羅布麻總黃酮泡騰片的制備工藝及抗氧化活性

王慧竹，王禹衡，張興濤，姜詩宇，陳帥

吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院（吉林 132022）

羅布麻葉，又名“茶葉花”“野茶”，為夾竹桃科植物羅布麻（Apocynum venetum L.）的干燥葉[1]。羅布麻葉中的化學(xué)成分包括黃酮類、有機(jī)酸等[2-7]。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類是羅布麻主要活性成分，對調(diào)節(jié)血壓、預(yù)防高血脂具有良好療效[5]。泡騰片具有攜帶方便、分散速度快、有汽水般口感等優(yōu)點(diǎn)而受到國內(nèi)外廣大消費(fèi)者的青睞，近幾年在食品及保健品生產(chǎn)中的應(yīng)用逐漸增多[8-10]。目前關(guān)于羅布麻制劑主要有復(fù)方羅布麻片、復(fù)方羅布麻顆粒等，但普通片劑不便于老年人或吞咽功能低的患者使用，并且已上市的制劑并未對羅布麻黃酮的含量進(jìn)行控制。此次試驗(yàn)采用響應(yīng)面法對羅布麻黃酮泡騰片（AVET）制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對AVET的抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為開發(fā)羅布麻資源提供更加科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅布麻飲片（吉林大藥房，批號20180901）；金絲桃苷（成都曼斯特生物科技有限公司，批號MUST-12040302，純度≥98%）；碳酸氫鈉（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）；PEG 6000（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；乳糖（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）；酒石酸（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；PVP-K30（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蘋果酸（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）；甘露醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；所有化學(xué)試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

TDP-6單沖壓片機(jī)（上海天峰制藥設(shè)備有限公司）；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司）；KQ300VDE數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；TU-1950紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；FA2004N電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SY-3D片劑四用測定儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），包括四元低壓梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、DAD檢測器、Chemstation色譜工作站。

1.3 試驗(yàn)部分

1.3.1 羅布麻總黃酮提取物的制備

稱取適量羅布麻葉，粉碎，過60目篩，置于2 000 mL圓底燒瓶中，按1∶15（g/mL）料液比加入適量無水乙醇，回流脫脂4 h，過濾，用適量水洗濾渣，干燥，重新置于2 000 mL圓底燒瓶中，按料液比1∶15（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇，回流提取2次，時(shí)間分別為3和2 h，合并兩次濾液，減壓回收乙醇，得羅布麻粗提液，并以水為溶劑進(jìn)行稀釋，以0.8 mL/min流速通過AB-8大孔樹脂柱，在以水為洗脫劑洗脫至無色時(shí)，改用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫部分，回收溶劑，水浴蒸干，真空干燥，研磨，即得羅布麻總黃酮提取物（金絲桃苷含量為5.84%）。

1.3.2 羅布麻總黃酮泡騰片的制備

采用酸堿分開制粒的方法制備泡騰片，將檸檬酸、總黃酮提取物、乳糖（填充劑）、甘露醇（甜味劑）分別研碎、混合，以PVP-k30的乙醇溶液為粘合劑，制軟材，過16目篩制酸粒；將碳酸氫鈉、總黃酮提取物、乳糖、甘露醇分別研碎、混合，以PVP-k30的乙醇溶液為粘合劑，制軟材，過16目篩制堿粒。將酸粒、堿粒分別干燥后混合均勻，加入潤滑劑PEG-6000，混合均勻，壓片。

1.3.3 羅布麻總黃酮泡騰片質(zhì)量評價(jià)

片重差異的測定：取20片該品，精密稱定總質(zhì)量和每片的質(zhì)量，經(jīng)每片質(zhì)量與平均質(zhì)量比較，即可得出羅布麻總黃酮泡騰片的片重差異。

硬度的測定：隨機(jī)取6 片泡騰片，分別放入SY-3D片劑四用測定儀中的壓板之間，開動(dòng)機(jī)器，沿徑向方向緩緩加壓，片劑剛好碎裂時(shí)的力即為泡騰片的硬度，計(jì)算平均值。

脆碎度的測定：隨機(jī)取10片泡騰片，精密稱定質(zhì)量，置于SY-3D片劑四用測定儀塑料圓筒內(nèi)，開動(dòng)機(jī)器，以25 r/min速度轉(zhuǎn)動(dòng)4 min，取出，用吹風(fēng)機(jī)吹去片劑表面脫落的粉末，精密稱重，計(jì)算減失質(zhì)量比。

