響應(yīng)面優(yōu)化火麻油及有氧運動對骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學院，河南鄭州451199）

火麻，別稱山絲苗、線麻、胡麻、漢麻等。?？疲舐閷僖荒晟绷⒉荼?，在我國種植火麻的主要地方包括廣西、云南、甘肅等省份[1]?；鹇橛偷臓I養(yǎng)成分，其中不飽和脂肪酸含量豐富，大約有89%左右，不飽和脂肪酸主要為油酸占9.6%～14.7%、亞油酸占52.2%～58.2%和亞麻酸占15.2%～23.9%[2-3]?；鹇橛椭羞€含有氨基酸、維生素E、礦物質(zhì)元素、不溶性纖維、甾體類、生物堿類、黃酮類和苷類等成分，所以營養(yǎng)價值非常豐富[4-5]。尤其火麻油含有豐富的礦物質(zhì)元素，K、Mg、Ca、Na、Fe、Mn、Cu、Zn 等人體必需的礦物質(zhì)，其中元素 K、Mg、Ca的含量特別高[6]。K是細胞內(nèi)液的主要離子，Mg對機體心臟的調(diào)節(jié)起到重要作用，Ca是骨骼、牙齒及軟組織的重要成分，缺鈣易得佝僂病、骨質(zhì)疏松癥、心血管病等[7]。

骨質(zhì)疏松癥是一種以全身骨量減少、骨密度損失及骨組織微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，骨折危險性增大的全身代謝性疾病[8]。臨床以周身疼痛、身高降低、駝背、脆性骨折及呼吸系統(tǒng)受影響等為主要表現(xiàn)[9]。因此，改善骨質(zhì)疏松主要就是減少骨量丟失，增加骨質(zhì)形成，補充骨礦物質(zhì)，提高骨密度。諸多研究表明，運動鍛煉有利于骨質(zhì)健康，增加骨代謝，使骨形成較好的結(jié)構(gòu)和強度。一旦運動不足會導(dǎo)致骨密度低下，增加患骨質(zhì)疏松癥的風險[10-11]。

當前，對于火麻油的提取主要有肇立春等[12]利用冷榨法來提取火麻油，彭丹[13]等利用微波輔助來提取火麻油，曾凡炎等[14]利用超聲波與微波輔助來提取火麻油，以上幾種方法在提取火麻油中較為普遍。本文利用響應(yīng)面優(yōu)化溶劑法提取火麻油，以便為今后的工業(yè)生產(chǎn)提供更多的技術(shù)支持。由于火麻油的微量元素含量較為豐富，并且根據(jù)其Ca含量較高的特點，而且Ca是骨骼中重要組成部分，設(shè)計一個大鼠骨質(zhì)疏松的模型，通過雌性大鼠摘除卵巢，使體內(nèi)雌激素分泌減少，雌激素在機體內(nèi)由于參與骨代謝，從而造成骨吸收增強，致使快速的骨丟失，考察火麻油對大鼠骨密度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

火麻仁：長春市方一堂經(jīng)貿(mào)有限公司；石油醚：天津科密歐試劑有限公司；大鼠骨鈣素（OC）、磷（P）、雌二醇試劑盒：南京建成生物工程研究所；SPF級雌性SD大鼠50只 [體重在（150±5）g[SYXK（蘇）2018-0008）]：江蘇集萃藥康生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KJ3000+骨密度儀：南京科進實業(yè)有限公司；RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州科文儀器設(shè)備有限公司；HZY-1202型天子天平：上海茂宏電子科技有限公司；DFT-100A型粉碎機：無錫久平儀器有限公司；BK-200型生化分析儀：山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；ZH-PT型動物實驗跑臺：安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 火麻油的制備

選取火麻仁適量，將其粉碎至粒度為可以過100目篩。將之前處理好的火麻仁粉末稱取適量，放入圓底燒瓶中，加入一定量的石油醚，調(diào)節(jié)到設(shè)置的溫度、提取時間，進行提取，提取完成后，蒸發(fā)掉溶劑，干燥稱重，得到火麻油[13，15]。

