參苓白術(shù)散中甘草黃酮和人參皂苷測定及抗氧化實(shí)驗(yàn)

王悅　王婭玲　鄒婧　張昊葳　梁峰源　高世杰

摘????? 要：采用高效液相法測定參苓白術(shù)散中人參皂苷和甘草黃酮的含量，為下一步探究參苓白術(shù)散的體外抗氧化活性研究做準(zhǔn)備。方法：采用HPLC法（反相高效液相法），目的：為測定參苓白術(shù)散中的甘草黃酮、人參皂苷含量，進(jìn)行線性范圍的考察和實(shí)驗(yàn)方法學(xué)研究，同時測定參苓白術(shù)散中人參皂苷對羥自由基的抑制情況。結(jié)果：人參皂苷Rg₁、槲皮素、人參皂苷Re、蘆丁分別在0.625～5.000 μg、0.250～1.000 μg、0.375～3.000 μg、0.250～1.000 μg 內(nèi)對羥自由基的抑制作用顯著;蘆丁的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.295 5 mg·g^-1;人參皂苷Rg₁的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.193 mg·g^-1;槲皮素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.243 9 mg·g^-1;人參皂苷Re的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.074 7 mg·g^-1。參苓白術(shù)散的抗氧化能力經(jīng)驗(yàn)證也較為明顯，人參皂苷對羥自由基的抑制率為79%。

關(guān)? 鍵? 詞：高效液相法;參苓白術(shù)散;甘草黃酮;人參皂苷

中圖分類號：TQ496 ???????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A?? ????文章編號：1671-0460（2020）07-1301-04

Determination of Licorice Flavonoids and Ginseng Saponins

in Shenling Baizhu Powder and Antioxidant Tests

WANG Yue， WANG Ya-ling， ZOU Jing，ZHANG Haowei，LIANG Feng-yuan， GAO Shi-jie

（Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract： The content of ginsenosides and licorice flavonoids in Shenling Baizhu Powder was determined by HPLC， which prepared for the further study of antioxidant activity of Shenling Baizhu Powder in vitro. Objective： to determine the content of liquorice flavonoids and ginsenosides in Shenling Baizhu powder by HPLC （reversed phase high performance liquid chromatography）. Methods： the linear range and experimental methods were investigated， and the inhibition of ginsenosides on hydroxyl free radicals was determined. Results： ginsenoside Rg1， quercetin， ginsenoside Re and rutin had significant inhibitory effects on hydroxyl radical in 0.625～5.000 μg， 0.250～1.000 μg， 0.375～3.000 μg and 0.250～1.000 μg， respectively; the average content of rutin was 0.295 mg·g-1; the average content of Ginsenoside Rg1 was 0.193 mg·g-1; the average content of quercetin was 0.2439 The average content of ginsenoside Re was 0.0747 mg·g-1. The antioxidant capacity of Shenling Baizhu Powder was also tested and proved to be more obvious， the inhibition rate of ginseng saponins to hydroxyl free radicals was 79%.

Key words： High-efficiency liquid phase method; Shenling Baizhu Powder; Licorice flavonoids; Ginseng saponins

參苓白術(shù)散，別名參術(shù)飲，具有補(bǔ)益脾胃的作用，可用于治療食少便溏等癥。高效液相法靈敏度高、出峰快，逐漸用于成分復(fù)雜的中藥成分定性定量中^[1]，本次實(shí)驗(yàn)采用的是反相高效液相法測定參苓白術(shù)散中人參皂苷和甘草黃酮含量，并研究其有效成分對羥自由基的抑制效果。

近年來，探究參苓白術(shù)散方劑中的抗氧化活性成分一直是參苓白術(shù)散研究的熱點(diǎn)，而相關(guān)研究也證明了參苓白術(shù)散方劑中皂苷及黃酮類化合物有較強(qiáng)的抗氧化作用，其含量直接影響了參苓白術(shù)散的抗氧化效果。但其含量測定的相關(guān)研究較少，HPLC法具有準(zhǔn)確性好，靈敏度高的特點(diǎn)，因此我們擬建立一種利用HPLC法同時測定人參皂苷和甘草黃酮含量的方法，為下一步探究參苓白術(shù)散的體外抗氧化活性研究做準(zhǔn)備。

1? 實(shí)驗(yàn)

1.1? 儀器

紫外-可見檢測器;錐形瓶;移液槍;島津SPD-16高效液相色譜儀紫外-可見檢測器;FA1004N電子天平等。

1.2? 藥材與試劑

參苓白術(shù)散粉末;硫酸亞鐵、鐵氰化鉀;人參

皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品、人參皂苷Rg₁標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品均由中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司生產(chǎn);實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈飲用水等。