崩解時(shí)限的測定：取1片泡騰片，置于250 mL燒杯（內(nèi)有200 mL溫度20±5 ℃的水）中，即有許多氣泡放出，當(dāng)片劑或碎片周圍的氣體停止逸出時(shí)，片劑應(yīng)溶解或分散在水中，無聚集的顆粒剩留，同法再取6片進(jìn)行檢查，各片均應(yīng)在5 min內(nèi)崩解。

發(fā)泡量的測定：取10支25 mL具塞刻度試管，每支試管加2.0 mL蒸餾水，置37±1 ℃水浴中5 min，各管中分別投入1片羅布麻總黃酮泡騰片，20 min內(nèi)觀察最大發(fā)泡量的體積，平均發(fā)泡體積不得少于6 mL。

pH的測定：泡騰片6片，分別置于6個(gè)100 mL燒杯（內(nèi)有50 mL溫度為20±5 ℃蒸餾水）中，使其發(fā)泡溶解，帶氣泡消失后，攪拌均勻測定各溶液pH，計(jì)算平均值。

泡騰片中金絲桃苷含量的測定：定量精密稱取金絲桃苷，制成質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL的對照品溶液，精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL金絲桃苷對照品溶液，置于2 mL容量瓶中，分別得到濃度為18，36，54，72和90 μg/mL的對照品溶液，分別精密吸取上述濃度的對照品溶液，注入液相色譜儀，按色譜條件進(jìn)行分析：采用色譜柱ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（含1%冰乙酸，B）-水溶液（含0.4%磷酸，D），梯度洗脫程序：0～15 min，5%～10% B；15～20 min，10%～11% B；20～35 min，11%～15% B；35～42 min，15%～16%；42～50 min，16%～33% B；50～55 min，33%～90% B；55～60 min，90% B，柱溫55 ℃，體積流量0.8 mL/min，檢測波長360 nm，定量環(huán)進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另隨機(jī)取3批自制羅布麻總黃酮泡騰片，每批10片，研碎，精密稱取2.0 g粉末，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL 60%乙醇，超聲處理20 min后離心（10 000 r/min），取上清液置于50 mL容量瓶中，定容，即得供試品溶液，后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測定金絲桃苷含量。

1.3.4 泡騰片的感官評價(jià)

泡騰片的口感、溶解效果、產(chǎn)品外觀采用感官評價(jià)，評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。具體評價(jià)過程采用盲樣評價(jià)法，即選取20名接受過感官評價(jià)訓(xùn)練的志愿者組成感官評價(jià)小組，隨機(jī)抽取泡騰片樣品，進(jìn)行沖調(diào)，并對沖調(diào)后飲品的口感、溶解效果、產(chǎn)品外觀進(jìn)行評分[9,11]。感官評分=口感（40%）+外觀（30%）+溶解效果（30%）。

表1 羅布麻總黃酮泡騰片評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.5 泡騰片制備工藝的單因素試驗(yàn)

羅布麻茶收載于《中國藥典》2015年版一部，規(guī)定每袋（3.0 g）含羅布麻葉以金絲桃苷計(jì)不得少于6.0 mg，參照此標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合自制泡騰片的質(zhì)量（規(guī)格：1.0 g/片），模擬計(jì)算可知，固定羅布麻總黃酮提取物在處方中的比例10.5%，每1片泡騰片可相當(dāng)于1袋羅布麻茶來使用。在前期工作基礎(chǔ)上，分別選擇了檸檬酸為酸源、碳酸氫鈉為堿源、乳糖為填充劑、PEG 6000為潤滑劑，為優(yōu)化泡騰片的制備工藝，固定羅布麻總黃酮提取物在片劑中的比例為10.5%，以感官評分作為評價(jià)指標(biāo)，探索酸堿總用量（30%，35%，40%，45%和50%）、酸堿配比（檸檬酸與碳酸氫鈉質(zhì)量比0.8∶1，1∶1，1.2∶1，1.4∶1和1.6∶1）、PEG 6000的用量（3%，4%，5%，6%和7%）對羅布麻總黃酮泡騰片質(zhì)量的影響。

1.3.6 泡騰片制備工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)BBD原理，選取酸堿總用量（X1）、酸堿配比（X2）、PEG 6000用量（X3）三個(gè)因素作為變量，以感官評價(jià)為評分（Y）為因變量設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平編碼值如表2所示。

表2 泡騰片制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.3.7 羅布麻總黃酮泡騰片抗氧化活性

維生素C儲備溶液的配制：精密稱取0.008 2 g維生素C（VC）置于100 mL棕色容量瓶中，以無水甲醇為溶劑定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為82 μg/mL的VC儲備液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DPPH儲備溶液的配制：精密稱取0.055 0 g DPPH，置于250 mL棕色容量瓶中，加入無水甲醇溶解，定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.22 mg/mL的DPPH溶液，于4 ℃避光保存。

