響應(yīng)面法優(yōu)化苜蓿蛋白酶解工藝

李偉民，陳九杰，魏泉增，張瑩麗

許昌學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南省食品安全生物標(biāo)識快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（許昌 461000）

紫花苜蓿在中國各地均有種植[1]。苜蓿（Medicago sativa）中蛋白質(zhì)含量可達(dá)22%以上，含有的氨基酸種類多樣[2]。大多數(shù)直接提取的葉蛋白很難被直接利用，而且苜蓿蛋白具有很強(qiáng)的抗原性，表現(xiàn)為較低的消化率和生物效價(jià)[3]，這使得苜蓿蛋白產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到一定阻礙。

苜蓿蛋白經(jīng)過酶法水解后制備的多肽對人體具有重要作用，多肽是涉及人體內(nèi)多種細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，對于預(yù)防心腦血管疾病、促進(jìn)造血功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌與神經(jīng)系統(tǒng)等[4]方面疾病，多肽類藥物具有明顯效果[5]。多肽不僅可提高物質(zhì)的利用價(jià)值，還可賦予物質(zhì)一定生物學(xué)活性，特別是在增強(qiáng)抑菌性[6]、免疫性[7]和抗氧化性[8]等方面。已發(fā)現(xiàn)的多肽主要有降血壓、促進(jìn)免疫功能、抑菌等[9]多種功能。

近年來，多肽的制備多選用核桃[10]、海參[11]、魚籽[12]等原料，而這些原材料通常價(jià)格昂貴，不易獲取。試驗(yàn)采用苜蓿為原材料，苜蓿易獲得，經(jīng)濟(jì)價(jià)值低，種質(zhì)資源豐富。目前對苜蓿多肽的制備方法的研究較少。試驗(yàn)利用中性蛋白酶對苜蓿進(jìn)行酶解制備多肽，以提高苜蓿的利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花苜蓿；中性蛋白酶（酶活力20萬 U/g，南寧龐博生物工程有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2014B分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；TG16-WS離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；T6課件分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Dk-8D水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；PHS-3C型pH計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；DL-1型電爐（中興偉業(yè)儀器有限公司）；750t型粉碎機(jī)（鶴壁市天冠儀器儀表有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多肽溶液制備方法

準(zhǔn)確稱取一定量的苜蓿粉于反應(yīng)容器中，依照蛋白酶添加量加入中性蛋白酶溶液，調(diào)整到預(yù)設(shè)pH，緩慢攪拌，酶解過程中注意維持酶解系統(tǒng)pH恒定。酶解結(jié)束后將酶液迅速置于沸水中滅酶10 min。冷卻至室溫后，以4 000 r/min離心10 min，收集上清液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

溶液中多肽含量測定方法采用雙縮脲法[13]。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方式見表1。在試管中加入一定酪蛋白溶液，其中不足1 mL的用蒸餾水補(bǔ)至1 mL，以1.0 mL蒸餾水為空白，向各試管中加入4 mL雙縮脲試劑，充分混勻，室溫下反應(yīng)30 min，用721分光光度計(jì)在540 nm處測其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

1.3.3 多肽濃度測定

將收集到的上清液定容至100 mL，搖勻，移取10 mL溶液至離心管中，以4 000 r/min離心5 min，使上清液澄清，吸取1 mL上清液，并和4 mL雙縮脲試劑混合，以蒸餾水為空白，室溫下溶液反應(yīng)30 min，測定吸光度。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系式，計(jì)算溶液濃度。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

確定中性蛋白酶添加量（1 500，2 250，3 000，3 750和4 500 U/g）、酶解溫度（40，45，50，55和60℃）、酶解時(shí)間（2，3，4，5和6 h）和酶解pH（pH 5，6，7，8和9 h）4個(gè)因素，分別考察其對溶液中多肽含量的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果探索最適酶解時(shí)間、最適酶解pH、最適酶解溫度、最適中性蛋白添加量的基礎(chǔ)上，選取其中的酶解時(shí)間、酶解pH、酶解溫度作響應(yīng)面綜合分析。采用Design-Expert 8.0.6軟件中心組合試驗(yàn)進(jìn)行多肽含量提取最佳工藝。試驗(yàn)方案見表2。

表2 試驗(yàn)因素和水平

1.4 數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析，建立回歸方程并作等高線和三維曲面圖，對任意2種因素的交互效應(yīng)進(jìn)行分析和評價(jià)，得到最優(yōu)工藝組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

以酪蛋白含量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得到回歸方程：y=0.043 5x+0.000 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。

圖1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 中性蛋白酶添加量對酶解效果的影響

中性蛋白酶添加量對酶解效果的影響如圖2所示。苜蓿在中性蛋白酶添加量1 500 U/g時(shí)，多肽含量最低，隨著中性蛋白酶添加量增加，水解度不斷增大。中性蛋白酶添加量3 750 U/g時(shí)，多肽含量最高，隨著中性蛋白酶量繼續(xù)增加，多肽含量降低。酶濃度過高，酶分子間可能相互水解，導(dǎo)致酶解效果下降[14]。

