葡萄糖結(jié)合蛋白（GBP）構(gòu)象變化的研究及討論

崔兆寧　李義　武麗達　劉雄飛　陶進　崔兆寧　佟毅

摘????? 要：葡萄糖結(jié)合蛋白（D-glucose Binding Protein，簡稱GBP）屬于一類在細胞膜上起化學(xué)活性物質(zhì)運載相關(guān)作用的周質(zhì)結(jié)合蛋白（PBPs）。未結(jié)合葡萄糖分子的GBP （空配體GBP或“apo GBP”）的構(gòu)象動力學(xué)在配體結(jié)合過程中起著至關(guān)重要的作用，了解這一過程對于設(shè)計該蛋白的抑制劑或突變具有重要意義。利用空配體GBP的全原子分子動力學(xué)模擬，確定了空配體GBP的多種亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象，模擬結(jié)果揭示了場域靜電斥力或許是空配體GBP構(gòu)象動力學(xué)的關(guān)鍵決定因素。GBP上下兩塊區(qū)域的蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用，與鉸鏈區(qū)域施加的幾何約束作用相平衡。在溶液中，區(qū)域相互作用導(dǎo)致了空配體GBP開口構(gòu)象和閉口構(gòu)象之間可以快速轉(zhuǎn)化。此外，分子動力學(xué)模擬所繪制的空配體GBP的亞穩(wěn)態(tài)與之前的熒光研究一致，在核磁共振（NMR）實驗中也觀察到了不同構(gòu)象之間的快速平衡。結(jié)果表明，現(xiàn)有的晶體結(jié)構(gòu)可能不代表溶液中的主要構(gòu)象。

關(guān)? 鍵? 詞：葡萄糖結(jié)合蛋白;分子動力學(xué)模擬;亞穩(wěn)態(tài);構(gòu)象變化

中圖分類號：Q503?????? 文獻標識碼： A?????? 文章編號： 1671-0460（2020）07-1409-05

Research and Discussion on Conformational Dynamics

of D-Glucose Binding Protein （GBP）

CUI Zhao-ning1， LI Yi2， WU Li-da2， LIU Xiong-fei3， TAO Jin2，[崔兆寧3]? TONG Yi1*

1. COFCO Biotechnology Co.， Ltd.， Beijing 100005， China;

2. Jilin COFCO Biochemical Co.， Ltd.， Jilin Changchun 130033， China;

3. Mengniu Dairy Technology （Beijing） Co.， Ltd.， Beijing 101107， China[崔兆寧4]?）

Abstract： The D-glucose binding protein （GBP） belongs to a subclass of periplasmic binding proteins （PBPs） associated with membrane complexes for transport and chemotaxis. The conformational dynamics of glucose-free GBP （apo GBP） plays a vital role in the ligand binding process， understanding of which is important for the design of inhibitors or mutations of the protein. We have constructed molecular dynamics （MD） simulations from all-atom molecular dynamics simulations of apo GBP and have identified multiple meta-stable conformational states of the apo GBP. Our results suggest that domain-domain electrostatic repulsion is a key determinant to the conformational dynamics of apo GBP. In balance with the geometric restrains imposed by the hinge loops， domain-domain interactions result in a rapid equilibrium between the open and closed conformations in solution. Moreover， the metastable states mapped out by MD simulation for apo GBP agrees with previous fluorescence study and the rapid equilibrium between different metastable conformations has also been observed in NMR experiment. Our results suggest that the existing crystal structures may not represent the dominant conformations in solution.

Key words： Glucose binding protein; Molecular dynamics simulation; Metastable state; Conformational change

周質(zhì)結(jié)合蛋白（PBPs）是一個大的受體家族。它們的關(guān)鍵功能包括識別配體，如小分子和離子，并將它們穿過細胞膜進行后續(xù)的生物過程。大腸桿菌葡萄糖結(jié)合蛋白（GBP）是PBPs的一個亞類^[1]?；谄咸烟菨舛葘Ψ肿訕?gòu)象動態(tài)的影響，GBP有可能成為糖尿病患者的生物傳感器^[2-4]。

