基于巨噬細(xì)胞活性成像探針的研究進(jìn)展

符純美　劉義成　張建標(biāo)　張弛　晏麗　吳鵬　閆新豪

摘????? 要： 巨噬細(xì)胞是具有多功能的免疫細(xì)胞，在抵御病原體及組織損傷和重構(gòu)方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。由于巨噬細(xì)胞影響機(jī)體內(nèi)多個(gè)生物學(xué)進(jìn)程，其活性檢測(cè)在炎癥微環(huán)境和腫瘤的基礎(chǔ)研究及診斷方面具有重要意義。成像探針以其選擇性強(qiáng)、靈敏度高、響應(yīng)快、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)深受研究者的青睞，在醫(yī)學(xué)成像方面作為一種直觀、原位的可視化觀測(cè)技術(shù)，其在患者臨床結(jié)果的預(yù)測(cè)、治療方案的確定和治療反應(yīng)的監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，相繼發(fā)展了大量可用于生物體內(nèi)巨噬細(xì)胞活性成像的探針，對(duì)各種成像探針及其應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，并對(duì)未來(lái)研究方向進(jìn)行展望。

關(guān)? 鍵? 詞：巨噬細(xì)胞;成像探針;腫瘤微環(huán)境;炎癥微環(huán)境;細(xì)胞成像

中圖分類號(hào)：TQ460.7+2? ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?????? ?文章編號(hào)： 1671-0460（2020）07-1509-05

Research Progress of Macrophage Activity Imaging Probe

FU Chun-mei， LIU Yi-cheng， ZHANG Jian-biao， ZHANG Chi， YAN Li， WU Peng， YAN Xin-hao*

（Hanzhong Vocational and Technical College， Hanzhong Shaanxi 723000， China）

Abstract： Macrophages are multifunctional immune cells， which play an important role in resisting pathogens and tissue damage and remodeling. Macrophages have close relationship with many biological processes in the body， their activity detection is of great significance in the basic research and diagnosis of inflammatory microenvironment and tumor. Imaging probe is favored by researchers for its advantages of high selectivity， high sensitivity， fast response and low cost. In medical imaging， as an intuitive， in-situ visual observation technology， it has become a research hotspot for the prediction of patients' clinical results， the determination of treatment plans and the monitoring of treatment response. In recent years， a large number of imaging probes which can be used to illustrate macrophage activity in vivo have been developed. In this paper， various imaging probes and their applications were reviewed， and the future research direction was prospected.

Key words： Macrophages; Imaging probe; Tumor microenvironment; Inflammatory microenvironment; Cell imaging

1 ?引言

高分辨光學(xué)成像技術(shù)為活體細(xì)胞的可視化成像及相關(guān)生物學(xué)事件動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支持。近年來(lái)，隨著對(duì)熒光探針的不斷深入研究，通過(guò)特定信號(hào)分子或蛋白質(zhì)激活發(fā)射熒光信號(hào)的化合物，以其高分辨、高信噪比和高靈敏度的特點(diǎn)正在敲開(kāi)活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像檢測(cè)的大門。這種熒光探針結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是智能熒光團(tuán)，通過(guò)合理的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物誘導(dǎo)的熒光響應(yīng)，智能熒光團(tuán)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中用有機(jī)化學(xué)工具在分子片段中搭建“off-on”架構(gòu)，用化學(xué)生物學(xué)方法提高探針靶向性。用于細(xì)胞活性成像的成像探針在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中提供了一系列的可能性，從活體內(nèi)生物進(jìn)程的監(jiān)測(cè)到健康狀態(tài)和疾病狀態(tài)模式差異的可視化，從而應(yīng)用于疾病診斷與新藥發(fā)現(xiàn)。

巨噬細(xì)胞在宿主防御中發(fā)揮重要功能，它們通過(guò)吞噬作用清除凋亡細(xì)胞、碎片及病原體;通過(guò)分泌細(xì)胞因子、酶及其他因子形成炎癥反應(yīng);通過(guò)向淋巴細(xì)胞呈遞抗原來(lái)調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫（獲得的特異性免疫能力）。雖然這些功能將有益于宿主，但越來(lái)越多的證據(jù)表明巨噬細(xì)胞在一些情況下也可能有害，例如：惡性腫瘤組織有大量的巨噬細(xì)胞，稱作腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor-associated macrophages， TAMs），作為一種炎癥反應(yīng)的組成部分，參與腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建^[1]。腫瘤可通過(guò)遠(yuǎn)距離分泌方式分泌多種生物活性因子，使巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞從腫瘤基質(zhì)中擴(kuò)增出來(lái)，在局部腫瘤微環(huán)境中聚集從而發(fā)揮其作用，這些TAMs促進(jìn)腫瘤增生及轉(zhuǎn)移功能的獲得，并在腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著十分重要的角色，研究表明具有豐富的TAMs的腫瘤進(jìn)展速度更快^[2-5]。巨噬細(xì)胞參與炎癥的發(fā)生及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成^[6]，容易導(dǎo)致心腦血管系統(tǒng)疾?。ㄈ缧募」Ｋ琅c中風(fēng)）的發(fā)病，心肌梗死后不受控制的炎性巨噬細(xì)胞可引起心室重塑、心力衰竭和死亡，以及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎^[7]、肥胖^[8]和糖尿病^[9]等疾病的發(fā)生，因此對(duì)組織巨噬細(xì)胞（密度、流量、功能和亞型）的成像監(jiān)測(cè)具有重要的臨床和研究應(yīng)用價(jià)值。

