高效液相色譜法測(cè)定食品中2-丙酰吡咯

曹雄杰，汪輝，周鵬，崔曉嬌，胡曉博，王朝霞

國(guó)家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（湖南）長(zhǎng)沙酒類分中心，長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所（長(zhǎng)沙 410016）

2-丙酰吡咯（CAS號(hào)：1073-26-3）是一種白色固體，微溶于水，易溶于甲醇等有機(jī)溶劑，可以在很低的濃度下增加總體牛肉的香味，包括增加紅肉，血和動(dòng)物的氣息[1]，已經(jīng)被美國(guó)香料和天然提取物制造者協(xié)會(huì)（FEMA）批準(zhǔn)為“一般認(rèn)為安全”，作為香料用于食品。世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織聯(lián)合食品添加劑專家組（JECFA）對(duì)2-丙酰吡咯做出評(píng)價(jià)：按現(xiàn)有的攝入水平，該物質(zhì)作為香料使用沒(méi)有安全問(wèn)題[1]，一般可按生產(chǎn)需要適量使用。2017年10月20日，國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委發(fā)布 《關(guān)于愛(ài)德萬(wàn)甜等6種食品添加劑新品種、食品添加劑環(huán)己基氨基磺酸鈉（又名甜蜜素）等6種食品添加劑擴(kuò)大用量和使用范圍的公告》，允許2-丙酰吡咯配制成食品用香精用于各類食品（GB 2760—2014表B.1食品類別除外），用量為按生產(chǎn)需要適量使用[2]。由于食品生產(chǎn)者對(duì)新允許的添加劑2-丙酰吡咯了解不夠，以及對(duì)標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014理解不透徹，可能會(huì)超范圍使用。因此，建立食品中2-丙酰吡咯的檢測(cè)方法不僅可為食品監(jiān)管提供技術(shù)保障，同時(shí)也能促進(jìn)食品安全健康發(fā)展。

2-丙酰吡咯作為一種新允許使用的食品添加劑，目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有關(guān)于食品中2-丙酰吡咯含量的檢測(cè)方法。食品中香精含量的常用檢測(cè)方法有高效液相色譜法[3-4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、氣相色譜法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜法[7-10]等。高效液相色譜儀為實(shí)驗(yàn)室常用儀器，以其高效、高靈敏度、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)而被廣泛運(yùn)用于食品添加劑含量檢測(cè)。根據(jù)2-丙酰吡咯的物理特性和化學(xué)性質(zhì)，通過(guò)優(yōu)化色譜條件和提取溶劑，建立了食品中2-丙酰吡咯的高效液相色譜測(cè)定方法。該方法前處理簡(jiǎn)單、快速，定量準(zhǔn)確，干擾少，適用于大米粉、發(fā)酵乳、食用菌和礦泉水中2-丙酰吡咯的測(cè)定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型液相色譜系統(tǒng)，包括G1329B型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1311C型四元泵、G1316A型柱溫箱，G1315D型二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；KQ 5200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；X1R高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）。

2-丙酰吡咯（≥99.0%，HPLC級(jí)，Alfa Aesar公司）；甲醇（≥99.9%，色譜純，德國(guó)Merck KGaA公司）；乙酸銨（≥98. 0%，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；試驗(yàn)用水為 Millipore Intergral 3超純水儀制備的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取50 mg 2-丙酰吡咯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并以甲醇定容至刻度，配制成濃度為1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別移取0.2，0.4，1.0，2.0，10.0和20.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，加甲醇定容搖勻，配制成2.0，4.0，10.0，20.0，100.0和200.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱，Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫，40 ℃；流動(dòng)相，甲醇-0.02 mol/L乙酸銨（冰乙酸調(diào)pH 3）（40∶60，體積比），等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)，285 nm；進(jìn)樣體積，10 μL。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確至0.1 mg）固體樣品于50 mL離心管中，加入30 mL水-甲醇（20∶80，體積比）混合溶劑，超聲提取30 min，以5 000 r/min離心3 min后，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜后供高效液相色譜分析。

準(zhǔn)確移取8 mL液體樣品于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，超聲提取30 min，轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，以5 000 r/min離心3 min后，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜后供高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同流動(dòng)相條件下光譜圖

使用10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以甲醇、甲醇-水（40∶60，體積比）、甲醇-0.02 mol/L乙酸銨（40∶60，體積比）、甲醇-0.02 mol/L乙酸銨（冰乙酸調(diào)pH 5.0）（40∶60，體積比）以及甲醇-0.02 mol/L乙酸銨（冰乙酸調(diào)pH 3.0）（40∶60，體積比）為流動(dòng)相，不經(jīng)過(guò)色譜柱直接進(jìn)入檢測(cè)器，二極管陣列檢測(cè)器在210～400 nm之間進(jìn)行掃描，掃描結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示：五者在285 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，前兩者光譜峰基本一致，后者由于高體積分?jǐn)?shù)乙酸在低波長(zhǎng)有強(qiáng)吸收，導(dǎo)致目標(biāo)物在低波長(zhǎng)處出現(xiàn)負(fù)值，但最大吸收峰與前兩者基本一致。因此，選擇285 nm作為該方法的檢測(cè)波長(zhǎng)，同時(shí)在實(shí)際測(cè)定過(guò)程中根據(jù)選擇的流動(dòng)相對(duì)應(yīng)光譜圖定性。

