正交試驗(yàn)法優(yōu)選一種抗病毒方藥中多糖類物質(zhì)的最佳提取工藝

劉富菁　王思琪　陶然　王婭玲　于慧心　王集會(huì)

摘????? 要：為了優(yōu)化抗病毒方藥中多糖類物質(zhì)的最佳提取工藝條件，提高多糖得率，采用L₂₇（3¹³） 正交試驗(yàn)法，考察超聲溫度（A）、提取時(shí)間（B）和料液比（C）3個(gè)因素對(duì)方藥中多糖類物質(zhì)提取率的影響，同時(shí)考察其中存在的交互作用（A×B、A×C和B×C），并最終獲得最佳的提取工藝條件組合。結(jié)果顯示：最佳工藝條件組合為A₃B₂C₃，即超聲溫度為70 ℃、提取時(shí)間為30 min、料液比為1∶30。在最佳工藝條件組合下，測(cè)得方藥中多糖的提取率為40.48%，并且該最佳工藝穩(wěn)定可靠。

關(guān)? 鍵? 詞：抗病毒方藥;多糖提取;正交試驗(yàn);交互作用

中圖分類號(hào)：R284.2? ????????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?????? 文章編號(hào)： 1671-0460（2020）06-1099-04

Optimum of Extraction Processof Polysaccharides From the Antiviral Prescription by Orthogonal Test

LIU Fu-jing¹， WANG Si-qi¹， TAO-Ran¹， WANG Ya-ling¹， YU Hui-xin¹， WANG Ji-hui²*

（1. College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China;

2. ExperimentalCenter， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract： In order to optimize the extraction process of polysaccharide from the antiviral prescription to improve the yield， the effect of three factors including temperature（A）， extraction time（B）， solid-liquid ratio（C） on the yield of polysaccharides was investigated by L₂₇（3¹³） orthogonal experiment， and the possible interactions of A×B， A×C and B×C were investigated. Finally， the optimal optimum extraction conditionswere determined. The results showed that， the optimum extraction conditionswasA₃B₂C₃， that was， the temperature 70 ℃， the extraction time 30 min， and the solid-liquid ratio 1∶30. Under the optimal extraction conditions， the yield of polysaccharides was 40.48%， and the optimal process was stable and reliable.

Key words： Antiviral prescription; Extraction of polysaccharides; Orthogonal test; Interaction effect

人類歷史上曾記載著許多近乎災(zāi)難的大型疫情，如新冠肺炎、非典、艾滋病等，這些“殺人于無(wú)形”的疾病的始作俑者便是病毒，一種肉眼無(wú)法看到的最小生物病原體，而越來(lái)越多變異病原體的產(chǎn)生，使病毒性疾病治愈的難度隨之增加^[1]。面對(duì)巨大的生命健康威脅，人們?cè)诳共《痉矫娴耐度胍苍絹?lái)越大，而中藥也因其悠久的應(yīng)用歷史和諸多疫情防治的成功歷史，為廣大研究者提供了豐富的經(jīng)驗(yàn)參考和有力的信念支持^[2]。

盡管中藥^[3]在抗病毒方面并沒(méi)有西藥^[4]那么強(qiáng)的針對(duì)性，但中醫(yī)強(qiáng)調(diào)的天人合一的整體觀念、辨證論治的理法方藥和中藥多組分多靶點(diǎn)的藥理特點(diǎn)，使其在治療各種疑難雜癥中具備了得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，也因此奠定了其不可替代的防治價(jià)值^[5]。

多糖是一種能參與許多生命過(guò)程的生物大分子，其結(jié)構(gòu)的多樣性決定了其生理功能的多樣性和生物活性的差異性。據(jù)研究多糖類物質(zhì)主要通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能來(lái)達(dá)到抗菌、抗病毒和抗癌的效果。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外與多糖相關(guān)的研究進(jìn)度神速，而對(duì)多糖提取分離的工藝研究是研究多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)的重要基礎(chǔ)^[6]。

本次試驗(yàn)旨在對(duì)所選抗病毒方藥中多糖類物質(zhì)的最佳提取工藝條件進(jìn)行研究，確定最佳的提取時(shí)間、超聲溫度、料液比等，為該方藥的進(jìn)一步研究提供一定的參考。

1? 試驗(yàn)材料

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV9100B型，北京萊伯泰科儀器有限公司等試驗(yàn)器材。

苯酚，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20150108;白術(shù)、白頭翁、蠐螬、美洲大蠊、當(dāng)歸、川芎，在河北安國(guó)中藥材市場(chǎng)所購(gòu)買(mǎi)，粉碎成粗粉后，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2? 試驗(yàn)方法

2.1? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲取

精密稱取干燥恒重的葡萄糖20.00 mg，加水溶解并定容至100 mL，分別精密移取0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL于10 mL規(guī)格的干燥潔凈的容量瓶中，混勻并定容;再分別精密的移取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL，放置于干凈干燥試管中，進(jìn)而移取1.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液^[7]，略微振搖，將5.00 mL的濃硫酸加入其中，快速混勻后在室溫下安靜放置20 min，而后放在40 ℃水浴鍋中保持溫度10 min，使其充分反應(yīng)，并在490 nm處測(cè)量其吸光度^[8]。把葡萄糖的質(zhì)量濃度x作為曲線的橫坐標(biāo)軸，吸光度y作為曲線的縱坐標(biāo)軸，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制^[9]。

