無標記型生物傳感器的研究進展

張克輝，曹燕燕，田 野，王磊

（1.河北建筑工程學院電氣工程學院，河北張家口 075000；2.河北北方學院信息科學與工程學院，河北張家口 075000；3.河北北方學院理學院，河北張家口 075000）

0 引言

生物醫(yī)學技術(shù)的不斷發(fā)展使得用于生物醫(yī)學檢測分析的生物傳感器技術(shù)面臨越來越大的挑戰(zhàn)。為了從生物醫(yī)學檢測中獲取更高質(zhì)量的信息，應(yīng)用先進傳感技術(shù)和敏感材料的新型生物醫(yī)學傳感器技術(shù)已經(jīng)成為近年來學術(shù)界的研究熱點，生物醫(yī)學傳感器開始向自動化、高安全性、高靈敏度、集成化和實現(xiàn)在線連續(xù)監(jiān)測等方向發(fā)展。

生物傳感器是一種新型傳感器，利用與敏感元件所結(jié)合的分析物或化學基團來測量生物學或仿生學信號。通過生物敏感材料與包括酶、抗體、抗原、蛋白質(zhì)、微生物、細胞、組織、核酸等生物活性被測分析物結(jié)合，再經(jīng)過一定的理化換能器，觸發(fā)一種或多種物理、化學特性的改變，例如pH 值的改變、電子的轉(zhuǎn)移、質(zhì)譜的改變、熱轉(zhuǎn)移、氣體或特異性離子的攝入或釋放，將其轉(zhuǎn)變成可測信號，從而實現(xiàn)被測物的定性及定量分析[1]。

圖1 基于檢測技術(shù)的生物傳感器分類[2]

生物傳感器的分類方法很多，根據(jù)檢測技術(shù)可以分為無標記檢測和標記檢測[2]，如圖1 所示。標記檢測技術(shù)使用“標簽”來檢測特定分析物。常用的3種標記檢測技術(shù)有熒光[3]、化學發(fā)光[4]和放射性[5]。熒光可以看作一種短時發(fā)光（<1 μs），是目前首選和使用最廣泛的檢測方法，其原理是將帶有標記的目標分子裝載在固定探針分子（如抗體）表面。熒光標記檢測技術(shù)在標記和純化過程中會導致樣品損失，偶爾還會導致功能喪失，且大多數(shù)熒光團在光照下會很快變白，對溶液的pH 值同樣非常敏感?；瘜W發(fā)光是一種光輻射現(xiàn)象，由化學反應(yīng)而產(chǎn)生，具有靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于各大分析領(lǐng)域。其缺點主要在于有限的特征分辨力和動態(tài)范圍，且只能檢測一次。放射性檢測是利用放射性同位素進行標記，適用于要求高靈敏度和分辨力的檢測。然而，出于對放射性物質(zhì)安全性處理的考慮，很難實現(xiàn)自動化操作，因此局限于低吞吐量的應(yīng)用。

無標記檢測技術(shù)是另一種越來越受到關(guān)注的新技術(shù)，不需要對適配體或受體進行標記，卻可以篩選出具有生物活性的分子相互作用和進行細胞反應(yīng)，提供選擇性、親和性乃至動力學和熱力學的相關(guān)詳細信息，該技術(shù)近年來取得了巨大的進展[6-9]。

本文主要介紹幾種常見的無標記型生物傳感器，包括磁彈性、表面等離子體共振、聲波、電化學以及其他類型的生物傳感器，詳細闡述其傳感機理、應(yīng)用以及優(yōu)缺點。