式中：Y為火麻油得率，%；m火麻油質(zhì)量，g；n火麻仁粉末質(zhì)量，g。

1.3.2 單因素試驗

在提取溫度40℃、提取時間90 min，設(shè)定不同液料比為 6 ∶1、10 ∶1、14 ∶1、18 ∶1、22 ∶1（mL/g）；在液料比為 14 ∶1（mL/g）、提取時間 90 min，設(shè)定不同提取溫度分別為 30、35、40、45、50 ℃；在液料比為 14 ∶1（mL/g）、提取溫度40℃，設(shè)定不同提取時間分別為30、60、90、120、150 min，考察火麻油得率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化火麻油提取工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過火麻油得率（Y）為指標，液料比（X1）、提取溫度（X2）和提取時間（X3）為因素，進行三因素三水平響應(yīng)面試驗設(shè)計，采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計的Box-Behnken試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平Table 1 Box-Behnken test design factor level

1.3.4 動物模型、分組以及運動方案

模型設(shè)計：大鼠使用35 mg/kg戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉后，剃掉其毛發(fā)，在大鼠的脊柱兩側(cè)切開背肌大約1.5 cm切口，摘除卵巢。使用可以吸收的羊腸線縫合大鼠傷口，術(shù)后腹腔注射60×104U/kg青霉素鈉，1次/d，持續(xù)注射5 d，以防術(shù)后感染。大鼠全部存活并沒有出現(xiàn)感染癥狀[16]。

選取SPF級雌性SD大鼠50只，體重在（150±5）g，隨機分成5組，每個小組10只大鼠，分成對照組、模型組、運動組、火麻油組、火麻油運動組。其中對照組不進行手術(shù)，其余組以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，摘除雙側(cè)卵巢。除了對照組、模型組、火麻油組，其余2組SD大鼠放置在動物跑臺上進行跑步訓(xùn)練，第一周對大鼠進行跑步適應(yīng)訓(xùn)練，將跑臺參數(shù)設(shè)置成0度、10 m/min、45 min，使大鼠跑步訓(xùn)練保持45 min；第二周開始將跑臺參數(shù)設(shè)置成7度、25 m/min，直至大鼠力竭。大鼠力竭的標準為，使用毛刷刺激大鼠尾部，大鼠在跑步過程中與跑臺預(yù)設(shè)速度出現(xiàn)不一致情況，其臀部壓在跑臺上，而且后肢與跑臺皮帶后拖達到20 s以上?；鹇橛徒M對其進行灌胃0.8 mg/g的火麻油；火麻油運動組在按照運動組進行跑步運動之外，每天對大鼠灌胃0.8 mg/g的火麻油，并觀察每天大鼠的變化，實驗持續(xù)6周[17-18]。

1.3.5 相關(guān)指標檢測

大鼠骨鈣素（OC）、磷（P）、雌二醇含量測定：各組大鼠麻醉后腹主動脈取血，分離血清，-25℃保存，根據(jù)酶學試劑盒的說明書檢測分析；骨密度測定：采用骨密度儀對大鼠腰椎骨進行檢查。

1.4 統(tǒng)計學分析

本文使用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均使用均值±標準差來表示，采取組間進行對比，P＜0.05、P＜0.01表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對火麻油得率的影響

液料比對火麻油得率的影響見圖1。

圖1 液料比對火麻油得率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the yield of hemp oil

由圖1分析，液料比的增加，使得火麻油的得率逐漸升高，在14∶1（mL/g）時得率達到最高，繼續(xù)增加液料比提取趨于不變。這是因為液料比的增加，使得火麻仁與提取溶劑之間接觸更加充分，提取逐漸提高。繼續(xù)增加液料比，火麻油得率反而趨于平衡，考慮到溶劑回收時間和成本的問題，因此液料比選擇14 ∶1（mL/g）。

