聚酰胺純化膜苞鳶尾中總黃酮的工藝研究

楊陽　張小杰　高文運(yùn)　趙長琦

摘????? 要： 目的 研究聚酰胺柱色譜純化膜苞鳶尾中總黃酮的工藝條件。方法 以膜苞鳶尾中總黃酮的解析率與純度為指標(biāo)，通過考察靜態(tài)、動態(tài)吸附試驗(yàn)，優(yōu)化聚酰胺純化膜苞鳶尾中總黃酮的工藝條件。結(jié)果 聚酰胺對總黃酮有良好的純化效果，其優(yōu)化工藝為：最佳上柱樣品溶液質(zhì)量濃度2.0 mg·mL^-1，pH=3，吸附流速1 BV·h^-1，吸附1.5 h后，70%乙醇洗脫液以1 BV·h^-1速度洗脫?？傸S酮動態(tài)解析率為92.34%，純度45.59%。結(jié)論 聚酰胺對膜苞鳶尾中總黃酮純化性能較高，純度提高了2.9倍。

關(guān)? 鍵? 詞：紫外分光光度法;聚酰胺;膜苞鳶尾;總黃酮;純化工藝

中圖分類號：TQ 041?????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A?????? 文章編號： 1671-0460（2020）07-1281-05

Purification of Total Flavonoids From Iris scariosa by Polyamide Resin

YANG Yang1， ZHANG Xiao-jie1， GAO Wen-yun2， ZHAO Chang-qi3

（1. College of Pharmacy， Xi'an Medical University， Xi'an Shaanxi 710021， China;

2. Northwest University National Micro-detection System Engineering Research Center，

College of Life Science， Northwest University， Xian 710069， China;

3. School of Life Science， Beijing Normal University， Beijing 100875， China）

Abstract： Objective： To optimize the purification method of total flavonoids from Iris scariosa by polyamide resin. Methods： Using the desorption ratio and purity of total flavonoids from Iris scariosa as the indices， the purification of total flavonoids by polyamide resin was optimized with static and dynamic adsorption tests. Result： The optimal adsorption conditions were as follow： the concentration of sample solution was 2.0 mg·mL-1， pH was 3 and the flow velocity of adsorption was 1 BV·h-1， the sample solution was rested for 1.5 h in the chromatographic column of polyamide resin. 70% ethanol was used to elute the total flavonoids at the flow rate of 1 BV·h-1. The dynamic desorption ratio was 92.34% and the purity of total flavonoids was 45.59%. Conclusion： The total flavonoids in Iris scariosa was effectively purified by polyamide resin under the optimal conditions with 2.9 times increase.

Key words： UV spectrophotometry ; Polyamide resin; Iris scariosa; Total flavonoids; Purification process

膜苞鳶尾（Iris scariosaMaxim）是鳶尾科鳶尾屬植物，為新疆中草藥鐮葉馬藺根的藥材基源，具有清熱解毒、祛痰、利咽的功效^[1]。研究證明，鳶尾屬植物中的主要活性成分為鳶尾苷、野鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素等黃酮類成分， 具有抗炎、抗病毒等藥理活性^[2-3]。本課題組首次系統(tǒng)研究了膜苞鳶尾的化學(xué)成分，并對分離得到的化學(xué)成分的抗炎活性進(jìn)行了評價^[4-5]。聚酰胺樹脂主要通過氫鍵和范德華力對黃酮類化合物進(jìn)行吸附，具有方法簡單、成本低、穩(wěn)定性高和容易再生等特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于黃酮類物質(zhì)的純化^[7-10]。

本實(shí)驗(yàn)首次對聚酰胺柱色譜技術(shù)富集膜苞鳶尾總黃酮進(jìn)行了研究，取得較好效果，可為膜苞鳶尾總黃酮的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?試劑與儀器

柱色譜用聚酰胺（30～60目（550～250 μm）、60～100目（250～150 μm）、100～200目（150～75 μm）），浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠;鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)品，批號JZ15020119，HPLC≥98%，南京景竹生物科技有限公司;膜苞鳶尾采自新疆察布查爾錫伯族自治縣，經(jīng)北京師范大學(xué)劉全儒教授鑒定為鳶尾科鳶尾屬植物膜苞鳶尾 （Iris tectoroum Maxim）;無水乙醇、甲醇、NaOH、鹽酸，分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠;蒸餾水，西醫(yī)陽光水站。

BS210S電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;紫外分光光度計(jì)，UV-1780日本島津;DZF-6020型真空干燥箱，上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;KQ5200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取鳶尾苷對照品5 mg，置于10 mL容量瓶中，用70%的乙醇溶解并定容，搖勻。精密量取2 mL置于10 mL容量瓶中，用70%的乙醇定容刻度，作為對照品溶液。精確量取對照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mL，分別移入 10 mL容量瓶中，用70%的乙醇定容，搖勻。在266 nm處測定吸收值，以濃度為橫坐標(biāo)、吸收度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 ?上柱樣品溶液的制備