1 磁彈性生物傳感器

1.1 傳感機理

磁彈性無標記型生物傳感器近年來得到了迅猛發(fā)展。其主要采用Metglas 2826 MB 等磁致伸縮材料條帶作為傳感元件，因具有成本低、使用方便、靈敏度高、無線傳感等特點而受到廣泛關(guān)注[10]。磁致伸縮材料受到勵磁線圈產(chǎn)生的外加交變磁場作用會沿外加磁場方向伸長或收縮，從而有效地將磁能轉(zhuǎn)化為機械振動。然后機械振動產(chǎn)生的磁通密度可以被拾波線圈無線檢測到，無需物理連接和內(nèi)部電源供應(yīng)，屬于無源、無線傳感器。磁彈性生物傳感器本身是磁致伸縮的，對磁彈性材料的質(zhì)量變化比較敏感，能夠相應(yīng)引起傳感器共振頻率的變化[11]。

1.2 應(yīng)用

近年來，研究人員相繼研發(fā)了一種由牛血清白蛋白功能化的磁彈性無標記型生物傳感器，可以實現(xiàn)重金屬離子Pb2+、Cd2+、Cu2+的無線檢測[12-13]；Sang 等[14]研制的磁彈性金納米傳感器可以用于檢測阿特拉津；Sang 等[15]研制的無線免疫球蛋白涂覆的磁彈性無標記型生物傳感器（如圖2 所示）可以用于快速、低成本檢測人血清白蛋白的不同分子狀態(tài)，其共振頻率的變化與人血清白蛋白的濃度呈良好的線性關(guān)系，檢測下限為0.039 μg/mL，響應(yīng)靈敏度為8.7 Hz/（μg·mL-1）。

圖2 一種用于檢測人血清白蛋白的磁彈性無標記型生物傳感器的傳感機理[15]

1.3 優(yōu)缺點

磁彈性無標記型生物傳感器因具有無線、快速響應(yīng)、高靈敏度和選擇性、操作簡易等特點，可用于酶檢測、蛋白質(zhì)檢測、免疫反應(yīng)等，為食品檢驗和臨床醫(yī)學提供了有效的研究和實時的體內(nèi)分析。但日后仍需在磁致伸縮材料方面進一步開發(fā)和研究，以提高磁彈性生物傳感器的性能。

2 表面等離子體共振生物傳感器

2.1 傳感機理

表面等離子體共振生物傳感器是以光學方法來測量傳感器表面附近的折射率，當光束以特定的共振角度撞擊到金屬薄膜上時，表面等離子體與光產(chǎn)生共振，當生物分子與表面結(jié)合并改變表面層的質(zhì)量時，共振角隨之發(fā)生位移。這種共振角的變化可以作為共振信號，實時進行非侵入性的檢測。

2.2 應(yīng)用

國內(nèi)外許多研究者致力于開發(fā)表面等離子體共振生物傳感器來研究各種生物反應(yīng)。早期的研究主要集中在抗原和抗體之間的相互作用、鏈霉素生物素反應(yīng)和一些免疫球蛋白的檢測，特別是在生物特異性分子相互作用分析中去表征[16]。目前的研究主要包括通過銀鏡反應(yīng)和功能化層來提高生物傳感器的靈敏度[17-18]。其中的一個新應(yīng)用是檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與DNA 之間的相互作用，甚至還可以檢測固定化蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[19]。Sina 等[20]開發(fā)了一種使用表面等離子體共振生物傳感器實時和無標記檢測臨床相關(guān)外泌體的簡單方法，該方法在檢測乳腺癌細胞來源的外泌體方面顯示出高特異性，原理如圖3 所示。也有研究者將其用于檢測大腸桿菌腺瘤中的腫瘤抑制蛋白的生化屬性、人的糖蛋白與單克隆抗體的結(jié)合動力學以及核糖核酸聚合酶Ⅱ的研究[21]。Anand 等[22]提出了一種基于等離子體電荷的雙門控隧道場效應(yīng)晶體管的生物傳感器，用于標記生物分子。生物分子被固定在腔區(qū)以誘導漏電流，腔長范圍為25～30 nm，同時采用不同的介電常數(shù)。隨著腔長的增大，漏電流略有減少。Kim 等[23]研制了一種無標記、超高靈敏度和選擇性的識別多重microRNA的表面等離子體共振生物傳感器，利用表面增強拉曼散射檢測以頭部聚集的金納米顆粒為底物的癌相關(guān)的microRNA，實現(xiàn)了對檢測限極低的microRNA的高選擇性靶向，且無需任何化學或酶反應(yīng)，支持血液中無細胞microRNA 的檢測，從而可用于癌癥的早期診斷和頑固性疾病的預(yù)防[24]。