2.2? 抗病毒方藥中多糖類物質(zhì)的提取

2.2.1? 超聲提取方法

精密稱取抗病毒方藥粉末1.000 g，放置于干燥潔凈的三角燒瓶中，加入固定量的蒸餾水，在固定的時(shí)間、料液比和溫度下進(jìn)行超聲提取，取出并抽濾，濾液定容待用^[10]。

2.2.2? 多糖類物質(zhì)的含量測(cè)定

用移液槍精密移取上述濾液0.05 mL，加入到干燥潔凈的10 mL容量瓶中，加水混合均勻，定容至刻度，待用。精密移取上述溶液1.00 mL于具刻試管中，采用2.1.2相同方法測(cè)量其吸光值A，并計(jì)算出質(zhì)量濃度ρ，進(jìn)行下式計(jì)算。

多糖類物質(zhì)的提取率=[p×7×10×（v÷0.05）]/1000×m= ×100%^[11]。

2.3? 單因素分析試驗(yàn)

保持其他條件不改變， 分別考察超聲時(shí)溫度（40、50、60、70、80 ℃）、物料液體比值（1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、提取持續(xù)時(shí)間（10、20、30、40、50 min）^[12-13]3個(gè)因素對(duì)多糖類物質(zhì)得率的影響。方法同2.2.1和2.2.2。3次平行試驗(yàn)，取平均值進(jìn)行分析，最終確定正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中各因素的水平數(shù)值。

2.4? 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于2.3中試驗(yàn)的結(jié)果， 進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選定上述3個(gè)因素的3個(gè)水平進(jìn)行L₂₇（3¹³）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)中的各個(gè)因素以及各個(gè)水平見(jiàn)表1，同時(shí)關(guān)注各因素之間可能存在的交互作用（A×B、A×C、B×C），觀察多糖提取率的數(shù)值變化，得出最優(yōu)工藝條件的組合，并采用SPASS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析^[11]。

3? 結(jié)果及分析

3.1? 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

經(jīng)實(shí)驗(yàn)所得曲線見(jiàn)圖1。

回歸方程y=54.836x+0.000 2，相關(guān)系數(shù)R²=0.999 4。

3.2 ?? ?超聲溫度對(duì)方藥中多糖類物質(zhì)提取率的影響

試驗(yàn)方法采用2.2.1、2.2.2方法，物料液體比值定為1∶40、超聲持續(xù)20 min下，考察不同超聲溫度的影響作用。分析圖2可知，超聲溫度對(duì)方藥中多糖類物質(zhì)的得率影響很明顯，超聲溫度不斷變高，多糖提取率迅速增加，50 ℃以后多糖提取率增幅略變大，當(dāng)超聲溫度升至60 ℃，多糖提取率到達(dá)最高值附近，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，所以試驗(yàn)暫定60 ℃為最佳超聲溫度。

3.3? 料液比對(duì)方藥中多糖類物質(zhì)提取率的影響

按2.2.1、2.2.2方法，在50 ℃的溫度下進(jìn)行超聲10 min的處理，考察不同料液比的影響作用，結(jié)果見(jiàn)圖3。

通過(guò)圖3可以看出，料液比對(duì)抗病毒方藥中多糖提取率的影響是比較明顯的，隨著加入的提取溶劑的增大，多糖得率有逐漸上升趨勢(shì)，當(dāng)料液比升至1∶20時(shí)，多糖提取率到達(dá)最高值附近，之后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，所以試驗(yàn)暫定1∶20為最佳料液比。

3.4? 提取時(shí)間對(duì)方藥中多糖類物質(zhì)提取率的影響

按2.2.1、2.2.2方法，在50 ℃的溫度下進(jìn)行超聲處理、且物料液體比值為1∶40，考察不同超聲時(shí)間的影響作用。分析圖4得，提取時(shí)間對(duì)多糖類物質(zhì)的得率影響較明顯，超聲時(shí)間加長(zhǎng)，多糖提取率有所提高，時(shí)間達(dá)到30 min對(duì)應(yīng)多糖提取率到達(dá)最高值附近，隨后緩慢變小，最終試驗(yàn)暫定30 min為最佳提取時(shí)間。

3.5? 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

3.5.1? 正交試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

3.5.2? 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表3。

由方差分析表3可知，A、B、A×B和A×C對(duì)多糖類物質(zhì)提取率的影響極顯著，而C和B×C對(duì)指標(biāo)的影響具有顯著性差異。極差由大到小依次為A、B、A×C、A×B、C、B×C^[14]。A、B、C及它們之間的一級(jí)交互作用均對(duì)該抗病毒方藥中多糖類物質(zhì)的提取率有極顯著或顯著性影響，最佳提取工藝組合為A₃B₂C₃。為進(jìn)一步證明上述最佳水提工藝是持續(xù)穩(wěn)定和可靠的，在上述條件下進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)3次，得多糖類物質(zhì)的提取率達(dá)40.48%（R_SD= 1.34%），表明此最佳提取工藝穩(wěn)定性及可靠性良好^[14]。