GBP由兩個蛋白結(jié)構(gòu)域通過鉸鏈區(qū)域連接而成，在這兩個域之間的界面上有糖結(jié)合位點^[5-6]。沒有葡萄糖結(jié)合的GBP構(gòu)象統(tǒng)稱為空配體構(gòu)象或apo構(gòu)象，而結(jié)合了葡萄糖的GBP則被稱為配體構(gòu)象或holo構(gòu)象。如圖1所示，GBP分子由上下兩片區(qū)域構(gòu)成，中間以鉸鏈連接，整個分子可以是開口構(gòu)象，也可以是閉口構(gòu)象，與“吃豆人（Pacman）”的行為方式比較類似。不同的是，GBP上下兩片區(qū)域還可以相對扭動，故GBP的不同構(gòu)象可以用不同的開口角度和扭轉(zhuǎn)角度2個參數(shù)加以區(qū)分（如圖3）。

在GBP與葡萄糖分子的結(jié)合過程中，有兩種可能的結(jié)合路徑，如圖2所示：（1）空配體GBP分子自身運動到合適的構(gòu)象，而后葡萄糖與此構(gòu)象直接結(jié)合，形成配體構(gòu)象;（2）空配體GBP分子在某一個構(gòu)象與葡萄糖分子結(jié)合，而后葡萄糖分子誘導(dǎo)GBP分子繼續(xù)進行構(gòu)象變化，最終抵達穩(wěn)定的配體構(gòu)象狀態(tài)。而GBP與配體結(jié)合的過程究竟屬于哪種，或是兩者皆有，目前尚不完全清楚。

1? 研究背景

有研究表明，GBP與葡萄糖的結(jié)合是上下兩片蛋白區(qū)域逐漸閉口、葡萄糖分子逐漸嵌入的過程。此結(jié)合過程的構(gòu)象變化被認為是受構(gòu)象選擇機制控制的，其中一個預(yù)先存在的構(gòu)象被“選擇”，并在配體（葡萄糖）結(jié)合后穩(wěn)定下來。通過實驗觀察，得到了配體閉口（holo-closed）構(gòu)象和空配體閉口構(gòu)象（apo-closed）的X射線晶體結(jié)構(gòu)。然而，最近的核磁共振（NMR）波譜研究獲得了有爭議的結(jié)果，表明沒有單一的X射線晶體結(jié)構(gòu)與核磁共振（NMR）殘基偶極耦合（RDC）數(shù)據(jù)一致^[7-8]。重要的是，核磁共振（NMR）實驗表明，作為支撐構(gòu)象選擇機制的關(guān)鍵構(gòu)象，閉口構(gòu)象在溶液中可能不穩(wěn)定^[9]。因此，根據(jù)核磁共振（NMR）所示，溶液中可能存在多個亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象，然而，對于配體后續(xù)構(gòu)象選擇，在溶液的結(jié)構(gòu)系綜中是否存在足夠百分比的空配體閉口構(gòu)象尚不清楚。

在決定GBP和其他PBPs構(gòu)象動態(tài)的各種因素中，鉸鏈區(qū)域被認為是最重要的因素之一^[10]。特別是Borrok M.J.等在大腸桿菌GBP的開口與閉口晶體結(jié)構(gòu)之間的三段鉸鏈區(qū)觀察到顯著的扭轉(zhuǎn)角變化。此外，Ortega G.等研究發(fā)現(xiàn)，在第一個鉸鏈節(jié)上出現(xiàn)了G109A/T110S雙突變體，該突變體可以極大地改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象動力學(xué)，使開口構(gòu)象更為理想^[9]。

然而，僅靠鉸鏈區(qū)不足以解釋一些誘變實驗結(jié)果。近年來，一些GBP突變體，如E149C^[11]、 A213R^[4]、E149C/A213S/L238S^[11]，被用來削弱GBP的結(jié)合親和力，以接近生理相關(guān)的葡萄糖濃度。許多突變殘基既不影響鉸鏈區(qū)，也不顯著改變蛋白質(zhì)-配體相互作用。為什么這些突變體能敏感地影響葡萄糖結(jié)合親和力還沒有完全弄清楚^{[4， 11-12]}。

除了鉸鏈區(qū)域外，蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用也可能在雙域PBPs的構(gòu)象動力學(xué)中發(fā)揮重要作用。在1999年，Hasemann C.A.等研究了TroA（也是PBPs中的一種）中顯著的親水蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用^[13]。這種沿著接觸面的相互作用使蛋白質(zhì)打開結(jié)合位點進行配體交換。Nussinov R.等進一步對PBPs鉸鏈彎曲轉(zhuǎn)變過程中的蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用進行了廣泛的研究，結(jié)果表明，PBPs的鉸鏈彎曲運動可以通過改變域間的非極性埋藏表面積或引入域間靜電相互作用來調(diào)節(jié)^[14]。此外，在特殊情況下，域間疏水相互作用甚至可能導(dǎo)致多域蛋白迅速折疊。然而，很少有人研究蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用在GBP構(gòu)象動力學(xué)中的作用^[15]。