圖3 采用表面等離子體共振生物傳感器檢測腫瘤細胞來源的外泌體的原理圖[20]

2.3 優(yōu)缺點

表面等離子體共振生物傳感器具有以下優(yōu)點：可通過定制通用型生物傳感器來檢測任何分析物，并提供生物分子識別元件[25]；生物分子識別元件和分析物之間的無標記結(jié)合可以被直接觀察到，無需使用放射性或熒光標記，故分析物不需要表現(xiàn)出任何特殊的性質(zhì)，如熒光、特征吸收和散射帶[26]；具有很高的靈活性并能快速響應(yīng)，可以連續(xù)監(jiān)測以及一次性分析[27]。

然而，表面等離子體共振生物傳感器也存在固有的局限性——檢測特異性依賴于生物分子識別能力和捕獲分析物的能力。生物分子識別元件對結(jié)構(gòu)相似但非目標分子可能會表現(xiàn)出交叉敏感性，如果樣品中存在高濃度的非目標分子，由非目標分子引起的傳感器響應(yīng)可能會掩蓋低濃度目標分析物產(chǎn)生的特定響應(yīng)[6]。

3 聲波生物傳感器

3.1 傳感機理

聲波傳感器的探測機理是聲波通過或在材料表面?zhèn)鞑r，傳播路徑特性的變化會影響聲波的速度或振幅，然后通過測量頻率或相位特性來監(jiān)測速度的變化，根據(jù)測量到的相關(guān)物理量進行分析[28]。

3.2 應(yīng)用

基于聲波的傳導過程，聲波生物傳感器可以分為表面聲波生物傳感器、體聲波生物傳感器、聲板波生物傳感器等。

表面聲波生物傳感器作為微機電系統(tǒng)（microelectro-mechanical system，MEMS）的一種，近年來得到了廣泛的應(yīng)用[29]。該傳感器是將輸入的電信號轉(zhuǎn)換成機械波，通過輸入和輸出電信號（振幅、相位、頻率或時間延遲）之間的差異來檢測所需物理現(xiàn)象的存在。聲波裝置由壓電基板、位于基板表面一側(cè)的輸入換能器和位于基板另一側(cè)的輸出換能器組成。作為一種靈敏、有效的無標記檢測分子相互作用的生物傳感器，表面聲波生物傳感器可以將抗體或受體固定在傳感層上，利用傳感器表面的水凝膠層與分析物相結(jié)合，其主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)、DNA、細胞和細菌等檢測[30]，原理如圖 4 所示。Choi 等[31]研制的表面聲波生物傳感器利用3 次行程回波，而不是傳統(tǒng)的主波來檢測心肌肌鈣蛋白Ⅰ，提高了檢測靈敏度。Romanszki 等[32]提出了一種基于酪蛋白探針的超高頻表面聲波生物傳感器，能夠快速測定皮摩爾范圍內(nèi)的纖溶酶。

圖4 一種用于定量檢測大腸桿菌的無標記型表面聲波生物傳感器的檢測原理[30]

近年來發(fā)展起來的另一種新型表面聲波生物傳感器是Love 波生物傳感器，該傳感器被認為是生物醫(yī)學領(lǐng)域最有前途的探測方法之一，已被應(yīng)用于檢測附著在設(shè)備表面細胞的機械生物學行為。Love 波在壓電材料表面附近傳播，波速和振幅取決于表面附近介質(zhì)的變化[33]。

