全蝎中多糖提取分離及其藥理作用研究

宋興爽　李佳懌　王婭玲　鄒婧　陶然　張珊珊　王集會(huì)

摘????? 要：在已有的全蝎酶解產(chǎn)物研究基礎(chǔ)上，分離全蝎中的蛋白，提純多糖，并研究全蝎中除去蛋白與未除蛋白多糖的抗炎作用。方法：用胰蛋白酶制備全蝎酶解液，乙醇沉出粗多糖，制備低純多糖，Sevag法除去多糖中的蛋白質(zhì)，測(cè)定全蝎中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)并進(jìn)行抗炎研究。結(jié)論：未除蛋白組的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為42.12%，除去蛋白的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為87.27%，全蝎中多糖可抑制RAW264.7炎癥反應(yīng)，多糖蛋白對(duì)細(xì)胞炎癥抑制作用不明顯，除去蛋白后全蝎多糖對(duì)IL-6炎癥因子的抑制效果不顯著，對(duì)TNF-α炎癥因子抑制效果顯著，隨藥液濃度不斷增大，抑制效果先上升后下降，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.5 mg·mL^-1時(shí)，藥液中TNF-α炎癥因子質(zhì)量濃度最低，說明該質(zhì)量濃度下全蝎多糖的抗炎效果最為顯著，減少了炎癥因子的分泌，具有重要研究?jī)r(jià)值和市場(chǎng)前景。

關(guān)? 鍵? 詞：全蝎;多糖;除蛋白;抗炎

中圖分類號(hào)：TQ 028??????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?????? 文章編號(hào)： 1671-0460（2020）06-1023-04

Extraction and Separation of Polysaccharides from Scorpio and Their Pharmacological Effects

SONG Xing-shuang， LI Jia-yi， WANG Ya-ling， ZOU Jing， TAO Ran， ZHANG Shan-shan， WANG Ji-hui

（Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract： On the basis of existing research on scorpion enzymatic hydrolysate， protein in Scorpio was separated， polysaccharide was purified， and anti-inflammatory effects of protein removed and non-protein removed polysaccharide in Scorpio were studied. Methods： Scorpio enzymolysis liquid was prepared by trypsin， crude polysaccharide was precipitated by ethanol， low pure polysaccharide was prepared， protein in polysaccharide was removed by sevag method， content of polysaccharide in Scorpio was determined and anti-inflammatory study was carried out. Conclusion： The polysaccharide content of the non-deproteinized group is 42.12%， the polysaccharide content of deproteinized group is 87.27%， the polysaccharide in Scorpio can inhibit RAW264.7 inflammatory reaction， the inhibitory effect of polysaccharide protein on cellular inflammation is not obvious， the inhibitory effect of Scorpio polysaccharide on IL-6 inflammatory factor after deproteinization is not significant， the inhibitory effect on TNF-α inflammatory factor is significant， with the increasing concentration of liquid medicine， the inhibitory effect first rises and then falls. When the concentration is 1.5 mg mL-1， the concentration of TNF-α inflammatory factor in the liquid medicine is the lowest， which indicates that Scorpio polysaccharide has the most significant anti-inflammatory effect at this concentration， reduces the secretion of inflammatory factor， and has important research value and market prospect.

Key words： Whole scorpion; glycoamine polysaccharides; deproteination; Anti-inflammatory

中藥全蝎始載于《蜀本草》，味辛，性平，有毒，為祛風(fēng)攻毒常用藥，可用于治療痙攣抽搐、風(fēng)濕、癲癇等疾病^[1]，具有很好的治療效果。多糖主要存在于動(dòng)物類藥物中，由氨基糖和糖醛酸組成^[2]，在免疫調(diào)節(jié)、腫瘤治療、炎癥反應(yīng)等方面具有一定的治療作用^[3]。

在生物體中，多糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合狀態(tài)易被水解破壞，因此本實(shí)驗(yàn)采用sevag法和水提醇沉法除去糖蛋白中的蛋白質(zhì)，測(cè)定全蝎中多糖的含量并進(jìn)行體外抗炎實(shí)驗(yàn)。

在進(jìn)行Sevag法、水提醇沉法之前都將對(duì)藥物進(jìn)行酶解。Sevag法對(duì)有機(jī)試劑用量大，但其適用范圍廣，可用于多種多糖提取時(shí)的蛋白分離。