圖2 中性蛋白酶添加量對苜蓿多肽含量的影響

2.2.2 酶解溫度對酶解效果的影響

酶解溫度對酶解效果的影響如圖3所示，溶液中多肽含量呈現(xiàn)先緩慢上升后逐漸下降趨勢。溫度40 ℃時(shí)，苜蓿多肽含量較低。在一定范圍內(nèi)，溶液中多肽含量與酶解溫度呈正相關(guān)。溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，苜蓿多肽含量最高，隨后繼續(xù)增大溫度，多肽含量開始下降，溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，苜蓿多肽含量最低，溫度偏高或偏低均會抑制中性蛋白酶的活性，溫度過高會導(dǎo)致中性蛋白酶逐漸失活，影響酶解效果，酶解溫度以50℃為宜。

2.2.3 酶解時(shí)間對酶解效果的影響

酶解時(shí)間對酶解效果的影響如圖4所示。苜蓿在酶解2 h條件下多肽含量最低，隨著時(shí)間增加，苜蓿多肽含量隨之增加。苜蓿在酶解時(shí)間4 h時(shí)多肽含量最大。隨著酶解時(shí)間繼續(xù)增加，苜蓿多肽含量下降，水浴時(shí)間6 h時(shí)，苜蓿多肽含量最低，這可能是由于隨著酶解時(shí)間延長，短鏈的多肽片段被繼續(xù)水解為氨基酸[15]。酶解最適時(shí)間以4 h為宜。

圖3 酶解溫度對苜蓿多肽含量的影響

圖4 酶解時(shí)間對苜蓿多肽含量的影響

2.2.4 酶解pH對酶解效果的影響

酶解pH對酶解效果的影響如圖5所示。苜蓿在pH 5條件下多肽含量最小。在一定范圍內(nèi)，酶解pH與苜蓿多肽含量呈正相關(guān)。苜蓿多肽在酶解pH 7時(shí)多肽含量為最大值，隨著pH逐漸增大，苜蓿多肽含量開始下降。苜蓿在酶解pH 9條件下多肽含量最低。酶解最適pH為7。

圖5 酶解pH對苜蓿多肽含量的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)分析及結(jié)果

由4個(gè)單因素結(jié)果選取其中的酶解時(shí)間（A）、酶解pH（B）、酶解溫度（C）這3個(gè)因素作為參考依據(jù)，以多肽含量為指標(biāo)。進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，確定中性蛋白酶水解制備苜蓿多肽的最佳工藝條件。響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 方差分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型為：R=6.78-0.043-0.010B-0.20C-0.17AB+0.25AC+0.012BC-0.65A2-0.51B2-0.39C2。由表4可以看出，模型達(dá)到極顯著（p＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），表明方程無失擬性因素存在，回歸模型與實(shí)際值能較好地?cái)M合。一次項(xiàng)A表現(xiàn)為顯著，B、C表現(xiàn)為極顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2表現(xiàn)為極顯著，說明它們對響應(yīng)值影響極大。由F檢驗(yàn)可以得到影響因素主次排序：酶解溫度（C）、酶解pH（B）和酶解時(shí)間（C）。

表4 回歸分析結(jié)果

圖6直觀反映不同兩因素之間的交互作用對多肽含量的影響，曲面越彎曲，兩因素交互作用對多肽含量的影響越顯著。由表4可知，其中因素AB、AC對多肽含量的影響顯著（p＜0.01），BC對多肽含量的影響不顯著（p＞0.05）。

圖6 不同兩因素之間交互作用對酶解液中多肽含量的影響

2.3.3 苜蓿蛋白酶解工藝的確定及優(yōu)化工藝條件驗(yàn)證

經(jīng)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Design-Export 8.0.6軟件分析得出最優(yōu)條件：酶解pH 6.88、時(shí)間4.10 h、溫度49.94 ℃。此條件下酶解液中多肽含量為6.778 8 mg/mL。將工藝參數(shù)調(diào)整為：酶解時(shí)間4.1 h、溫度49.9 ℃、pH 6.88。在此工藝條件下測定的多肽含量為6.752 1 mg/mL。與預(yù)測值的相對誤差0.39%，比較接近。試驗(yàn)可證明模型可靠，方程能較真實(shí)反映各因素對多肽含量影響的實(shí)際情況。

3 結(jié)論

試驗(yàn)為利用中國苜蓿蛋白資源、提高苜蓿附加值，在單因素基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)對苜蓿蛋白酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，苜蓿多肽制備的最優(yōu)條件為：加酶量3 750 U/g、酶解pH 6.88、酶解溫度49.9 ℃、酶解時(shí)間4.1 h。在此條件下，測得溶液中多肽的含量最高，達(dá)到6.752 1 mg/mL，與預(yù)測值兩者之間的相對誤差為0.39%，通過軟件建造的模型也能真實(shí)直觀反映情況，模型與實(shí)際情況貼近吻合，響應(yīng)面的數(shù)據(jù)處理真實(shí)有效，具有實(shí)際使用價(jià)值，為苜蓿進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。