茄根醇提物治療Ⅱ度凍傷模型大鼠實驗研究

顧心奇 周盧姍 彭心怡 鄭慧華 王 萍

輕度凍傷是一種局限性炎性損害，常于寒冷冬季發(fā)病。多出現(xiàn)手、足、鼻尖、耳廓和面頰等處的組織損傷，初起受凍部位皮膚蒼白、麻木冷感，繼而水腫或青紫形成淤斑，自覺灼痛、瘙癢等。茄根作為中藥茄的一部分，被廣泛應用于多種消炎鎮(zhèn)痛領域。早在《開寶本草》中對茄根就有記載“茄根主凍瘡，可煮作湯漬之良”[1]。茄，具有清熱止血、祛風利濕、散瘀消腫、止痛等功效，其根可用于治療風濕熱痹、久痢不止、女陰挺出以及凍瘡等癥[2]。實驗證明，茄根煎液在治療大鼠Ⅱ度凍傷時不同給藥途徑均可改善微循環(huán)障礙，其中外涂效果更優(yōu)于灌胃[3]。藥理研究證明，茄根熱浸法浸出物含量較高，并指出雖然水浸出物高于醇浸出物，但因茄根中的有效成分多為醇溶性，故仍應選擇70%乙醇作為提取溶劑[4]。本實驗設計并觀察茄根醇提物對Ⅱ度凍傷大鼠皮膚損傷修復、病理形態(tài)、血液流變學的影響，報道如下。

1 實驗材料

1.1 動 物 SPF 級SD 大鼠15 只，雄性8 只、雌性7 只，體質量140～160g，購自上海BK 公司，動物合格證號SCXK（滬）2018-0006，倫理編號10750，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，溫度（22±2）℃，濕度40%～70%，噪音60 分貝以下，光照12h 明12h 暗，進食飲水自由。

1.2 藥品與試劑 茄根（批號190211），購自亳州市大西北藥業(yè)有限責任公司。70%乙醇（批號180802），購自太倉新太酒精有限公司。液氮（浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院實驗中心提供）。對乙酰氨基酚（批號L24O10G101047），10%水合氯醛（批號B14A9E58 584），生理鹽水（批號L16J11G108436），購自上海源葉生物科技有限公司。尿素維E 乳膏（批號181011），購自宿州億帆藥業(yè)有限公司。

1.3 儀 器 眾馳ZL9100 全自動血流變測試儀，購自北京眾馳偉業(yè)科技發(fā)展有限公司。

2 實驗方法

2.1 茄根醇提物制備 2kg 茄根打粉，加入70%乙醇6L，密塞靜置1h。連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸狀態(tài)1h。過濾靜置，上層清液經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀濃縮為1g/mL 的茄根醇提物，避光冷藏。

2.2 大鼠凍傷模型建立與給藥 SPF 級別SD 大鼠15 只，隨機數(shù)字表法分為生理鹽水組、茄根醇提物組、尿素維E 乳膏組，每組5 只。適應性飼養(yǎng)1 周。提前禁食12h 后進行造模，以苗明三《凍傷動物模型制備規(guī)范（草案）》[5]為藍本，使用液氮法于大鼠背部行Ⅱ度凍傷造模。實驗過程中大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉、對乙酰氨基酚鎮(zhèn)痛，符合倫理學標準。麻醉鎮(zhèn)痛后的大鼠經(jīng)剃刀、硫化鈉溶液共同作用，在背部脫毛裸露約30mm 左右的圓形區(qū)域。使用直徑20mm 的鐵棒浸入液氮充分冷卻15min 后，貼緊大鼠皮膚表面10s 進行造模。局部有充血和水腫、有水皰形成，水皰液為漿液性或淡血性、水皰基底呈鮮紅色且潮濕，皮溫較高，吻合度≥90%即為造模成功。造模成功24h 后給藥。根據(jù)《中藥外用藥理實驗技術規(guī)范（草案）》[6]，各組在給藥前以溫生理鹽水清洗給藥部位，后采取外用棉簽點涂法，給藥量約1mL/100g，即以給藥區(qū)均勻涂覆薄薄一層為標準。給藥頻率每天2次，時間間隔9h。生理鹽水組予2mL·100g-1·d-1生理鹽水；茄根醇提物組予2mL·100g-1·d-1茄根醇提取物，尿素維E 乳膏組予2mL·100g-1·d-1尿素維E 乳膏。

2.3 觀察指標 造模成功后第18 天進行病理指標、血液指標的采樣。提前禁食12h 后進行采樣，大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，取血完畢后靜注過量10%水合氯醛處死，完成局部皮膚病理組織的采樣。