圖1 2-丙酰吡咯紫外掃描圖譜

2.2 流動(dòng)相選擇

2-丙酰吡咯為中等極性化合物，有弱酸性，試驗(yàn)采用Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離。分別考察了不同體積比（80∶20，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60和30∶70）甲醇-水作為流動(dòng)相對(duì)保留時(shí)間和峰型的影響。結(jié)果表明：有機(jī)相比例越小保留時(shí)間越長(zhǎng)，且峰逐漸展寬，響應(yīng)也隨之變低，當(dāng)體積比為30∶70時(shí)，目標(biāo)峰的保留時(shí)間已經(jīng)超過(guò)20 min，色譜圖見(jiàn)圖2。考慮到保留時(shí)間在10 min內(nèi)會(huì)有其他物質(zhì)干擾，超過(guò)20 min會(huì)影響分析效率，且消耗大量試劑，不符合綠色環(huán)保經(jīng)濟(jì)的理念，最終選擇比例為甲醇-水（40∶60，體積比）。

圖2 不同流動(dòng)相比例下2-丙酰吡咯色譜圖

在流動(dòng)相中加入適當(dāng)濃度的鹽可以改善峰型，流動(dòng)相中加入0.02 mol/L乙酸銨后，保留時(shí)間變小，峰高增高，峰型變得更加尖銳。同時(shí)考察了甲醇-0.02 mol/L乙酸銨（40∶60）在不同pH（6.8，5.0和3.0）條件下對(duì)保留時(shí)間和峰型的影響。由結(jié)果可知：隨著流動(dòng)相pH降低，保留時(shí)間逐漸減少，峰高逐漸升高，當(dāng)pH 3.0時(shí)，響應(yīng)值最高，可獲得最低的檢出限，且保留時(shí)間滿足試驗(yàn)要求，譜圖如圖3所示。最終確定使用流動(dòng)相甲醇-0.02 mol/L乙酸銨（乙酸調(diào)pH 3）（40∶60，體積比），見(jiàn)圖4。

圖3 流動(dòng)相pH對(duì)色譜圖的影響

圖4 含2-丙酰吡咯酸奶色譜圖

2.3 溶劑提取效率

考察了水、甲醇、乙腈三種不同溶劑對(duì)大米粉、發(fā)酵乳、食用菌三種基質(zhì)中待測(cè)組分的提取率，準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確至0.1 mg）樣品，各3組，分別加入水、甲醇、乙腈搖勻，超聲提取30 min，以5 000 r/min離心5 min后，取上清液供高效液相色譜分析。結(jié)果如表1所示。

表1 不同溶劑對(duì)色譜圖信號(hào)指標(biāo)的影響（n=3）

采用水和甲醇提取樣品，2-丙酰吡咯有較好的峰高和信噪比?？紤]到標(biāo)準(zhǔn)品在水中溶解度較差，最終選用溶劑水-甲醇（80∶20，體積比）作為提取溶劑。

2.4 檢出限、定量限及線性關(guān)系

在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，以不同樣品空白基質(zhì)加標(biāo)溶液進(jìn)行檢出限和定量限考察。以信噪比S/N分別為3和10確定2-丙酰吡咯在各種樣品中的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果顯示：固體樣品檢出限為9.0 mg/kg，定量限為30.0 mg/kg。礦泉水中檢出限為4.5 mg/kg，定量限15.0 mg/kg。配制成質(zhì)量濃度分別為2.0，4.0，10.0，20.0，100.0和200.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用高效液相色譜分析，以質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：2-丙酰吡咯回歸方程為y=73.3x-7.8，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 99，在2.0～200.0 mg/L濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出了良好的線性關(guān)系。

2.5 回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

分別在大米粉、發(fā)酵乳、食用菌中添加30.0，60.0和300.0 mg/kg以及在礦泉水添加1.25，2.50和12.5 mg/kg三個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，其回收率結(jié)果如表2所示。不同加標(biāo)濃度下2-丙酰吡咯的加標(biāo)回收率在91.0%～109.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.18%～2.56%之間，均在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍內(nèi)[11]，說(shuō)明該方法有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表2 2-丙酰吡咯的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.6 干擾試驗(yàn)

考察了質(zhì)量濃度均為10 mg/L食品中常見(jiàn)食品添加劑（甜味劑糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、甜蜜素、紐甜以及營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑維生素A、維生素D2、維生素D3、維生素E）在試驗(yàn)色譜條件下對(duì)待測(cè)組分的干擾。結(jié)果顯示，此條件下以上10種食品添加劑對(duì)2-丙酰吡咯的測(cè)定均無(wú)干擾。

3 結(jié)論

方法通過(guò)選擇提取溶劑水-甲醇（80∶20，體積比）提取食品中的2-丙酰吡咯，使用流動(dòng)相甲醇-0.02 mol/L乙酸銨（冰乙酸調(diào)pH 3）（40∶60，體積比），以Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱分離，采用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)2-丙酰吡咯，外標(biāo)法定量，得到快速測(cè)定食品中2-丙酰吡咯的高效液相色譜方法。該方法的方法學(xué)驗(yàn)證參數(shù)均符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》的要求[11]，具有良好的準(zhǔn)確度、精密度且操作簡(jiǎn)單，同時(shí)只需要采用少量對(duì)環(huán)境污染小的有機(jī)溶劑，符合綠色環(huán)保的環(huán)境理念。