2.1.2 提取溫度對火麻油得率的影響

提取溫度對火麻油得率的影響見圖2。

由圖2分析，提取溫度的增加，使得火麻油的得率逐漸升高，當溫度達到45℃時得率達到最高，繼續(xù)升高溫度，火麻油得率出現(xiàn)降低。因為溫度過高會導(dǎo)致火麻油中其他活性成分在溶劑中的濃度隨之提高，從而與火麻油形成競爭，導(dǎo)致得率降低，另外溫度過高會導(dǎo)致火麻油營養(yǎng)成分被破壞，降低了原有的生物活性。

圖2 提取溫度對火麻油得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of hemp oil

2.1.3 提取時間對火麻油得率的影響

提取時間對火麻油得率的影響見圖3。

圖3 提取時間對火麻油得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of hemp oil

由圖3分析，提取時間為90 min時，火麻油得率達到最高，時間繼續(xù)延長得率反而有所降低。這是由于90 min時，火麻油提取接近完全，從得率和節(jié)省時間等方面來分析，再繼續(xù)延長提取時間得率反而稍有降低，因此，選擇提取時間為90 min。

2.2 響應(yīng)面法試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定各因素最佳水平值范圍，采用響應(yīng)面法試驗設(shè)計，以火麻油得率（Y）為指標，液料比（X1）、提取溫度（X2）和提取時間（X3）為因素，進行三因素三水平響應(yīng)面試驗，設(shè)計Box-Benhnken試驗中心組合試驗。響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken test design and results

續(xù)表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Continue table 2 Box-Behnken test design and results

響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果Table 3 Response surface regression model ANOVA analysis results

響應(yīng)面分析方案與結(jié)果如表2，采用Design-Expert 8.0軟件對表3試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到多元回歸方程：

Y=-82.18+3.37X1+1.44X2+1.91X3-0.70X1X2+0.26X1X3-0.25X2X3-3.88X12-3.99X22-2.14X32

由表3的ANVOA分析可知：模型P=0.000 1＜0.01極顯著，失擬項P=0.505 5＞0.05不顯著，說明方程對該試驗具有較好的擬合性，試驗誤差較小。相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，調(diào)整系數(shù)Adj.R2=0.998 3也表明上述模型擬合程度較好。該模型可用于提取火麻油。

對火麻油得率影響順序依次為：液料比（X1）＞提取時間（X3）＞ 提取溫度（X2）。并且液料比（X1）、提取溫度（X2）和提取時間（X3）影響都達到了極顯著水平（P＜0.01）；X1X2達到極顯著水平（P＜0.01）、X1X3達到顯著水平（P＜0.05）、X2X3達到顯著水平（P＜0.05）；液料比（X1）、提取溫度（X2）和提取時間（X3）各因素的二次項對得率影響極顯著（P＜0.01）。

2.3 響應(yīng)面法分析最佳工藝方案

液料比與提取溫度對得率的影響見圖4。

圖4 液料比與提取溫度對得率的響應(yīng)面分析Fig.4 Response surface analysis of the ratio of liquid to material and extraction temperature to the yield

液料比與提取時間對得率的影響見圖5。

圖5 液料比與提取時間對得率的響應(yīng)面分析Fig.5 Response surface analysis of liquid-to-material ratio and extraction time to yield

提取溫度與提取時間對得率的影響見圖6。

圖6 提取溫度與提取時間對得率的響應(yīng)面分析Fig.6 Response surface analysis of extraction temperature and time to yield

通過上述分析得火麻油最佳提取條件為：當液料比為16∶1（mL/g）、提取溫度為46℃、提取時間為104 min時，火麻油的得率為83.45%。選取上述組合做3次驗證試驗，得出火麻油的平均得率為83.39%。與預(yù)測值相近，證明該工藝可以用來提取火麻油。

2.4 火麻油結(jié)合運動對骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響

火麻油結(jié)合運動對骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響見表4。

表4 火麻油結(jié)合運動對骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響Table 4 Effects of hemp oil combined with exercise on bone mineral density in osteoporotic rats