2.3.1 表觀指標 參照《凍傷動物模型制備規(guī)范（草案）》[5]，擬定表觀指標評分。給藥同時，每天觀察1 次患處皮膚表觀情況并做好記錄，根據(jù)局部皮膚表觀情況采取等級半定量積分法進行統(tǒng)計。計分方式為：皮膚顏色粉紅/紅/暗紅計1/2/3 分；皮膚溫度稍增高/增高/明顯增高計1/2/3 分；皮膚感覺刺痛/灼痛/痛覺敏感計1/2/3 分；水皰視大小、皰壁、皰皮顏色、皰液顏色等指標分別計1/2/3 分；痂皮稍薄、棕色/薄、褐色/稍厚、黑色計1/2/3 分；滲出液少/稍多/多計1/2/3分。計算造模后表觀指標的差值，即“造模第3、6、9、12、15、16 天表觀指標評分-造模第1 天表觀指標評分”，差值為正提示凍傷局部狀況加重，差值為負提示凍傷局部情況減輕。

2.3.2 病理形態(tài) 在凍傷部位中心區(qū)域內(nèi)切取約1cm×1cm×1cm 的皮膚組織，放入中性甲醛固定瓶內(nèi)，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、HE 染色、封片固定后，以《凍傷動物模型制備規(guī)范（草案）》為基礎在光學顯微鏡下觀察局部組織的病理形態(tài)。

2.3.3 血液流變學 腹主動脈取血1mL，肝素鈉抗凝，經(jīng)眾馳ZL9100 全自動血流變測試儀檢測血漿黏度、全血黏度、紅細胞聚集指數(shù)、纖維蛋白原、紅細胞內(nèi)黏度等指標。

2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（） 表示。首先對各組數(shù)據(jù)行正態(tài)性檢驗，滿足正態(tài)分布則對相關組間數(shù)據(jù)行方差齊性檢驗，在符合方差齊性的條件下，行單因素ANOVA 檢驗，LSD 法行組間差異比較；若單組數(shù)據(jù)不符合組內(nèi)正態(tài)分布，或相關組間數(shù)據(jù)不符合方差齊性，則對相關數(shù)據(jù)行Mann-Whitney 檢驗。P＜0.05則認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 表觀指標 造模第1 天，生理鹽水組、茄根醇提物組和尿素維E 乳膏組大鼠凍傷局部表觀指標評分分別為（10.60±1.82）分、（12.00±1.58）分、（11.60±1.67）分，各組評分差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），示造模成功組間基線可比。造模后表觀指標整體變化趨勢先加重后減輕。造模后第3 天差值普遍增大、凍傷加重，第6 天差值普遍減小、凍傷恢復，其中茄根醇提物組、尿素維E 乳膏組較生理鹽水組有顯著差異（P＜0.05）。造模后第9、12、15、16 天差值普遍呈下降趨勢但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

3.2 病理指標 生理鹽水組表皮較厚，可見明顯角化層、大量炎細胞、肉芽組織。茄根醇提物組、尿素維E 乳膏組炎細胞少、皮下血管較多、有肉芽組織和毛囊出現(xiàn)。見插頁圖1。

3.3 血液流變學指標 茄根醇提物組血液流變學指標較生理鹽水組稍有降低但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。茄根醇提物組血漿黏度、全血黏度、紅細胞聚集指數(shù)、纖維蛋白原顯著低于尿素維E 乳膏組（P＜0.05）。尿素維E 乳膏組血漿黏度、纖維蛋白原高于生理鹽水組（P＜0.05）。見表2。

4 討論

茄根內(nèi)含豐富生物堿類、酸性成分、苯丙酰胺類成分，常用于祛風利濕，清熱止血，抗炎等[7]。現(xiàn)代藥理學研究證明，苯丙酰胺衍生物和甾體生物堿等生物堿成分是其活血、鎮(zhèn)痛的主要有效成分，多為茄科植物特有[2]。故應用茄根治療凍傷具有多重優(yōu)勢。

表觀指標顯示，造模第3 天各組評分差值增大，第6 天茄根醇提物組、尿素維E 乳膏組較生理鹽水組有顯著差異（P＜0.05），第9、12、15、16 天茄根醇提物組和尿素維E 乳膏組較生理鹽水組偏小但無統(tǒng)計學意義。符合凍傷病理的階段性進展，即第3 天處于融化后反應期，為凍融后血管擴張、充血、滲出的過程，第9 天后各組均呈愈合趨勢[8-9]。提示一定時間內(nèi)，茄根醇提物能顯著促進局部凍傷恢復，與尿素維E 乳膏效果相仿。