2? 方法

2.1? 溶液的制備

2.1.1? 對照品溶液的制備

稱取人參皂苷 Rg₁標(biāo)準(zhǔn)品25 mg， 槲皮素對照品10 mg， 人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品15 mg，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 10 mg溶解稀釋，再 定容，配成蘆丁濃度0.2 mg·mL^-1、 人參皂苷Rg₁0.5 mg·mL^-1、槲皮素0.2 mg·mL^-1、 人參皂苷Re0.3 mg·mL^-1 的混合對照品溶液。

2.1.2? 裝柱

精密稱取參苓白術(shù)散15 g，移液槍加入甲醇100 mL，密封，稱定重量，回流3 h，放置至室溫，稱定重量，補(bǔ)足重量，抽濾，移取濾液50 mL，烘干，向剩余部分加5 mL 10%NaOH溶液，加25 mL娃哈哈水，分液漏斗分離4次，合并正丁醇，水洗2次，烘干，向殘?jiān)屑尤脒m量娃哈哈水，通過大孔吸附樹脂柱。洗脫， 蒸干， 通過微孔濾膜濾過。

2.2? 參苓白術(shù)散中人參皂苷與甘草黃酮含量的測定

2.2.1? 色譜條件的確定^[2]

選用MERCK PUROSPHER^?STAR C18色譜柱，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min^-1;以乙腈—質(zhì)量濃度為0.05%磷酸為流動相，每次確保色譜柱柱溫為30 ℃;每次樣品進(jìn)樣量為20? μL。

2.2.2? 參苓白術(shù)散樣品測定

分別精密稱取參苓白術(shù)散樣品5份，進(jìn)樣，出峰后記錄數(shù)據(jù)，分別計(jì)算5份樣品中指標(biāo)成分的平均含量和RSD %。

2.2.3? 線性范圍的考察

分別精密吸取2.1.1項(xiàng)下混合對照品溶液，將溶液稀釋至原來的1/2、1/4、1/6、1/8、1/16倍，按2.1色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4? 實(shí)驗(yàn)精密度、穩(wěn)定性與重復(fù)性的考察^[3]

精密吸取同一待測溶液，在所確定的HPLC條件下進(jìn)樣， 并在出峰后記錄數(shù)據(jù); 再次通過精密吸取同一待測溶液， 分別于2、 4、 8、 16、 24 h 測定;按上述方法，將參苓白術(shù)散待測樣品5份，按如上方法制備，并進(jìn)樣分析，出峰后記錄數(shù)據(jù)。

2.2.5? 參苓白術(shù)散抗氧化實(shí)驗(yàn)

參照袁元實(shí)驗(yàn)方法^[4]，測定羥自由基的抑制率，

按照下列公式計(jì)算參苓白術(shù)散的抗氧化能力。

3? 結(jié)果

3.1? 4種標(biāo)準(zhǔn)曲線

如表1所示，經(jīng)測定，蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線：

Y=161 485x+10 336，R²=0.999 5;

槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線：

Y=74 887x-487.32， R²=0.999 9;

人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線：

Rg₁ Y=354.4x-101.62， R²=0.999 1;

人參皂苷Re? 的標(biāo)準(zhǔn)曲線：

Y=291.37x-89.992， R²=0.998 6 。

上述結(jié)果表明高效液相法測定參苓白術(shù)散中人參皂苷Rg、槲皮素、人參皂苷Re₁、蘆丁的含量過程較為準(zhǔn)確，4種線性方程如圖1、圖2、圖3、圖4所示。

3.2? 高效液相法測定參苓白術(shù)散成分

分析高效液相指紋圖譜可知，參苓白術(shù)散中甘草黃酮、人參皂苷與對照品的重合度為90%以上，進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各組分含量計(jì)算如表2所示。

3.3? 實(shí)驗(yàn)結(jié)果考察

如表3所示，對高效液相法測定參苓白術(shù)散槲皮素、人參皂苷Re、蘆丁、人參皂苷Rg₁方法進(jìn)行考察。

3.4? 參苓白術(shù)散抗氧化結(jié)果

羥自由基為體內(nèi)具有毒性作用的氧化劑^[5]，清除體內(nèi)的羥自由基對遺傳物質(zhì)、多糖等具有一定的保護(hù)作用。由圖5所示，實(shí)線部分為參苓白術(shù)散中的人參皂苷，虛線部分為對照品。人參皂苷對羥自由基的抑制率隨濃度增加而呈上升趨勢，人參皂苷比對照品抗氧化能力更強(qiáng)，參苓白術(shù)散中人參皂苷對羥自由基的抑制率為79 %，對照品為64 %。

4? 結(jié) 論

梁少雄^[6]等通過指紋圖譜確定參苓白術(shù)散中人參皂苷的含量所占比重較大，因此本實(shí)驗(yàn)采用高效液相法測定參苓白術(shù)散中的人參皂苷和甘草黃酮的含量^[7]。目前含量測定多采用吸光度法，通過測定回歸方程計(jì)算含量。高效液相法靈敏度高、檢測準(zhǔn)確、技術(shù)成熟^[8]，不僅可以測定含量，還可以根據(jù)指紋圖譜、峰面積確定成分^[9]。