成像探針以其選擇性強(qiáng)、靈敏度高、響應(yīng)快、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)深受研究者的青睞，在醫(yī)學(xué)成像方面作為一種直觀、原位的可視化觀測(cè)技術(shù)用于患者臨床結(jié)果的預(yù)測(cè)、治療方案的確定和治療反應(yīng)的監(jiān)測(cè)。巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子、酶和活性氧（ROS）在宿主對(duì)感染性疾病的反應(yīng)中發(fā)揮作用，這些特性可以作為成像診斷和新藥研發(fā)的靶點(diǎn)，促進(jìn)了巨噬細(xì)胞活性監(jiān)測(cè)成像探針的發(fā)展。近年來(lái)，相繼發(fā)展了大量可用于生物體內(nèi)巨噬細(xì)胞活性成像探針，本文對(duì)各種成像探針及其應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，并對(duì)未來(lái)研究方向進(jìn)行展望。

2 ?設(shè)計(jì)策略

ROS和活性氮（RNS）與巨噬細(xì)胞的許多功能直接相關(guān)?；罨木奘杉?xì)胞可產(chǎn)生大量的ROS，生理或病理?xiàng)l件下，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生釋放的ROS對(duì)微生物的吞噬作用、炎癥反應(yīng)和組織損傷產(chǎn)生重要影響。巨噬細(xì)胞釋放ROS作為第二信使來(lái)調(diào)節(jié)參與細(xì)胞增殖、凋亡和基因表達(dá)的信號(hào)通路。過(guò)氧化氫（H₂O₂）是巨噬細(xì)胞內(nèi)最重要的內(nèi)源性ROS之一。在吞噬細(xì)胞時(shí)，氧化酶Nox2被激活產(chǎn)生超氧化物（O₂˙?），其發(fā)生歧化形成H₂O₂和隨后的次氯酸（HOCl）。由于其存在時(shí)間短，巨噬細(xì)胞中H₂O₂含量在納摩爾范圍內(nèi)，因此需要高度靈敏的探針進(jìn)行實(shí)時(shí)成像。大多數(shù)用于巨噬細(xì)胞中H₂O₂可視化的成像探針依賴于含有H₂O₂響應(yīng)的熒光團(tuán)。硼酸酯^[10]、膦酸酯^[11-12]和苯甲酰羰基^[13]被用來(lái)作為ROS信號(hào)導(dǎo)入基團(tuán)，這些基團(tuán)引入到熒光團(tuán)特定位置用于調(diào)節(jié)內(nèi)部電荷或電子轉(zhuǎn)移性質(zhì)，使得熒光只在H₂O₂化學(xué)選擇性切割時(shí)引起。

3? 研究進(jìn)展

2010年Chang課題組^[10]設(shè)計(jì)合成了一系列不同發(fā)光色的成像探針1（如圖 1），硼酸酯連接于熒光素或羅丹明發(fā)光團(tuán)的酚羥基處實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的開(kāi)關(guān)，具有激發(fā)發(fā)射光譜可調(diào)諧的優(yōu)點(diǎn)和對(duì)內(nèi)源性H₂O₂細(xì)胞水平的敏感響應(yīng)的特性。該探針應(yīng)用于巨噬細(xì)胞吞噬性呼吸爆發(fā)成像檢測(cè)，在多色成像實(shí)驗(yàn)中，具有擇性地鑒別活的巨噬細(xì)胞中H₂O₂和次氯酸（HOCl）水平的變化。此外，當(dāng)用合成的成像探針和標(biāo)記的巨噬細(xì)胞被刺激以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答時(shí)，發(fā)現(xiàn)了3種不同類型的吞噬體，用于區(qū)別不同的ROS，探針表現(xiàn)出對(duì)過(guò)氧化氫良好的選擇性，對(duì)兩種豚尸體實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)，有助于揭示ROS在細(xì)胞中的生成及分布。

