熒光PCR技術(shù)應(yīng)用于芥辣調(diào)味品原料真?zhèn)舞b別

何永盛，連曉聰，花振新，羅北照，馮美紅

精益和泰質(zhì)量檢測股份有限公司（廣州 510700）

芥辣調(diào)味品以其獨特的風(fēng)味與口感，成為了生鮮山葵和辣根都是制作芥辣調(diào)味產(chǎn)品的常用原料，然而兩者在經(jīng)濟價值上卻存在著較大的差異。山葵又名山萮菜，原產(chǎn)于日本，是一種營養(yǎng)豐富的食用保健植物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗氧化等多種藥理作用，在國際市場上的需求很大，價格也較為昂貴[3]。辣根雖然與山葵同屬十字花科植物，但價格卻只有山葵的五分之一左右，而且具有易栽種、生長周期短等優(yōu)勢，因此被很多商家作為山葵的“代替品”來使用[4]。

在實際生產(chǎn)過程中，商家為了節(jié)約成本，往往會在辣根泥中加入色素進行調(diào)色，以此作為原料制作Wasabi等芥辣調(diào)味品[5]。加工后的辣根調(diào)味料與山葵調(diào)味料在形態(tài)上較為相似，難以通過外觀及味道上的細微差別來鑒定其原料屬性。由于山葵與辣根原料在價格上存在較大的差異，不法商家為了獲取高額的利潤，有可能以低價的辣根來冒充山葵原料制作芥辣調(diào)味品，這種摻偽造假的行為侵犯了消費者的知情權(quán)，也對其經(jīng)濟利益造成了一定的損失。

目前，山葵和辣根原料的鑒定仍缺乏有效的技術(shù)手段，雖然有學(xué)者嘗試分析兩者的化學(xué)成分，但由于山葵和辣根的主要風(fēng)味成分都是異硫氰酸酯類物質(zhì)，所以也難以通過此類方法進行準(zhǔn)確的鑒別[6-8]。與此相比，由于熒光PCR技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確且不受樣品形態(tài)限制等優(yōu)點，近年來在動植物原料成分鑒定研究方面得到了越來越廣泛的應(yīng)用[9-11]，因此研究擬借助此技術(shù)建立可以用于鑒別山葵和辣根成分的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山葵、辣根以及用于方法驗證的多種動植物材料和芥辣調(diào)味品均購自當(dāng)?shù)爻谢蚓W(wǎng)絡(luò)平臺。

熒光定量PCR儀（型號：7500），美國ABI公司；超微量核酸蛋白測定儀（型號：Q5000），美國Quawell公司；高速冷凍離心機，德國Wiggens公司。

DNA提取試劑盒（DNeasy mericon Food Kit），德國QIAGEN公司產(chǎn)品；PCR預(yù)混液2×premix ExTaq，寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

選取山葵和辣根各自的特異性基因，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中的其他物種序列進行比對，分別設(shè)計相應(yīng)的檢測引物和探針，序列如表1所示。試驗中所用引物和探針均委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成，各引物和探針在使用前統(tǒng)一用滅菌去離子水稀釋至10 μmol/L。

表1 山葵和辣根檢測引物及探針

1.2.2 樣品DNA的提取

采用QIAGEN公司的DNeasy mericon Food Kit，對購買的山葵和辣根樣品以及其他用于方法特異性驗證的樣品進行DNA提取，操作方法見其使用說明書。各樣品基因組DNA在上機測試前統(tǒng)一稀釋至25 ng/μL。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及程序

山葵檢測反應(yīng)體系：總體積為20 μL，其中2×premix ExTaq為10 μL，引物SK-Forward和SK-Reverse各0.4 μL，探針SK-Probe為0.2 μL，樣品DNA為2 μL，滅菌去離子水為7 μL。

辣根檢測反應(yīng)體系：總體積為20 μL，其中2×premix ExTaq為10 μL，引物L(fēng)G-Forward和LG-Reverse各0.4 μL，探針LG-Probe為0.2 μL，樣品DNA為2 μL，滅菌去離子水為7 μL。