在本研究中，利用溶劑中未結(jié)合葡萄糖的GBP全原子分子動力學(xué)（MD）模擬，并建立了馬爾可夫狀態(tài)模型（MSMs），以確定亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象和它們之間的構(gòu)象變化動力學(xué)。結(jié)果表明，在亞微秒的時間內(nèi)，場域排斥相互作用對這兩個亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象在不同開口角度和不同扭轉(zhuǎn)角度下的快速平衡起著重要的調(diào)節(jié)作用。此外，鉸鏈區(qū)域也是必不可少的，它們之間提供了必要的幾何約束，以平衡各種亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象的蛋白結(jié)構(gòu)域間排斥作用。研究表明，GBP的晶體構(gòu)象可能在溶液中不穩(wěn)定，只是因為晶體堆積效應(yīng)才表現(xiàn)出在晶體中穩(wěn)定的性質(zhì)。

2? 靜電束縛自由能的計算

2.1? 熱力學(xué)循環(huán)

為了研究GBP上下蛋白結(jié)構(gòu)域之間的場域靜電相互作用，使用了T. Wang等報道的兩個熱力學(xué)循環(huán)的方案^[16]。首先，敲除3個鉸鏈環(huán)，將整個蛋白質(zhì)分成上下兩部分。我們刪除的鉸鏈節(jié)段為殘留物110～112（節(jié)段I）、255～257（節(jié)段II）、293～295（節(jié)段III），下半部分與上半部分之間的靜電結(jié)合自由能可表示為：

其中E為兩片區(qū)域在溶液中結(jié)合并完成時的靜電相互作用勢能， 。 為上半部分在下半部分各原子位置所產(chǎn)生的靜電勢， 為下半部分的原子電荷。 ?和 分別為下半部分和上半部分的靜電脫溶自由能，定義為溶劑與蛋白質(zhì)結(jié)合時靜電相互作用能的損失。

2.2? 自適應(yīng)玻爾茲曼解算程序（APBS）

本研究采用自適應(yīng)玻爾茲曼解算程序（APBS）計算了脫溶劑化自由能和靜電相互作用能^[17]。APBS是一個通過數(shù)值求解泊松-玻爾茲曼方程（PBE）來模擬生物分子解的軟件包：

PBE是一個二階非線性橢圓形偏微分方程，包括靜電勢 、蛋白質(zhì)和溶劑的介電特性 、溶液的離子強度和離子進入蛋白質(zhì)內(nèi)部的可達性 、蛋白質(zhì)原子部分電荷的分布 。PBE常被線性化的近似為LPBE，如果假設(shè) 。

在這里，在LPBE上運算，并實現(xiàn)了手動配置的多網(wǎng)格泊松-玻爾茲曼計算，這是一個標準的單點多網(wǎng)格PBE計算，沒有聚焦細化。單位網(wǎng)格大小為0.3×0.3×0.3 ?，立方體粗離子化個數(shù)為289×257× 257，其中心在Asn256 氨基酸Cα原子的位置。采用“單Debye-Huckel”邊界條件求解LPBE。GBP和溶劑的介電常數(shù)分別設(shè)置為2.00和78.54。介電常數(shù)和離子可及性系數(shù)的定義采用“分子”表面定義和諧波均相平滑處理^[18]。采用晶格離散化方法，將生物分子點電荷映射到最近和相鄰的網(wǎng)格點上。溶劑分子和離子的半徑分別為1.4 ?和1.5 ?。

3? 數(shù)據(jù)模擬結(jié)果、分析和討論

3.1? 空配體GBP動力學(xué)中存在多種亞穩(wěn)態(tài)

利用分子動力學(xué)模擬和數(shù)據(jù)分析，根據(jù)上下兩區(qū)域的相對位置（兩區(qū)域不同的相對位置表征為不同的開口角度和扭轉(zhuǎn)角度），本研究確定了空配體GBP動力學(xué)中的5種亞穩(wěn)定構(gòu)象狀態(tài)（見圖3），并進一步根據(jù)絕對域間取向測量對開口構(gòu)象和扭轉(zhuǎn)構(gòu)象進行了分類^[19]。如圖3所示，開放狀態(tài)（狀態(tài)S3，用藍色表示）的占比最高（約64%）。筆者還觀察了其他的亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象，包括扭轉(zhuǎn)狀態(tài)（S0狀態(tài)，紅色顯示）、半扭轉(zhuǎn)狀態(tài)（S1狀態(tài)，橙色顯示）、半開放狀態(tài)（S2狀態(tài)，綠色顯示）和逆時針扭轉(zhuǎn)狀態(tài)（S4狀態(tài)，青色顯示）。此外，發(fā)現(xiàn)這5種狀態(tài)之間的平均轉(zhuǎn)換時間非?？欤?lt; 300 ns）。