膜苞鳶尾根及根狀莖1.1 kg，剪碎后于室溫下用甲醇浸泡6次，每次3 d，提取合并第2—6次浸提液，減壓蒸餾得浸膏135.8 g。稱取1.0 g干燥浸膏，加70%乙醇定容于500 mL量瓶中，制成質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL^-1上柱樣品溶液。測得總黃酮的濃度0.32 mg·mL^-1。

1.2.3 ?樹脂的篩選

1.2.3.1? 樹脂的預(yù)處理

聚酰胺30～60目（550～250 μm）、聚酰胺 60～100目（250～150 μm）、聚酰胺 100～200目（150～75 μm），分別先后在95%乙醇和5%的NaOH中浸泡24 h， 水洗至中性后3% HCl浸泡24 h， 再用水洗至中性，50 ℃干燥，密封備用。

1.2.3.2 ?樹脂的靜態(tài)吸附與解吸附性能考察

精確稱取經(jīng)預(yù)處理的干樹脂1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入膜苞鳶尾上柱樣品溶液（浸膏質(zhì)量濃度2.0 mg·mL^-1，總黃酮質(zhì)量濃度0.32 mg·mL^-1）20 mL，充分震蕩12 h，使達(dá)到飽和吸附，過濾，測定不同樹脂吸附后殘留液的吸光度，利用標(biāo)曲計(jì)算殘留液中總黃酮含量。依照下式計(jì)算不同樹脂的總黃酮靜態(tài)吸附量：

吸附量=（上柱樣品溶液總黃酮濃度-吸附后殘余液總黃酮濃度）×溶液體積÷干樹脂量

用水洗去樹脂上殘留的上柱樣品液，然后吸干表面水分，加入20 mL的70%乙醇洗脫，室溫充分震蕩12 h后過濾，測定不同樹脂解吸液的吸光度，計(jì)算其中總黃酮含量，真空干燥后稱量其固體重量。按照下式計(jì)算總黃酮解析率與純度：

解析率=（解吸液總黃酮濃度×解吸液體積）÷吸附量×100%

純度=（解吸液總黃酮濃度×解吸液體積）÷解吸液固體重量×100%

1.2.3.3 ?樹脂的動態(tài)吸附與解吸附性能考察

精確稱重1.0 g經(jīng)預(yù)處理的干樹脂，95%的乙醇浸泡過夜，分別裝入統(tǒng)一規(guī)格的玻璃柱中（1.5 cm×30 cm），用20 BV水替換。加入20 mL膜苞鳶尾上柱樣品溶液（浸膏質(zhì)量濃度2.0 mg·mL^-1，總黃酮質(zhì)量濃度0.32 mg·mL^-1），1 BV/h的速度上柱吸附，測定不同樹脂動態(tài)吸附后殘留液的吸光度，計(jì)算其中總黃酮含量。靜置吸附1 h后，以1 BV·h^-1速度，加入20 mL水，洗去樣品液的殘留，然后加入70%乙醇洗脫液20 mL（4 BV），以1 BV·h^-1速度洗脫。收集不同樹脂洗脫液，測定不同樹脂解吸液的吸光度，計(jì)算其中總黃酮含量，真空干燥后稱量解析液固體重量。

1.2.4 ?聚酰胺分離純化膜苞鳶尾中總黃酮的工藝參數(shù)考察

1.2.4.1 ?上樣液濃度的影響

分別精確稱取不同質(zhì)量的膜苞鳶尾浸膏1.0、1.5、2.0、3.0 g，70%乙醇溶解于500 mL量瓶中，超聲30 min并定容至刻度，按照“1.2.3.3”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算不同濃度的膜苞鳶尾浸膏樣品溶液在聚酰胺柱色譜上解析率和純度。

1.2.4.2 ?泄露曲線的繪制

將膜苞鳶尾浸膏質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL^-1（總黃酮濃度0.32 mg·mL^-1）的上柱樣品溶液按照“1.2.3.3”項(xiàng)下上柱方法操作，每10 mL一個流份，上柱110 mL，測定各個流份的吸光度，計(jì)算每個流份中總黃酮含量。

1.2.4.3 ?上柱樣品溶液pH值的考察

將膜苞鳶尾浸膏質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL^-1（總黃酮質(zhì)量濃度0.32 mg·mL^-1）且pH值分別為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0的上柱樣品溶液各20 mL按照“1.2.3.3”項(xiàng)下方法操作，收集不同pH值的洗脫液，測定吸光度，計(jì)算不同pH值的膜苞鳶尾在聚酰胺柱色譜上吸附量和解析率。

1.2.4.4 ?吸附時間

將膜苞鳶尾浸膏質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL^-1（總黃酮質(zhì)量濃度0.32 mg·mL^-1） 且pH值為3.0的上柱樣品溶液20 mL按照“1.2.3.3”項(xiàng)下的方法，分別靜置吸附0、0.5、1、1.5、2 h，收集不同吸附時間的解吸液，測定吸光度。