表1 各組大鼠凍傷局部表觀指標評分差值比較（分，）

表1 各組大鼠凍傷局部表觀指標評分差值比較（分，）

注：生理鹽水組為Ⅱ度凍傷模型大鼠予2mL·100g-1·d-1 生理鹽水；茄根醇提物組為Ⅱ度凍傷模型大鼠予2mL·100g-1·d-1 茄根醇提物；尿素維E乳膏組為Ⅱ度凍傷模型大鼠予2mL·100g-1·d-1 尿素維E 乳膏；統(tǒng)計指標為“造模第3、6、9、12、15、16 天表觀指標評分-造模第1 天表觀指標評分”，差值為正提示凍傷局部狀況加重，差值為負提示凍傷局部情況減輕；與生理鹽水組同期比較，aP＜0.05

表2 造模第18 天各組大鼠血液流變學指標比較（）

表2 造模第18 天各組大鼠血液流變學指標比較（）

注：生理鹽水組為Ⅱ度凍傷模型大鼠予2mL·100g-1·d-1 生理鹽水；茄根醇提物組為Ⅱ度凍傷模型大鼠予2mL·100g-1·d-1 茄根醇提物；尿素維E乳膏組為Ⅱ度凍傷模型大鼠予2mL·100g-1·d-1 尿素維E 乳膏；與生理鹽水組比較，aP＜0.05；與尿素維E 乳膏組比較，bP＜0.05

病理形態(tài)示茄根醇提物組、尿素維E 乳膏組較生理鹽水組炎細胞顯著減少。茄根的藥理活性研究示其水提液、水煎劑和酸性組分均具抗炎作用，可能與苯丙酰胺類活性成分有關，對凍傷局部有良好抗炎作用，可促進肉芽組織生成和表皮愈合恢復[2，7]。提示抗炎作用為茄根治療局部凍傷的重要機制之一。

血液流變學指標示凍傷第18 天茄根醇提物組、尿素維E 乳膏組較生理鹽水組無顯著差異，與白強等[3]實驗示凍傷第12 天茄根水煎液外涂組各項指標均顯著優(yōu)于模型組（P＜0.01）的結果不同。綜合本實驗結果，推測可能原因為：（1）本實驗造模Ⅱ度凍傷，反應程度較輕，局部組織無持續(xù)的內(nèi)皮脫落、出血等，血液黏滯狀態(tài)較輕；（2）茄根醇提物、尿素維E 乳膏均有顯著療效，在用藥早期即緩解了血液高黏滯狀態(tài)，因檢測較晚，輕度凍傷自我修復，差異無法體現(xiàn)；（3）傳統(tǒng)觀點認為治療重度凍傷，及時阻斷血液高黏滯狀態(tài)的惡性循環(huán)是治療的關鍵[10]。但本實驗發(fā)現(xiàn)輕度凍傷后期，是否用藥對血液流變學指標無明顯影響。楊成等[11]實驗示凍傷組織學改變3 天時集中在血管壁破裂與內(nèi)出血、2 周時集中在炎性反應，結合苗明三等[5]綜合權重評分標準，推測輕度凍傷狀態(tài)下，前期主要為血液流變學方面的改變，后期轉入炎性反應和自我修復階段。提示針對輕度凍傷，后期治療應著眼于抗炎。尿素維E 乳膏組血漿黏度、纖維蛋白原顯著高于生理鹽水組（P＜0.05），可能與維E 存在引起血栓形成、動脈粥樣硬化的趨勢有關[12]。茄根醇提物組血漿黏度、全血黏度切變率、紅細胞聚集指數(shù)、纖維蛋白原顯著低于尿素維E 乳膏組（P＜0.05），提示茄根醇提物可能存在心血管方面的作用。

綜上所述，在相關實驗開展時，血液流變學指標的檢測應在早期進行，同時建議開展凍傷大鼠血液流變學指標階段性測試，研究其發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，為后續(xù)實驗設計提供參考。

現(xiàn)代研究證實，茄根總生物堿可延長小鼠凝血時間，茄根醇提物可促進小鼠耳廓微循環(huán)，適用于凍傷早期血液流變學的恢復[13-14]。且其水提液、水煎劑、酸性組分均具有抗炎作用，其酸性組分對以毛細血管通透性改變、局部腫脹為特征的急性炎癥模型尤為有效，適用于凍傷中后期炎癥的恢復[7]?？梢娗迅委焹鰝?，兼具活血、抗炎效果。