DPPH清除自由基能力的測定：取2片泡騰片樣品，投入10 mL水中，待完全溶解后，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容，得到質(zhì)量濃度為8.4 mg/mL（以羅布麻總黃酮提取物在溶液中濃度計(jì)）的供試溶液，分別吸取0.2，0.6，1.2，1.6，2.0和2.5 mL供試溶液，置于10 mL棕色容量瓶中，分別加入1.5 mL DPPH儲備液，分別加入無水甲醇稀釋，定容，搖勻，避光反應(yīng)30 min，于515 nm測定吸光度Ai（供試溶液+DPPH溶液+無水甲醇）；不加供試溶液按同樣方法測定A0（DPPH溶液+無水甲醇）；不加DPPH儲備液按同樣方法測定Aj（供試溶液+無水甲醇）。按式（1）計(jì)算樣品對DPPH自由基的清除率CLS，以提取液濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)進(jìn)行曲線擬合[12]，根據(jù)回歸方程計(jì)算半數(shù)清除濃度（IC50）。

精密量取1 mL VC儲備液，置于5 mL容量瓶中，無水甲醇稀釋定容，分別精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL稀釋后的VC溶液，置于10 mL棕色容量瓶中，按樣品DPPH清除自由基能力測定方法測得Ai'（VC溶液+DPPH溶液+無水甲醇）、A0'值（DPPH溶液+無水甲醇）、Aj'值（VC溶液+無水甲醇），按式（2）計(jì)算VC對DPPH自由基的清除率CLc，以提取液濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)進(jìn)行曲線擬合，根據(jù)回歸方程計(jì)算VC的IC50值。

1.3.8 數(shù)據(jù)的分析處理

使用SPSS 22.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Minitab 16.3軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，使用Origin 2016軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AVET中金絲桃苷含量的測定

按1.3.3項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣對照品溶液和供試品溶液，色譜圖如圖1所示，其中1號峰為金絲桃苷。

圖1 金絲桃苷對照品（A）和AVET供試品（B）色譜圖

以金絲桃苷對照品的濃度（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得方程Y=2 344X-2.140 8（R2=0.999 9），羅布麻總黃酮泡騰片中金絲桃苷含量測定結(jié)果如表3所示。

表3 3批羅布麻總黃酮泡騰片中金絲桃苷含量測定結(jié)果

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酸堿總用量對感官評分的影響

從圖2可以看出，當(dāng)酸堿總用量為30%～40%時(shí)，感官評分隨酸堿總用量增大而升高；當(dāng)酸堿總用量達(dá)到40%時(shí)，感官評分最大，為4.35分；當(dāng)酸堿總用量＞40%后，感官評分開始逐漸降低，可能是酸堿總用量增加后，泡騰片的口感偏酸所致。因此選擇酸堿總用量30%，40%和50%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.2 酸堿配比對感官評分的影響

從圖3可以看出，當(dāng)酸堿配比為0.8∶1～1.2∶1時(shí)，感官評分隨酸堿配比增大而升高；當(dāng)酸堿配比達(dá)到1.2∶1時(shí)，感官評分最大，為4.38分；當(dāng)酸堿配比＞1.2∶1后，感官評分開始逐漸降低，可能是酸堿配比增加后，處方中檸檬酸的量相對增多，影響了泡騰片的口感和溶解性所致。因此選擇酸堿配比1∶1，1.2∶1和1.4∶1進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 酸堿總用量對感官評分的影響

圖3 酸堿配比對感官評分的影響

2.2.3 PEG 6000用量對感官評分的影響

從圖4可以看出，當(dāng)PEG 6000用量為3%～6%時(shí)，感官評分隨PEG 6000用量增大而增大；當(dāng)PEG 6000用量達(dá)到6%時(shí)，感官評分最大，為4.25分；當(dāng)PEG 6000用量＞6%后，感官評分略有下降，可能是PEG 6000用量過少，壓片易黏沖，影響泡騰片的外觀，而PEG 6000用量過大，影響泡騰片在水中的溶解性。因此選擇PEG 6000用量5%，6%和7%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 PEG 6000用量對感官評分的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

利用Minitab 16.3軟件對表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，得到以Y為因變量，X1、X2、X3為自變量的三元二次方程：Y=-59.935+1.662X1+16.668X2+7.667X3+0.295X1X2-0.054 5X1X3-0.450X2X3-0.021 7X12-11.481X22-0.407X32，對此模型進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 回歸模型方差分析