1.2.4.5 ?吸附速度

將膜苞鳶尾浸膏質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL^-1（總黃酮質(zhì)量濃度0.32 mg·mL^-1） 且pH值為3.0的上柱樣品溶液20 mL按照“1.2.3.3”項(xiàng)下的方法，分別控制吸附速度為1、2、4 BV·h^-1，靜置1.5 h后，收集解吸液，測定吸光度。

1.2.4.6 ?洗脫劑濃度的影響

將膜苞鳶尾浸膏質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL^-1（總黃酮濃度0.32 mg·mL^-1）且pH值為3.0的上柱樣品溶液20 mL按照“1.2.3.3”項(xiàng)下上柱方法操作，靜置1.5 h后，分別用10%、20%、30%、50%、70%、95%乙醇等度或梯度洗脫，測定各解吸液的吸光度。

1.2.4.7 ?洗脫劑用量考察

將20 mL pH值為3.0上樣液（膜苞鳶尾浸膏質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL^-1），按照“1.2.3.3”項(xiàng)下方法操作，靜置1.5 h之后以80 mL的70%乙醇洗脫，每10 mL一個流份，收集8個流份，測定吸光度，計(jì)算每個流份中總黃酮含量。

1.2.4.8 ?驗(yàn)證試驗(yàn)

將膜苞鳶尾浸膏質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL^-1且pH值為3.0的上柱樣品溶液20 mL按照“1.2.3.3”項(xiàng)下上柱方法操作，按照1 BV·h^-1速度吸附，靜置吸附1.5 h后，按照1 BV·h^-1的速度用20 mL 的70%乙醇洗脫，收集洗脫液，測定吸光度，平行試驗(yàn)3次，計(jì)算解吸液中總黃酮含量。

2? 結(jié)果與分析

2.1 ?鳶尾苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

測定得到回歸方程y=72.82x+0.002（x為鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度，mg·mL^-1;y為吸光度值A(chǔ)），相關(guān)系數(shù)r=0.999 5。結(jié)果表明，鳶尾苷對照品在0.001 08～0.010 8 mg·mL^-1呈良好的線性關(guān)系。

2.2? 樹脂的篩選

對3種型號樹脂的靜態(tài)和動態(tài)吸附與解吸附性能考察結(jié)果表明，吸附量與純度最高的都是聚酰胺100～200目（150～75 μm），因此選擇聚酰胺100～200目（150～75 μm）樹脂進(jìn)一步分離純化總黃酮，結(jié)果見表1和表2。

2.3? 聚酰胺分離純化膜苞鳶尾中總黃酮的工藝參數(shù)考察

2.3.1 ?上樣液濃度的影響

由表3可知，上樣液中膜苞鳶尾浸膏質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL^-1時，總黃酮的解析率與純度最高，因此可作為最適的上樣液濃度。

2.3.2 ?泄露曲線的繪制

從圖1可以看出，上樣液中浸膏質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL^-1時，體積40 mL時泄露開始。

2.3.3 ?上柱樣品溶液pH值的考察

由表4可知，從解析率考慮上柱樣品溶液的最佳pH值為3.0。

2.3.4 ?吸附時間

由表5可知，從純度與解析率考慮最佳吸附時間為1.5 h。

2.3.5? 吸附速度

由表6可知，從吸附量與解析率考慮，選擇最佳吸附速度為1 BV·h^-1。

2.3.6 ?洗脫劑濃度的影響

由圖2、圖3可知，解析液的總黃酮純度在70%乙醇濃度洗脫時達(dá)到最高，因此選用70%乙醇洗脫液進(jìn)行洗脫。

2.3.7 ?洗脫劑用量考察

由圖4可知，第一個10 mL（2 BV）的流份中，總黃酮含量最高。20 mL（4 BV）洗脫劑基本可洗脫完全，因此洗脫劑選用20 mL（4 BV）70%乙醇進(jìn)行洗脫。

2.3.8 ?驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

純化前總黃酮純度為15.81%，經(jīng)聚酰胺純化后總黃酮純度為45.59%，富集作用明顯。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。

3 ?結(jié) 論

本試驗(yàn)嘗試使用聚酰胺純化膜苞鳶尾中總黃酮，經(jīng)聚酰胺處理后總黃酮純度達(dá)到43.35%以上，比原浸膏總黃酮純度15.81%提高2.9倍左右，表明聚酰胺對膜苞鳶尾中總黃酮具有特異性吸附和解吸附性能，富集效果好，總黃酮純度明顯提高，可作為膜苞鳶尾總黃酮分離純化的有效手段^[11，12]，可為膜苞鳶尾總黃酮的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

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基金項(xiàng)目：十二五“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（項(xiàng)目編號：2013ZX09103001-019-001）;西安醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：2018DC-74）。

收稿日期：2020-03-31

作者簡介：楊陽（1986-），女，陜西省西安市人，講師，碩士，2013年畢業(yè)于北京師范大學(xué)植物化學(xué)專業(yè)，研究方向：天然藥物化學(xué)。

E-mail：57060657@qq.com。