此外，有研究者采用磁控濺射方法制備了一種體聲波諧振薄膜，并將其作為生物傳感器用于癌坯抗原的檢測，工作頻率可接近2.0 GHz[34]。聲板波生物傳感器分為水平剪切型和分層型，在液體介質(zhì)中對生物相關(guān)分子的檢測顯示出較高的靈敏度，主要用于病原體檢測[35]。

3.3 優(yōu)缺點

聲波生物傳感器已經(jīng)發(fā)展成為一種無標記、高靈敏度、低成本的實時生物分子檢測技術(shù)。但并不是所有的聲波裝置都適合于在液體中操作，這是因為在一些情況下聲波會與液體中的壓縮波耦合，從而造成傳感器信號嚴重衰減。

4 電化學生物傳感器

4.1 傳感機理

電化學生物傳感器在強大的分析方法和生物特異性識別過程之間架起了一座橋梁[36]。無標記型電化學生物傳感器的傳感機理是將電化學活性材料直接修飾在電極表面，直接測定抗原-抗體特異性結(jié)合時產(chǎn)生的信號變化[37]。

4.2 應(yīng)用

目前有研究者開發(fā)了一種基于單鏈DNA（single-strandedDNA，ssDNA）適配體的無標記型電化學生物傳感器，可以對甲型H1N1 流感病毒進行亞型分析，得到適配體V46 的解離常數(shù)KD值為19.2 nmol/L，該傳感器成本低，且易于實現(xiàn)，速度更快[38]，其傳感機理如圖 5 所示。Ni 等[39]提出的基于 DNA 酶的 Y 型無標記型電化學生物傳感器采用電加熱銦錫氧化物電極進行原位溫度控制，可以用于Pb2+的檢測。該傳感器加熱速度快、操作方便，加熱時不干擾背景信號，省去了電化學發(fā)光（electro-chemiluminescence，ECL）指示劑標記的步驟。電加熱電極為ECL 指示劑在高溫下提供了潛在的信號放大通路，可以進一步提高生物傳感器的性能，將這種生物傳感器應(yīng)用于土壤樣品中Pb2+的分析，結(jié)果同樣令人滿意。此外，一種腫瘤標志物——聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase-1，PARP-1）近年來受到了廣泛關(guān)注，但由于其缺乏光學和電化學特性，目前對其活性檢測的研究還很少。因此，Wang 等[2]開發(fā)了一種基于共軛聚合物 PFP[poly[9，9-bis（6′-N，N，Ntrimethylammonium）hexyl]fluorenylene phenylene]的光電化學生物傳感器，可以實現(xiàn)腫瘤標志物PARP-1 活性的高靈敏度檢測。在活化的雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）作用下，PARP-1 被激活，隨后在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）存在的條件下，光誘導產(chǎn)生與PARP-1 活性有關(guān)的高光電流。該生物傳感器具有0.01～2 U 的寬線性范圍，檢測極限為0.007 U，已應(yīng)用于乳腺瘤和卵巢瘤細胞中PARP-1 的檢測。

圖5 基于單鏈DNA 適配體的無標記型電化學生物傳感器的傳感機理[33]

4.3 優(yōu)缺點

電化學生物傳感器具有魯棒性強、靈敏度高、檢測限低、分析物體積小等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于生物分析領(lǐng)域。其主要存在的問題是長期的穩(wěn)定性和可靠性與液體電解質(zhì)的加入[40]，以及壽命問題；另外，表面電活性雜質(zhì)與樣品之間發(fā)生的非特異性反應(yīng)也限制了此類傳感器的靈敏度[41]。