山葵和辣根檢測反應(yīng)的程序均為：95 ℃時1 min；95 ℃時15 s，60 ℃時1 min，40個循環(huán)。

1.2.4 結(jié)果判定

在山葵檢測反應(yīng)中，若待測樣品的Ct值＜35，則可判定樣品中含有山葵成分；若Ct值≥35，則可判定樣品中未檢出山葵成分。

在辣根檢測反應(yīng)中，若待測樣品的Ct值＜35，則可判定樣品中含有辣根成分；若Ct值≥35，則可判定樣品中未檢出辣根成分。

1.2.5 方法特異性驗證

選取大米、大豆、豬肉、羅氏蝦等不同的動植物樣品作為檢測對象，分別使用山葵和辣根特異性引物及探針進行熒光PCR擴增，以驗證所建立方法的檢測特異性。

1.2.6 方法靈敏度測試

設(shè)置兩個試驗組：在試驗組1中將濃度同為25 ng/μL的山葵DNA和辣根DNA按1∶1 000的比例進行均勻混合，以此作為待測樣品，加入到山葵檢測反應(yīng)體系中進行熒光PCR擴增；在試驗組2中將濃度同為25 ng/μL的山葵DNA和辣根DNA按1 000∶1的比例進行均勻混合，以此作為待測樣品，加入到辣根檢測反應(yīng)體系中進行熒光PCR擴增。

1.2.7 樣品檢測

在網(wǎng)絡(luò)平臺和商場購買不同品牌的芥辣調(diào)味產(chǎn)品，提取各樣品的基因組DNA，用建立的檢測方法鑒別其是否含有山葵和辣根成分，以驗證該方法在實際樣品檢測中的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 山葵和辣根檢測反應(yīng)體系擴增結(jié)果

在山葵檢測反應(yīng)體系中加入50 ng的山葵DNA，同時在辣根檢測反應(yīng)體系中加入50 ng的辣根DNA，按照前述的反應(yīng)程序進行熒光PCR擴增，檢測結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，山葵和辣根樣品的DNA在各自的檢測反應(yīng)體系中都出現(xiàn)了典型的擴增曲線，且Ct值＜35，說明研究建立的檢測方法可以有效地鑒別山葵和辣根成分。

圖1 山葵和辣根樣品的熒光PCR擴增結(jié)果

2.2 方法的特異性試驗結(jié)果

以購買的山葵、辣根以及其他19種動植物樣品對方法的特異性進行檢驗，從表2的試驗結(jié)果可以看出，研究建立的山葵成分檢測方法僅對山葵樣品有特異性擴增，同時辣根成分檢測方法僅對辣根樣品有特異性擴增，而其他19種樣品在兩種反應(yīng)體系中均未檢出山葵或辣根成分，說明研究建立的方法具有良好的特異性。

表2 方法特異性試驗結(jié)果

2.3 方法靈敏度測試結(jié)果

以25 ng/μL的山葵DNA和25 ng/μL的辣根DNA為母液，分別按照1∶1 000和1 000∶1的比例制作混合樣品DNA，以此作為方法靈敏度的測試樣品，分別用于山葵和辣根反應(yīng)體系的擴增。圖2的試驗結(jié)果顯示，體積濃度為0.1%的山葵DNA和辣根DNA可以分別在山葵反應(yīng)體系和辣根反應(yīng)體系中擴增出典型的曲線，且Ct值＜35，說明研究建立的山葵和辣根檢測方法的靈敏度均可達到0.1%。

圖2 山葵和辣根檢測方法的靈敏度試驗結(jié)果

2.4 樣品檢測結(jié)果

在當(dāng)?shù)厥袌龊途W(wǎng)絡(luò)平臺上購買7批次芥辣調(diào)味品，用建立的山葵和辣根成分檢測方法對各批次樣品進行檢測，并將所得結(jié)果與產(chǎn)品標(biāo)示的原料成分進行對比。表3的結(jié)果顯示，研究建立的實時熒光PCR方法能夠適用于市售芥辣調(diào)味品的實際檢測，其中有6批次樣品的檢測結(jié)果與產(chǎn)品標(biāo)標(biāo)的原料成分一致，但有1批次樣品出現(xiàn)了與產(chǎn)品標(biāo)示原料成分不一致的情況，說明商家可能對此產(chǎn)品進行了摻偽造假。

表3 市售芥辣調(diào)味品的檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

研究建立的實時熒光PCR檢測方法能夠準(zhǔn)確鑒別芥辣調(diào)味品中的山葵和辣根原料成分。在對市售芥辣調(diào)味品的檢測中，發(fā)現(xiàn)確實有商家利用低價的辣根原料冒充山葵原料的情況出現(xiàn)，因此該方法的建立可以為有關(guān)部門對芥辣調(diào)味產(chǎn)品原料真?zhèn)吻闆r的監(jiān)督提供有力的技術(shù)支持。此外，研究建立的方法仍有進一步改良的空間，比如可以通過優(yōu)化PCR體系，建立在一個反應(yīng)中同時鑒別山葵和辣根成分的雙重實時熒光PCR檢測方法等，有待在后續(xù)的研究中加以完善。