本模擬結(jié)果與核磁共振實驗一致，表明GBP具有較高的構(gòu)象靈活性，現(xiàn)有的晶體結(jié)構(gòu)都不能很好地擬合殘基偶極耦合（RDC）數(shù)據(jù)。此外，模型中穩(wěn)定的開放狀態(tài)（S3，占比>60%）與Talaga等之前的研究非常一致，在Talaga等的研究中觀察到高達60%的高占比空配體開口構(gòu)象狀態(tài)^[20]。然而，我們發(fā)現(xiàn)，無論是空配體閉口態(tài)還是空配體開口態(tài)，晶體結(jié)構(gòu)似乎不位于任何局部最小值的MD模擬（見圖3，粉色十字代表空配體閉口態(tài)晶體結(jié)構(gòu)的相對角度，黑色十字代表配體閉口態(tài)晶體結(jié)構(gòu)的相對角度）。

根據(jù)對晶體結(jié)構(gòu)的研究，發(fā)現(xiàn)了兩種典型的結(jié)構(gòu)：空配體閉口結(jié)構(gòu)（如1GCG^[7]）和空配體開口（如2FW0）。開口和閉口構(gòu)象的共存被認為是將GBP與葡萄糖結(jié)合分解為“構(gòu)象選擇機制”的直接證據(jù)^{[5， 7-9， 21]}。然而，沒有觀察到任何閉口的亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象，這表明在配體結(jié)合上達到配體閉口構(gòu)象（即誘導(dǎo)擬合機制）需要顯著的結(jié)構(gòu)重排。另一方面，配體也可能選擇與模型中確定的半開口構(gòu)象結(jié)合的配體，進而誘導(dǎo)構(gòu)象變化到結(jié)合態(tài)。結(jié)果表明，構(gòu)象選擇和誘導(dǎo)擬合都可能在GBP的結(jié)合機制中發(fā)揮作用。

3.2? 蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用在確定空配體GBP動態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用

場域靜電相互作用對穩(wěn)定識別的亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象起著至關(guān)重要的作用。如圖4所示，空配體閉口晶體結(jié)構(gòu)的兩個域之間的靜電結(jié)合自由能為>62? kJ·mol^-1[崔兆寧5]?。這種強烈的排斥作用可能促使蛋白質(zhì)打開。這種閉口構(gòu)象的張開運動和扭轉(zhuǎn)運動均可顯著減小結(jié)構(gòu)域間排斥，從而產(chǎn)生許多亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象。事實上，具有一定開度和扭轉(zhuǎn)度的所有狀態(tài)（S0-S4）都表現(xiàn)出相對較小的結(jié)構(gòu)域間排斥相互作用（<25 kJ·mol^-1[崔兆寧6]?）。開放狀態(tài)（S3）占主導(dǎo)地位，因為當(dāng)?shù)鞍滓暂^大角度打開時，蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用幾乎為0。有趣的是，排斥相互作用的大小與各態(tài)的平衡總體呈負相關(guān)，這證實了蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用在決定GBP構(gòu)象動力學(xué)中起主導(dǎo)作用。進一步的研究表明，GBP結(jié)合界面上的大部分殘基不是帶電的就是親水的，這排除了兩個域之間像其他雙域蛋白一樣發(fā)生疏水靠近的可能性^[15]。

此外，在實驗中發(fā)現(xiàn)了一些降低與葡萄糖結(jié)合親和力的GBP突變體，如E149C、E149C/ A213S/L238S等，可能會改變兩個域之間的相互作用。在空配體閉口構(gòu)象的兩個域之間存在一個鹽橋Lys92-Glu149 （K92-E149）。如果我們通過改變Lys92和Glu149側(cè)鏈的方向來打破鹽橋，那么相互作用的勢能會受到顯著的影響（從-39.7 kJ·mol^-1到-18.4 kJ·mol^-1[崔兆寧7]?）。事實上，像E149C這樣的突變也會改變相互作用電位（從-39.7 kJ·mol^-1到-19.2 kJ·mol^-1[崔兆寧8]?）。我們認為鹽橋的缺失使得有界結(jié)構(gòu)更難保持，從而降低了與葡萄糖的結(jié)合親和力，這也暗示了蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用的重要性。