從表5可以看出，回歸模型的p=0.000 4，顯著性分析結(jié)果為極顯著（p＜0.01）；失擬項(xiàng)的p=0.523 3＞0.05，說明模型的擬合程度良好，影響擬合的因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾很??；方程決定系數(shù)R=0.863 2，說明響應(yīng)值的變化有86.32%來源于所選變量，由此反映出回歸模型的擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，可用該回歸方程代替試驗(yàn)實(shí)際值進(jìn)行分析和預(yù)測泡騰片的感官評分值。從表5還可看出，X1、X2、X1X2、X1X3項(xiàng)對感官評分值影響顯著（p＜0.05），X12、X22、X32對試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著（p＜0.01），而其他線性項(xiàng)和交互項(xiàng)影響則不顯著（p＞0.05），由此反映試驗(yàn)選定的各因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2.3.2 響應(yīng)曲面分析

為了更加清晰表達(dá)兩個(gè)因素的交互作用對泡騰片感官評分的影響，在固定X1、X2、X3中任意一個(gè)因素的值為零水平對應(yīng)實(shí)際值的基礎(chǔ)上，考慮另外兩個(gè)因素對感官評分的影響，根據(jù)回歸模型繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖[13-14]，結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，酸堿總量、酸堿比例對感官評分值影響比較明顯，而酸堿總量和酸堿比例、酸堿用量和PEG 6000用量之間的交互作用對試驗(yàn)結(jié)果影響也比較顯著，這與表5的方差分析結(jié)果相吻合。

圖5 兩因素交互作用對感官評分值影響的響應(yīng)曲面和等高線圖

利用Minitab軟件同時(shí)得到回歸模型優(yōu)化的泡騰片最佳制備工藝參數(shù)：酸堿總用量37.88%、酸堿配比1.16∶1、PEG 6000用量6%，羅布麻總黃酮泡騰片感官評分為4.64%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)的可操作性，將上述工藝參數(shù)修正為：酸堿總用量38%、酸堿配比1.16∶1、PEG 6000用量6%。在此工藝條件下，重復(fù)3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，羅布麻總黃酮泡騰片感官評分為4.61%，實(shí)際感官評分與理論感官評分的差值僅占理論提取率的0.65%，說明由模型方程優(yōu)化的最佳工藝條件穩(wěn)定可靠。

2.4 羅布麻總黃酮泡騰片質(zhì)量評價(jià)

按照《中國藥典》的要求檢查泡騰片的各項(xiàng)指標(biāo)。制得的AVET外觀光滑均勻，平均片重1.0±0.04 g，未發(fā)現(xiàn)片重超過規(guī)定限度，崩解時(shí)限均在5 min以內(nèi)，所得溶液呈弱酸性，每片泡騰片發(fā)泡量10.4±0.18 mL，脆碎度0.81%±0.04%，每片泡騰片中金絲桃苷含量為56.1±0.26 mg/片。

2.5 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

由圖6可知，AVET對DPPH自由基有明顯的清除作用，且隨樣品質(zhì)量濃度的加大清除率呈上升趨勢，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.504 mg·mL-1時(shí)，AVET對DPPH自由基清除率達(dá)到55.01%，但AVET對DPPH自由基清除率低于同濃度的VC。分別對AVET和VC濃度與清除率進(jìn)行曲線回歸，得方程：Y（ATB）=31.63lnX+108.21（R2=0.983 9），Y（VC）=52.02lnX+78.53（R2=0.979 7）。通過計(jì)算可求得AVET和VC對DPPH自由基的IC50分別為0.010 7和0.007 3 mg·mL-1，表明AVET對DPPH自由基清除能力弱于VC。

圖6 羅布麻總黃酮泡騰片和VC對DPPH自由基的清除能力的影響

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)以羅布麻總黃酮為原料，旨在制備攜帶方便、口感好、容易吸收的泡騰片。通過單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面的方法，以產(chǎn)品外觀、口感、溶解性能作為重要考察指標(biāo)，采取綜合評分法，對泡騰片的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，及原輔料用量進(jìn)行優(yōu)化，最終確定酸堿總用量38%、酸堿配比1.16∶1、PEG 6000用量6%，在此條件下制得泡騰片外觀光滑均勻，酸甜適中，口感柔和可口，反應(yīng)劇烈，崩解迅速，溶解性能良好，綜合評分為4.61分。泡騰片的片重差異、硬度、脆碎度、崩解時(shí)限、pH、發(fā)泡量等指標(biāo)均符合規(guī)定。此外，此次試驗(yàn)還對AVET的體外抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明AVET具有體外抗氧化活性，但抗氧化能力要弱于維生素C，研究結(jié)果對于更好地開發(fā)利用羅布麻資源提供重要的依據(jù)。