從表4得出，模型組大鼠骨鈣素（OC）與對照組相比明顯提高（P＜0.05），運動組、火麻油組、火麻油運動組大鼠骨鈣素（OC）與模型組相比明顯降低（P＜0.05），火麻油運動組大鼠骨鈣素（OC）與對照組相比不具有顯著性差異（P＞0.05）；模型組大鼠磷（P）與對照組相比明顯降低（P＜0.05），火麻油運動組磷（P）與模型組相比明顯提高（P＜0.05），火麻油運動組磷（P）與對照組相比不具有顯著性差異（P＞0.05）；模型組大鼠雌二醇與對照組相比明顯降低（P＜0.05），運動組、火麻油組、火麻油運動組雌二醇與模型組相比明顯提高（P＜0.05），火麻油運動組雌二醇與對照組相比不具有顯著性差異（P＞0.05）；模型組大鼠骨密度與對照組相比明顯降低（P＜0.05），火麻油運動組骨密度與模型組相比明顯提高（P＜0.05），火麻油運動組骨密度與對照組相比不具有顯著性差異（P＞0.05）。

研究表明女性在絕經(jīng)之后骨質(zhì)疏松癥狀逐年提高[19]，骨質(zhì)疏松是一種多原因引發(fā)骨量丟失，骨結(jié)構(gòu)退化的疾病[20]。運動是當前治療骨質(zhì)疏松的重要方法，相對來說跑步、走路等運動對于骨密度的增加使其產(chǎn)生的效果需要在10～12個月左右，所以通過食物或者藥物來配合可以達到更好的效果[21]。本文中大鼠通過切除雙側(cè)卵巢后，導(dǎo)致自身代謝出現(xiàn)紊亂，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥狀，血清中OC水平可以作為評價骨轉(zhuǎn)換率以及骨形成的重要指標，磷（P）的水平是評價骨質(zhì)疏松癥狀效果的重要指標，代表了骨組織中無機物的變化狀態(tài)，通過以上指標可以反映骨代謝情況，而且會參與到成骨細胞分化及基質(zhì)的礦化的整個過程[22]，模型組的血清OC明顯高于其他組，模型組的磷（P）水平明顯低于其他組，表明模型組的骨轉(zhuǎn)化率高于其他組，骨質(zhì)疏松癥狀明顯，說明經(jīng)過有氧運動干預(yù)以及灌胃火麻油可以調(diào)節(jié)骨代謝平衡，降低骨轉(zhuǎn)換率，起到抑制骨質(zhì)疏松的作用；雌二醇可以對成骨細胞和破骨細胞的調(diào)節(jié)來反映機體的骨鈣代謝，模型組的雌二醇低于其他組，說明經(jīng)過有氧運動干預(yù)以及灌胃火麻油可以調(diào)節(jié)骨鈣代謝之間的平衡，減弱成骨細胞的骨形成能力；骨密度是骨骼強度的一個重要指標，大鼠通過切除雙側(cè)卵巢6周后，模型組的骨密度明顯低于其他組，說明經(jīng)過有氧運動干預(yù)以及灌胃火麻油可以抑制破骨細胞分化、阻礙骨吸收，進而改善骨密度，接近正常大鼠的骨密度。并且火麻油結(jié)合有氧運動要比運動組和火麻油組單一效果要好。

3 結(jié)論

通過溶劑法提取火麻油的最優(yōu)工藝條件為：當液料比為16∶1（mL/g）、提取溫度為46℃、提取時間為104 min時，火麻油的得率為83.45%。選取該組合做3次驗證試驗，得出火麻油的平均得率為83.39%。與預(yù)測值相近，證明該方法的可行性。同時大鼠實驗表明，火麻油結(jié)合有氧運動對骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨鈣素（OC）、磷（P）水平、雌二醇水平、骨密度 4項指標起到積極作用。說明經(jīng)過有氧運動干預(yù)以及灌胃火麻油可以調(diào)節(jié)骨代謝平衡，降低骨轉(zhuǎn)換率，減弱成骨細胞的骨形成能力，抑制破骨細胞分化、阻礙骨吸收，進而改善骨密度，起到抑制骨質(zhì)疏松的作用。并且火麻油結(jié)合有氧運動的效果要優(yōu)于兩者單獨作用，為今后的相關(guān)研究提供了寶貴經(jīng)驗。