3.3 ?晶體堆積效應(yīng)穩(wěn)定了GBP的空配體閉口構(gòu)象

模型表明，開口構(gòu)象主導(dǎo)大腸桿菌GBP蛋白的結(jié)構(gòu)集合。然而，在相關(guān)種鼠傷寒沙門氏菌（PDB ID： 1GCG）中存在一個空配體閉口晶體結(jié)構(gòu)。為了研究apo GBP在晶體中的穩(wěn)定性，還建立了考慮晶體堆積效應(yīng)的模擬。將GBP晶體結(jié)構(gòu)放置在水盒的中心，并將20 ?內(nèi)對稱伴侶的所有殘基都包含到中心GBP中。為了模擬結(jié)晶環(huán)境，在模擬過程中抑制了對稱殘基的重原子，分別獲得了1GCG和2FW0的3×20ns軌跡。計算結(jié)果表明，無論是1GCG晶體還是2FW0晶體，GBP幾乎不可能發(fā)生任何骨干運動。這一觀察解釋了為什么在晶體環(huán)境中比在溶液中更容易發(fā)現(xiàn)空配體閉口結(jié)構(gòu)。

如以往許多光譜學(xué)研究中所討論的，晶體堆積可能會影響開度或扭轉(zhuǎn)角，從而使單晶結(jié)構(gòu)難以代表溶液的狀態(tài)。例如有研究表明，麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）的X射線晶體結(jié)構(gòu)和核磁共振β-cyclodxtrin之間就存在開口角度10?的結(jié)構(gòu)差異^[22]。此外，MD模擬揭示的構(gòu)象變化可能比晶體結(jié)構(gòu)中揭示得更為明顯和直接^[23-24]。

3.4? 影響鉸鏈區(qū)域體積的突變體

對于一些PBPs，鉸鏈殘基龐大的側(cè)鏈也會影響蛋白質(zhì)動力學(xué)^[25]。對鉸鏈更?。↙255A、N256A）和鉸鏈更大（G109A/T110S）的突變體進行了控制模擬。隨著鉸區(qū)體積的減小，GBP仍有打開的趨勢。這一結(jié)果表明，鉸鏈殘基側(cè)鏈的粗大程度可能并不是引起開口運動的必要因素。Ortega等曾報道G109A/T110S雙突變體在NMR實驗中誘導(dǎo)GBP構(gòu)象發(fā)生巨大轉(zhuǎn)移。與他們的發(fā)現(xiàn)一致，雙突變體的模擬結(jié)果表明，在鉸鏈區(qū)域有更多的大體積殘基可以產(chǎn)生更大的開口角的構(gòu)象。綜上所述，鉸鏈殘余側(cè)鏈的大小對GBP的域間運動有一定的影響，但不是決定因素。

4? 結(jié) 論

綜上所述，利用分子動力學(xué)模擬和數(shù)據(jù)建模研究了空配體GBP的構(gòu)象動力學(xué)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，場域靜電相互作用在空配體GBP的構(gòu)象動力學(xué)中起著至關(guān)重要的作用。通過馬爾可夫模型（MSMs）分析確定了5種具有不同域方向的亞穩(wěn)態(tài)，它們具有不同的結(jié)構(gòu)域間靜電排斥相互作用。在溶劑中，5種構(gòu)象之間存在快速平衡（平均轉(zhuǎn)化時間小于300 ns）。而鉸鏈區(qū)域作為域間方向的互補調(diào)制器，施加了與蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用相平衡的幾何約束。通過考慮蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用，成功地解釋了一些現(xiàn)有的GBP突變體及其對其結(jié)合親和力的影響。與晶體堆積效應(yīng)有關(guān)的強排斥相互作用也解釋了溶液中X射線晶體結(jié)構(gòu)與核磁共振結(jié)果之間的矛盾。

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收稿日期：2020-06-03

作者簡介：崔兆寧（1987-），男，中級工程師，博士，研究方向：高分子化學(xué)與化工。E-mail： cuizhaoning@cofco.com。

通訊作者：佟毅（1963-），男，正高級工程師，博士，研究方向：玉米深加工。E-mail： tongyi@cofco.com。