5 其他類型的無標記型生物傳感器

從某種意義上說，生物傳感器的發(fā)展追求的是高靈敏度、良好的生物相容性、穩(wěn)定性、多功能、小型化和集成化[42-43]。有研究者研究了一種基于氧化玻碳電極修飾金納米粒子（AuNPs）的新型阻抗式DNA生物傳感器，AuNPs 的高表面積和高導電性使得DNA 探針的負載量增加，電化學響應(yīng)得到了顯著改善。該生物傳感器簡單易行，能夠有效檢測人血清樣品中的塞卡病毒ssDNA。通過電化學阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）測定，該傳感器的檢測限為0.82 pmol/L，并在90 d 內(nèi)表現(xiàn)出穩(wěn)定性[44]。Zhang 等[45]基于重組聚合酶擴增、雙特異性酶裂解、末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶延展、G-四重鏈輸出原理，構(gòu)建了一個用于快速檢測腸道沙門氏菌的無標記級聯(lián)放大可視化生物傳感器，最低檢測極限為6 cfu/mL，且操作簡單，檢測時間少于1.5 h。

隨著新型復(fù)合材料的應(yīng)用，由金納米顆粒摻雜聚合物基體組成的納米復(fù)合材料，尤其是碳納米管和石墨烯在內(nèi)的碳納米結(jié)構(gòu)、獨立納米顆粒聚合物薄膜、納米線-聚合物膜，由于其優(yōu)異的導電性能在生物傳感器領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[46]，如圖6 所示。Lee 等[47]研制了一種硅納米線場效應(yīng)晶體管傳感器，基于免疫傳感器進行無標記檢測γ-氨基丁酸分子，通過電子束光刻法制備Z 字型硅納米線，通過半導體分析儀驗證P 型場效應(yīng)晶體管的電性能。通過熒光信號測定，確定了γ-氨基丁酸分子抗體的最佳固定化條件，可以用于植入式生物傳感器來檢測大腦中的神經(jīng)遞質(zhì)。另外，Chiang 等[48]提出一種高靈敏度電化學傳感器，具有電沉積金納米粒子，合成AuNPS 的尺寸取決于四氯合金酸HAuCl4的濃度，對生物傳感器的性能至關(guān)重要。同時，采用電位法系統(tǒng)研究了不同大小的蛋白質(zhì)在電沉積AuNPS表面的吸附。

圖6 納米材料在無標記生物傳感器中的應(yīng)用[46]

此外，隨著材料和生物技術(shù)的發(fā)展，還有更多類型的無標記型生物傳感器，如基于生物光子技術(shù)的生物傳感器[49-50]、基于光波導的生物傳感器[51]、基于光環(huán)諧振器的生物傳感器[52]、基于干涉儀的生物傳感器[53]、基于多孔材料的生物傳感器[54]等都相繼得到了研發(fā)。

6 結(jié)語

無標記檢測是對傳統(tǒng)的標記檢測方法的一種替代和補充。表1 列舉了各種無標記型生物傳感器的檢測性能對比。與標記檢測相比，無標記檢測的靈敏度高、檢測限低、分析質(zhì)量高、操作簡單、成本低，更適用于未標記的目標分子或不易標記的分析物篩選。

表1 各種無標記型生物傳感器的檢測性能對比

無標記型生物傳感器具有快速響應(yīng)、高靈敏度和穩(wěn)定性等特點，在生物檢測領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，包括細菌學、病毒學、分子生物學、細胞生物學，信號傳導、免疫調(diào)節(jié)和酶機制。但此類生物傳感器仍然面臨不少挑戰(zhàn)：（1）磁彈性生物傳感器需在磁致伸縮材料方面進一步開發(fā)和研究；（2）表面等離子體共振生物傳感器的檢測特異性依賴于生物分子識別能力和捕獲分析物的能力；（3）聲波生物傳感器在一些情況下不適用于在液體中操作；（4）電化學生物傳感器的穩(wěn)定性和可靠性有待提高，表面電活性雜質(zhì)與樣品之間發(fā)生的非特異性反應(yīng)對靈敏度有影響。未來，應(yīng)圍繞各種無標記型生物傳感器不同的傳感結(jié)構(gòu)對檢測靈敏度和檢測極限的影響開展進一步研究，提高制備技術(shù)工藝水平，使得生物傳感器向微型化、低成本、高通量和多元化等方向發(fā)展。