）和二氯甲烷-乙醇-甲酸（96∶4∶0.7），結(jié)果顯示展開(kāi)劑為三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）時(shí)，供試品在和對(duì)照品和對(duì)照藥材溶液相同位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，顏色鮮艷，分離度較好，且陰性無(wú)干擾，故選擇三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）為展開(kāi)劑；考察1，2，3和4 μL點(diǎn)樣量，結(jié)果顯示點(diǎn)樣量1 μL時(shí)，斑點(diǎn)已清晰，且分離度較好，無(wú)明顯差別，故確定點(diǎn)樣量為1 μL。對(duì)研究方法的薄層板、溫度、濕度進(jìn)行考察，以確保方法的可靠性。結(jié)果顯示不同濕度（40%±5%，60%±5%和80%±5%），溫度在4 ℃和室溫，不同廠家薄層板（青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司、安徽良臣硅源材料有限公司、青島海洋化工廠分廠）條件下，均能得到良好的檢視，說(shuō)明方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，適合涵睿膠囊成品薄層色譜鑒別。

涵睿膠囊中葡萄籽提取物薄層鑒別試驗(yàn)，采用自主建立的方法，并作了方法學(xué)驗(yàn)證?？疾?種不同展開(kāi)劑甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1）、二氯甲烷-甲醇-甲酸（3∶2∶1）、乙酸乙酯-甲醇（2∶1），結(jié)果顯示展開(kāi)劑為二氯甲烷-甲醇-甲酸（3∶2∶1）和乙酸乙酯-甲醇（2∶1）時(shí)，展開(kāi)效果較差，無(wú)明顯斑點(diǎn)，呈現(xiàn)一條色帶，分離度不合格；展開(kāi)劑為甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1）時(shí)，供試品在和對(duì)照品溶液相同位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，顏色鮮艷，分離度較好，且陰性無(wú)干擾，故選擇甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1）為展開(kāi)劑；考察2，4，6，8和10 μL點(diǎn)樣量，結(jié)果顯示點(diǎn)樣量為6 μL時(shí)，斑點(diǎn)清晰，故確定點(diǎn)樣量為6 μL。對(duì)研究方法的薄層板、溫度、濕度進(jìn)行考察，以確保方法的可靠性，結(jié)果顯示不同濕度（40%±5%，60%±5%和80%±5%），溫度在4 ℃和室溫，不同廠家薄層板（青島海洋化工廠分廠、青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司、煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所、青島裕民源硅膠試劑廠）條件下，均能得到良好的檢視，說(shuō)明方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，適合涵睿膠囊成品薄層色譜鑒別。

綜上所述，試驗(yàn)建立的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)性好、專(zhuān)屬性強(qiáng)，為從多指標(biāo)、多成分角度提升涵睿膠囊質(zhì)量控制水平提供參考。