2018年，Shao等^[14]設(shè)計(jì)合成了探針2 （如圖 2），該報(bào)道提出了一種新型的多通道信號(hào)電化學(xué)熒光探針，用于活體細(xì)胞中H₂O₂的成像和檢測(cè)。探針由H₂O₂反應(yīng)位點(diǎn)硼酸酯和4-二茂鐵基（乙烯基）吡啶單元組成，提供顯色、熒光和電化學(xué)信號(hào)。這些結(jié)構(gòu)單元在單分子中集合了顯色、熒光和氧化還原傳感功能。裸眼觀察，當(dāng)H₂O₂加入含探針的緩沖溶液中時(shí)，觀察到從淡紅色到無(wú)色的明顯顏色變化;在激發(fā)光激發(fā)下，探針顯示出對(duì)H₂O₂的高靈敏度和選擇性的“turn on”熒光響應(yīng)，這可以應(yīng)用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)H₂O₂活性;電化學(xué)檢測(cè)時(shí)，加入H₂O₂后，探針的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)降低，可作為檢測(cè)活細(xì)胞釋放H₂O₂的簡(jiǎn)便方法，該探針成功應(yīng)用于巨噬細(xì)胞釋放H₂O₂的成像檢測(cè)。

2007年，Tang等^[15]設(shè)計(jì)合成了基于膦酸酯響應(yīng)的探針3（如圖 3），以熒光素作為發(fā)光團(tuán)，膦酸酯基作為與O₂˙?反應(yīng)位點(diǎn)，脫保護(hù)后表現(xiàn)為“turn on”模式得到熒光素，探針合成方法簡(jiǎn)單、新穎。在與O₂˙?反應(yīng)時(shí)，該探針具有較強(qiáng)的熒光響應(yīng)性、對(duì)細(xì)胞內(nèi)其他ROS高選擇性且檢測(cè)線性范圍寬、檢測(cè)極限低的優(yōu)點(diǎn)，添加超氧化物歧化酶清除劑證實(shí)了探針對(duì)O₂˙?特異性反應(yīng)。探針具有良好的選擇性、高靈敏度、良好的水溶性和響應(yīng)性應(yīng)用于小鼠腹膜巨噬細(xì)胞成像，攜帶探針的巨噬細(xì)胞顯示細(xì)胞內(nèi)弱背景熒光，當(dāng)PMA激發(fā)后表現(xiàn)了強(qiáng)熒光信號(hào)，這些結(jié)果表明探針能特異性地響應(yīng)活細(xì)胞內(nèi)O₂˙?濃度的變化，該探針將有助于研究超氧化物介導(dǎo)的細(xì)胞代謝與損傷修復(fù)中的作用及其機(jī)制。

2017年，Liu等^[16]報(bào)道了基于喹啉衍生物雙光子熒光探針4（如圖 4），6-二甲氨基-喹啉-2-苯并噻唑啉。該探針噻唑啉環(huán)與O₂˙?反應(yīng)得到噻唑環(huán)延長(zhǎng)π-共軛激活熒光信號(hào)，探針在O₂˙?濃度范圍內(nèi)具有選擇性和快速的“開(kāi)啟”響應(yīng)，在濃度范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性和穩(wěn)定性。此外，探針在細(xì)胞內(nèi)和生物體顯示出良好的雙光子熒光特性、優(yōu)異的光學(xué)穩(wěn)定性、低的細(xì)胞毒性、優(yōu)異的組織穿透性。首次通過(guò)雙光子熒光成像技術(shù)跟蹤體內(nèi)炎癥組織內(nèi)源性產(chǎn)生的O₂˙?指示劑，這顯示了快速原位檢測(cè)活生物體中炎癥反應(yīng)的潛力，有望成為研究超氧陰離子在各種生理和病理過(guò)程作用機(jī)制的有力工具。

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基金項(xiàng)目：陜西省教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：18JK0922和18JK0921）;漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：HZYKYZD201701）;

中科院“西部青年學(xué)者”B類項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：Y82A570Q10）。

收稿日期：2020-02-11

作者簡(jiǎn)介：符純美（1978-），女，陜西漢中人，講師，碩士，2010年畢業(yè)于沈陽(yáng)藥科大學(xué)生物藥學(xué)專業(yè)，研究方向：藥物檢測(cè)分析和新藥研發(fā)。E-mail：920175446@qq.com。

通訊作者：閆新豪（1982-），男，教授，博士，研究方向：納米醫(yī)學(xué)。E-mail：wide123@163.com。