人參皂苷是參苓白術(shù)散中的有效成分^[10]，分布在人參中，能夠阻止腫瘤分化、調(diào)節(jié)心律失常、延緩衰老^[11]等，在改善記憶力、提高學(xué)習(xí)能力等方面作用顯著^[12];甘草黃酮由甘草提取，能夠改善肺部炎癥、治療結(jié)腸炎^[13]、減少神經(jīng)系統(tǒng)損失^[14]等，臨床應(yīng)用廣泛。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相法測定參苓白術(shù)散中人參皂苷的含量，進(jìn)行線性范圍的考察和實(shí)驗(yàn)方法學(xué)研究和藥理實(shí)驗(yàn)^[15]。人參皂苷Rg₁、蘆丁、槲皮素、人參皂苷Re分別在0.625～5.000、0.250～1.000、0.250～1.000、0.375～3.000 μg范圍內(nèi)顯著;蘆丁的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.295 5 mg·g^-1;人參皂苷Rg₁平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)是0.193? mg·g^-1; 槲皮素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)是0.243 9 mg·g^-1;人參皂苷Re平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)是

0.074 7 mg·g^-1。參苓白術(shù)散的抗氧化能力經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證也較為明顯，人參皂苷對羥自由基的抑制率為79%。本實(shí)驗(yàn)僅測定參苓白術(shù)散中人參皂苷和甘草黃酮的含量，其優(yōu)化提取有待進(jìn)一步研究^[16]。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉艷平，曾慶真.高效液相法在中藥檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2018，18（21）：149-149.

[2]谷民舉，鞠建峰，朱宗敏，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化荊芥穗黃酮類成分的提取工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（08）：29-33.

[3]王雪梅，李艷嬌，宋燕青，等.基于高效液相指紋圖譜檢測參苓白術(shù)散中人參皂苷的含量測定[J].世界中醫(yī)藥，2018，13（11）：2876-287.

[4]馬雯霞.高效液相色譜梯度洗脫法同時測定三七總皂苷中人參皂苷Rb₁、人參皂苷Rg₁和三七皂苷R₁含量[J].中國藥業(yè)， 2014， 23 （16）： 43-44.

[5]王燕新，廖園園，郭曉農(nóng)，等.枇杷葉多糖提取及其體外抗氧化研究[J].西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，40（4）：73-77.

[6]袁元，金河延，于洋，等. 白參、紅參和黑參有效成分和抗氧化活性比較[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2019，41（4）：14-20.

[7]梁少雄.高效液相指紋圖譜檢測參苓白術(shù)散中人參皂苷的含量測定[J].按摩與康復(fù)醫(yī)學(xué)，2019，10（22）：47-48.

[8]張娟娟，孫巍，王萍，等. 基于分析方法質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（AQbD）的復(fù)方丹參滴丸皂苷指紋圖譜開發(fā)方法初步研究[J].中草藥， 2017， 48 （19）： 3992-3997.

[9]張鵬，鄔蘭，李西文，等. 人參飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的評價及應(yīng)用探討[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（7）：2-11.

[10]陳軍輝，謝明勇，王慧琴，等.西洋參中人參皂苷類HPLC測定及其指紋圖譜研究[J].食品科學(xué)，2005，26（11）：200-206.

[11]趙琛，蘇光悅，趙余慶，等.人參皂苷及其衍生物抗結(jié)腸癌作用及機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中草藥，2015，46（16）：2477-2483.

[12]李成鵬，張夢思，劉俊，等.人參皂苷Rg₁延緩腦衰老機(jī)制研究[J].中國中藥雜志，2014，39（22）：4442-4447.

[13]段建輝，祝曉玲，李學(xué)軍，等.神經(jīng)干細(xì)胞衰老基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展[J].國際病理科學(xué)與臨床雜志，2011，31（4）：291.

[14]戴應(yīng)和，龍小琴，張娟，等.甘草黃酮的抗炎作用及其機(jī)制的研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)藥，2017，48（2）：68-71.

[15]劉洋，金玉姬，吳湘軍，等.甘草黃酮的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，35（2）：135-139.

[16]張政，孫志藝，王涵琪，等.高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜法檢測全蝎酶解液中蛋白類成分 （>10 kDa） 的實(shí)驗(yàn)研究[J].當(dāng)代化工， 2019， 48 （6）：1144-1148.

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（項(xiàng)目編號：2016GSF202003）; 山東中醫(yī)藥大學(xué)srt項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：2019046）。

收稿日期：2020-03-13

作者簡介：王悅（1999-），女，山東省德州人，2021年畢業(yè)于山東中醫(yī)藥大學(xué)，研究方向：中藥學(xué)。E-mail：wy6750@qq.com。

通訊作者：高世杰（1977-）， 男， 副教授，博士研究方向： 中藥活性成分分析。E-mail：sys209@ 163.com。