1 ?材料

1.1? 樣品

全蝎凍干粉（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2? 試劑

胰蛋白酶、氯仿、苯酚、無(wú)水乙醇等所用試劑均為分析純，水為蒸餾水或同等純度的水，細(xì)胞炎癥試劑盒（晶美生物工程有限公司）。

1.3? 儀器

HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋;KQ-500E 型超聲波清洗器;SHB-III循環(huán)水式真空泵;ST 16R 高速冷凍離心機(jī);FA 1004N 電子天平;UV9100B型紫外可見分光光度計(jì)。

2? 步驟

2.1? 全蝎多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取0.1 g恒重?zé)o水葡萄糖，溶解定容為

1 mg·mL^-1，配制不同質(zhì)量濃度溶液，各加入1 mL 5%的苯酚^[4]，混勻，加入5 mL濃硫酸^[5]，搖勻過程中小心濺出燙傷，放入90 ℃的水浴鍋中靜置20 min，放冷，測(cè)定待測(cè)溶液中490 nm波長(zhǎng)下^[6]多糖的吸光度。

2.2? 制備全蝎酶解液

通過前期查閱文獻(xiàn)已經(jīng)確定制備全蝎酶解液的最佳工藝流程：料液比為1∶40 g·mL^-1[7]，酶解溫度40 ℃，酶解時(shí)間3 h，最適pH=8.5，胰蛋白酶為??? 2 000 u，離心抽濾，冷藏保存。

2.3? 醇沉提取多糖蛋白

在酶解液中加入無(wú)水乙醇調(diào)至溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%^[8]，以3 000 r·min^-1離心10 min，可分離出多糖蛋白，取上清液重復(fù)上述步驟，直至沒有沉淀析出為止^[9]，分離沉淀，凍干，得到全蝎多糖蛋白。

2.4? Sevag法除蛋白提取多糖

料液比1∶40 g·mL^-1，40 ℃下進(jìn)行超聲20 min，加入胰蛋白酶酶解。調(diào)pH為7.5，40 ℃下恒溫酶解3 h，酶解后置于100 ℃水浴鍋內(nèi)10 min煮沸滅酶，離心去除雜質(zhì)。移液槍移取40 mL氯仿加入10 mL正丁醇中制得 Sevag試劑^[10]。取5 mL粗提液置于試管中，加入1 mL Sevag試劑，振搖30 min，靜置12 h后離心，旋蒸濃縮，加入適量80%無(wú)水乙醇，沉淀12 h，離心10 min，將沉淀分離凍干，計(jì)算全蝎中除去蛋白后多糖得率。

2.5? 抗炎實(shí)驗(yàn)

2.5.1 ?細(xì)胞培養(yǎng)

取出冰凍保存的RAW264.7細(xì)胞，加入DMEM高糖培養(yǎng)基，細(xì)胞長(zhǎng)滿板底后進(jìn)行消化換液，收集細(xì)胞懸液，放入5% CO₂培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)^[11]，放入離心機(jī)中以1 000 r·min^-1離心3 min后，傾出上清液，重復(fù)上述步驟，進(jìn)行傳代培養(yǎng)^[12]。

2.5.2 ?細(xì)胞因子含量測(cè)定

將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿后，吸出培養(yǎng)液，加入2 μg·mL^-1 LPS 500 μL，用移液槍分別取500 μL的質(zhì)量濃度為4.0、3.0、2.0、1.0、0.5 mg·mL^-1的全蝎多糖蛋白液與全蝎多糖液，每組設(shè)置一個(gè)LPS組與空白組，24 h后，收集上清液^[13]，進(jìn)行炎癥因子TNF-α和IL-6的質(zhì)量濃度測(cè)定^[14]。

2.5.3 ?數(shù)據(jù)分析

采用spss軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

3? 結(jié)果

3.1? 多糖標(biāo)曲

如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 2.045x- 0.004 8，R²=0.999 6，結(jié)果表明多糖質(zhì)量濃度不同會(huì)引起吸光度不同。

3.2? 除蛋白前后多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

如表1所示，將吸光度值代入線性方程中計(jì)算醇沉全蝎酶解液提取蛋白多糖所得糖蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為42.56、41.17、42.64 mg·g^-1，平均得率為42.12%。

如表2所示，全蝎中的蛋白質(zhì)除去后所測(cè)多糖含量為87.43、87.02、87.36 mg·g^-1，平均得率為87.27%，相比于未除蛋白以多糖蛋白形式存在時(shí)得率差異較大，全蝎提取多糖得率明顯提高。

3.3? 體外抗炎實(shí)驗(yàn)

體外抗炎實(shí)驗(yàn)中，組別編號(hào)1-7分別對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞組，炎癥誘導(dǎo)組及質(zhì)量濃度為2.00、1.50、1.11、0.50及0.25 mg·mL^-1全蝎多糖蛋白，結(jié)果表明，全蝎多糖蛋白5組不同濃度的劑量組的細(xì)胞IL-6、TNF-α炎癥因子水平均高于正常細(xì)胞組和炎癥誘導(dǎo)組^[15]，見表3，就整體而言沒有明顯作用趨勢(shì)，如圖2所示，經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，排除實(shí)驗(yàn)誤差的影響，多糖蛋白對(duì)細(xì)胞炎癥有抑制作用不明顯，可能原因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與多糖結(jié)合阻礙了全蝎多糖中有效成分發(fā)揮作用，不僅未起到抑制作用反而會(huì)誘導(dǎo)炎癥作用。

如圖3、表4所示，全蝎中除去蛋白質(zhì)后多糖的抗炎效果顯著高于未除蛋白之前。與未除蛋白質(zhì)之前相同，全蝎多糖除蛋白后5組不同質(zhì)量濃度的劑量組的IL-6炎癥因子水平均高于正常細(xì)胞組和炎癥誘導(dǎo)組。全蝎多糖對(duì)IL-6炎癥因子的抑制效果不顯著，對(duì)TNF-α炎癥因子抑制效果顯著，隨藥液質(zhì)量濃度不斷增大，抑制效果先上升后下降^[16]，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.5 mg·mL^-1時(shí)，藥液中TNF-α炎癥因子質(zhì)量濃度最低，隨著質(zhì)量濃度的降低，炎癥發(fā)生反而增強(qiáng)，說明該濃度下全蝎多糖的抗炎效果最為顯著，臨床效果最佳。

4? 結(jié)束語(yǔ)

細(xì)胞炎癥為人體常見疾病之一[17]，并能間接引發(fā)腫瘤等疾病。小鼠白細(xì)胞介素IL-6、腫瘤壞死因子等炎癥因子則為直接誘導(dǎo)因素[18]，導(dǎo)致人體調(diào)節(jié)紊亂、白細(xì)胞增多、局部組織病變等[19]。一般情況下出現(xiàn)炎癥多為人體的自我防御機(jī)制，通過炎癥反應(yīng)進(jìn)而引起人們警惕。炎癥反應(yīng)可由腫瘤壞死因子、內(nèi)毒素等影響因子引起，許多中藥在治療臨床炎癥不良反應(yīng)方面可發(fā)揮重要作用。

全蝎具有軟堅(jiān)散結(jié)、搜風(fēng)通絡(luò)、祛風(fēng)逐瘀的療效，常與蜈蚣結(jié)合成藥對(duì)使用[20]，周青[21]等通過藥理實(shí)驗(yàn)證明從全蝎蝎尾中提取的蝎毒對(duì)于肺癌、胃癌、前列腺腫瘤具有一定的抑制作用;代龍[22]通過制備全蝎酶解液發(fā)現(xiàn)全蝎具有較好的抗凝血作用;梁益[23]等以海馬作為慢性癲癇模型證明乙醇提取全蝎中的有效物質(zhì)可有效減少癲癇的發(fā)生，降低患病風(fēng)險(xiǎn)。

目前關(guān)于全蝎的研究較多，但將全蝎中多糖蛋白分離測(cè)定除蛋白后的多糖含量較少[24]，本實(shí)驗(yàn)采用胰蛋白酶制備全蝎酶解液，乙醇沉出粗多糖，制備低純多糖，Sevag法除去多糖中的蛋白質(zhì)，測(cè)定全蝎中多糖的質(zhì)量濃度并進(jìn)行抗炎研究。體外抗炎實(shí)驗(yàn)表明，若未除蛋白，全蝎多糖蛋白抑制效果整體作用趨勢(shì)不明顯;除去蛋白后，全蝎多糖對(duì)IL-6炎癥因子的抑制效果不顯著，對(duì)TNF-α炎癥因子抑制效果顯著，隨藥液質(zhì)量濃度不斷增大，抑制效果先上升后下降，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.5 mg·mL-1時(shí)，藥液中TNF-α炎癥因子質(zhì)量濃度最低，說明該質(zhì)量濃度下全蝎多糖的抗炎效果最為顯著，炎癥因子最少，結(jié)果表明全蝎具有一定的抗炎作用，可用于新藥物研發(fā)。

參考文獻(xiàn)：

[1]史磊，張?zhí)戾a，杜聰穎，等.中藥全蝎活性成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，17（4）：89-91.

[2]霍琛鑫，劉忠義，嚴(yán)開川，等.多糖結(jié)構(gòu)分析的研究進(jìn)展[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2019，40（6）：109-111.

[3]張蕊馨，張彥華，周迎春，等.中藥多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理作用研究進(jìn)展[J].黑龍江中醫(yī)藥，2018，47（1）：88-89.

[4]廖霞，王瑩，黃大川，等.微波輔助酶法提取鐵皮石斛多糖的工藝[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2020，11（1）：43-48.

[5]高亮亮，雷玉蘭.女貞子多糖的提取優(yōu)化工藝研究[J].安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，31（5）：41-45.

[6]胡春霞.渥丹多糖提取工藝研究[J].當(dāng)代化工，2010，39（1）：20-22+29.

[7]劉金虎，趙翠燕，孫志藝，等.全蝎白術(shù)白頭翁組合發(fā)酵品不同醇濃度提取物的活性成分分析及體外藥理研究[J].當(dāng)代化工，2019，48（6）：1170-1173.

[8]閆旭宇，李玲.水提醇沉法提取薏米多糖及其對(duì)羥自由基的清除作用[J].食品研究與開發(fā)，2019，40（18）：1-5.

[9]沈杰，馬恩耀，趙志敏，等.巴戟天多糖的提取、分離及生物活性研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理，2020，31（2）：246-250.

[10]顧愛宏.靈芝多糖提取工藝的改良[J].當(dāng)代化工，2012，41（11）：1271-1275.

[11]萬(wàn)昭. 強(qiáng)骨康疏方對(duì)RAW264.7細(xì)胞向OC分化的抑制作用及其機(jī)制初探[D]. 恩施：湖北民族大學(xué)，2019.

[12]沈陽(yáng)，陳思遐，馮旰珠.梔子苷對(duì)RAW264.7細(xì)胞胞飲和噬菌功能雙向調(diào)節(jié)作用的初步觀察[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，39（10）：1426-1429.

[13]劉莉園. 草蓯蓉多糖對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及其機(jī)制[D]. 延邊：延邊大學(xué)，2019.

[14]魏江存，謝臻，陳勇，等.地桃花水提物對(duì)5種常見致病菌腹腔感染小鼠血清TNF-α和IL-6含量變化研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，22（1）：29-32.

[15]潘景芝，金莎，劉雅婧，等.刺五加多糖鎮(zhèn)痛抗炎作用及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究[J].上海中醫(yī)藥雜志，2019，53（10）：74-82.

[16]王晶，符元澤，楊光忠，等.藏藥復(fù)方七味乳藤膠囊體內(nèi)外抗炎活性及工藝研究[J].湖北科技學(xué)院學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2019，33（6）：465-469.

[17]代艷文，袁丁，萬(wàn)靜枝，等.竹節(jié)參總皂苷通過NF-κB通路對(duì)LPS致RAW264.7細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用研究[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39（11）：2076-2080.

[18]張紅霞.小檗堿和人參皂苷Rb1合用對(duì)脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和炎癥信號(hào)通路的影響[D]. 南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[19]曹春琪.麥冬不同部位對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其物質(zhì)基礎(chǔ)研究[D]. 北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[20]李海燕，楊佩蘭，黃海茵，等.全蝎-蜈蚣藥對(duì)對(duì)哮喘模型大鼠氣道炎癥及氣道重塑的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，01（6）：206- 201.

[21]周青，何清湖，田雪飛，等.全蝎提取物對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞外抑制作用研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，17（8）：70-72.

[22]代龍.全蝎不同工藝提取物抗凝血及溶栓作用的研究比較[J].西北醫(yī)藥雜志，2009，24（2）：114-116.

[23]梁益，孫紅斌，喻良，等.全蝎醇提物對(duì)慢性癲癇模型大鼠海馬GFAP mRNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥房，2012，23（43）：4033-4036.

[24]張寧.朝鮮淫羊藿中性多糖結(jié)構(gòu)分析及抗氧化活性研究[D]. 長(zhǎng)春：長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，2019.